O agrupamento de receptores é onipresente e muitas vezes necessário para a sinalização de uma ativação em cascata. No entanto, poucos métodos estão disponíveis para medir o grau de agrupamento. Usamos fluorescência de reflexão interna total, microscopia DE TIRF, para acompanhar a difusão de moléculas FGFR1-mEGFP na membrana plasmática das células vivas.
Em seguida, aplicamos brilho numérico, a análise de N&B, para descrever a dinâmica do agrupamento estimulado do receptor. O TIRF é ideal para imagens temporais rápidas de eventos moleculares que ocorrem perto da superfície celular, enquanto n&B determina o estado oligomerico médio de moléculas fluorescentes com base em onde a difusão entra e sai do volume de iluminação do microscópio. Na verdade, esta é uma ferramenta para conectar a organização temporal espacial dos receptores na superfície celular onde eles estão sinalizando.
A N&B só precisa do acesso a um microscópio com um módulo de aquisição rápida. Você pode analisar grandes áreas de células vivas tendo apenas o conhecimento básico dos métodos de flutuação da fluorescência. Este método pode ser aplicado a proteínas que formam dimers ou clusters e podem ser rotulados estequiometricamente com o corante fluorescente.
Se as proteínas estiverem em compartimentos intracelulares, outros tipos de microscópios são usados para a aquisição das imagens. É importante preparar uma construção que expresse a forma monomérica do fluoróforo para medir em condições experimentais o brilho monomérico puro como controle. No primeiro dia, as células HeLa sementes em 1,5 mililitros de meio completo a uma concentração de 100.000 a 200.000 células por mililitro em pratos de fundo de vidro.
Sementes de seis a oito replicam pratos, e incubam em uma incubadora a 37 graus Celsius. No segundo ou terceiro dia, as células atingiram a subconfluência. Adicione meio sem soro com plasmídeo de proteína a metade dos pratos, e adicione plasmídeos de referência com o monômero e mais escuro à segunda metade dos pratos para transfetar as células.
Depois de um dia, verifique se as células transfeinadas são aderentes ao fundo dos pratos e a membrana celular é fluorescente. Descarte pratos com células crescidas ou com fluorescência muito baixa. Quatro horas antes do experimento, ative a incubadora de temperatura do microscópio a 37 graus Celsius.
Ligue o microscópio, computadores e câmeras, e espere que as câmeras atinjam a temperatura de trabalho adequada de menos 75 graus Celsius. Coloque uma pequena gota de óleo na lente objetiva. Coloque um prato de amostra na incubadora do microscópio, e feche as portas da incubadora para deixar a temperatura do prato equilibrar por 10 minutos.
Ligue a lâmpada de epifluorescência e o laser de 488 nanômetros. Selecione o modo de contraste de epifluorescência para explorar a amostra, procurando uma célula para se concentrar a partir da lente ocular. Selecione o filtro adequado para coletar a emissão verde através da câmera de microscópio com bandpass Ex 490/20 500 e bandpass Em 525/50 ou similar.
Mude do ocular para o relatório da câmera no modo de epifluorescência. Refine o foco e mude para o modo TIRF. Em seguida, ative o alinhamento automático seguindo as instruções do microscópio TIRF.
Escolha uma profundidade de iluminação adequada e otimize a direção do campo evanescente. Mude para uma segunda câmera. Defina uma região de interesse de pelo menos 256 por 256 pixels.
Ajuste a exposição a um milissegundo e o ganho em EM para 1.000. Ajuste a potência do laser para 0,5 miliwatts. É necessário ter algumas informações sobre o coeficiente de difusão da proteína, pois o tempo de exposição deve ser menor do que o tempo médio gasto pelas moléculas fluorescentes no volume luminado.
Execute uma primeira sequência de ensaios em condições iniciais, e aproximadamente estime o valor de sinal para ruído. As condições são aceitáveis em sinal-a-ruído igual a dois a três ou mais, conforme medido na primeira série. Em seguida, use o controle deslizante do sistema de divisão de emissões conectando a câmera número dois ao microscópio para mascarar um lado da imagem.
