Este trabalho foi financiado pelo Wellcome número conceder confiança [077108] atribuído ao GJW.

1. Compilando uma biblioteca de Bait and Prey expressão plasmídeo Vetores <ol><li> Compilar uma lista de receptores de superfície celular e proteínas secretadas de interesse a serem selecionados para interações e recuperar suas seqüências a partir de um banco de dados adequado de proteína de seqüência. A maioria das proteínas contendo um N-terminal péptido de sinal secretor são adequados (estes incluem o tipo I, IGP-ligados e secretada proteínas). Tipicamente, uma família de proteínas (por exemplo, superfamília das imunoglobulinas ou de todos os receptores restringidas a um tipo de célula específico, tal como o de eritrócitos) seriam seleccionadas. </li><li> Determinar a extensão das regiões extracelulares através da identificação da localização do péptido de sinal ea região transmembranar da proteína usando o software de predição característica. Normalmente usamos v3.0 SignalP 5 e 6 TMHMM v2.0. </li><li> Design conjuntos de iniciadores que amplificam o fragmento ectodomínio inteira para cada receptor. Nós temos um conjunto de vectores de isca e presas que são adequados para este propósito, que são umavailable de Addgene ( <a href="http://www.addgene.org/">http://www.addgene.org/~~V</a> ). Conceber o iniciador de sentido em torno do início da metionina para incluir um sítio de enzima de restrição Notl e uma sequência de Kozak óptima, isto é seguido por 25 pares de bases de correspondência exacta do gene específico de sequência (Fig. 2A). </li><li> Conceber o iniciador anti-sentido para truncar proteínas receptor tipo I imediatamente antes da região transmembranar prevista, de modo a expressar o ectodomínio inteiro como uma proteína solúvel recombinante. Incluir um sítio de restrição Asei neste iniciador que deve então traduzir em quadro para um rato C-terminal da proteína Cd4d3 tag 4 7 (Fig. 2A). </li><li> Amplificar os fragmentos ectodomínio de todos os genes usando estes primers e cloná-los na isca ou vetor presa. Às vezes acham que é útil para a primeira cloná-los em vetores de ônibus antes de subclonagem em um vetor de expressão apropriada dos mamíferos, nós usamos um derivado do vetor pTT3 3,4. Tanto a isca e vetores presas contain C-terminal da proteína etiquetas como se segue (Fig. 2B). <ol><li> Iscas: Uma etiqueta contendo os domínios 3 e 4 das células CD4 de rato (Cd4d3 4) da proteína seguido por uma sequência peptídica que é um substrato para a enzima BirA E.coli e pode, portanto, ser monobiotinylated sobre um resíduo específico da lisina (Fig. 2B) . O Cd4d3