Selecione a opção de salvamento automático do arquivo da câmera. Inicie a aquisição da série de imagens por um mínimo de 700 quadros a uma relação sinal-ruído mínima de dois. Sem tirar o prato do microscópio, adicione o ligante.
Selecione uma célula com uma membrana de fluorescência brilhante e inicie rapidamente a primeira série da corrida cinética. Procure uma segunda célula, e adquira o segundo ponto de tempo da cinética. Capture uma nova célula para cada ponto de tempo da corrida cinética.
Para cada novo prato, repita o alinhamento da linha laser e a otimização da iluminação TIRF. Agora converta e salve os arquivos de imagem adquiridos com o software da câmera como arquivos tif. Importe arquivos tif na rotina do software de análise ativando o usuário gráfico de N&B interfase MATLAB.
Série de descarte para a qual o perfil médio de intensidade mostra mais de 10% fotobleaching e séries em que houve uma evidente distorção ou tradução da membrana celular durante a aquisição. Quadros de corte que estão evidentemente fora de foco. Mantenha para a análise apenas séries com pelo menos 500 prazos.
Primeiro determine os parâmetros da câmera. Ative a câmera de calibração de rotina. Selecione uma área de pelo menos 20 por 50 pixels na região de ruído do detector.
Na frequência de log versus gráfico de nível digital, mova o cursor vermelho linear para delimitar o gaussiano na parte linear da curva. Ative a tecla B. Aplique um binning mínimo de 2,2 para reduzir a dispersão dos dados e gerar o histograma B-I.
Use o cursor quadrado iterativo para inspecionar o histograma B-I. Selecione um ROI quadrado para a análise e gere o mapa B do ROI selecionado. Em seguida, salve o arquivo ASCII dos valores B associados à seleção.
Importe o ASCII em um software gráfico para calcular a distribuição de frequência dos dados e obter o valor B médio mais ou menos S.E.Aplique a equação epsilon para derivar o brilho médio de cada célula em cada ponto de tempo da corrida cinética. Normalize os dados de acordo com a equação de normalização, onde B't é o valor B médio medido no momento t após a adição de ligante e B'0 é o valor B médio medido no momento em que t é igual a zero, que é de 10 a 20 segundos após ligante additino. Plote o brilho médio normalizado versus o tempo de aquisição para construir a corrida cinética.
Neste estudo, resultados representativos de duas células HeLa no mesmo prato expressando mEGFP-FGR1 capturado no tempo zero e sete, após a adição de 20 nanogramas por mililitro de FGF2, são mostrados aqui. Em comparação com os construtos de referência, GPI-mEGFP e dimer GPI-mEGFP-mEGFP, toda a sequência de análise mostra a intensidade média da série temporal. Enredo de todos os valores B.
B-I histograma. Mapa B do ROI escolhido. E o histograma de distribuição B associado.
Após a estimulação com 20 nanogramas por mililitro de FGF2, as corridas cinéticas representativas mostrando o brilho médio em função do tempo descrevem o lento processo de dimerização que persiste por vários minutos na superfície celular. Quando estimulado com 50 microgramas por mililitro de NCAM-Fc, o perfil cinético revela transições rápidas e cíclicas do receptor em misturas oligomeméricas, que também atinge valores de brilho acima do mais fraco. Um valor médio normalizado de três é repetidamente observado.
É importante minimizar as variantes extras devido a não flutuações moleculares e branqueamento. E as células devem ser bem aderidas ao prato de fundo de vidro, não sobre-crescido, e não empilhados. Se estivermos interessados em uma proteína que difunde mais rápido dentro de compartimentos intracelulares, podemos aplicar zero vezes mais rápido e usar a varredura em microscópios focais ou multifotons para imagem dentro da célula.
Com nossa abordagem, minimizamos os efeitos prejudiciais do fotobleaching quando queremos explorar a dinâmica de eventos como a dimerização. Esses eventos controlam uma variedade de respostas celulares e são muito difíceis de provar em células vivas com outras técnicas.
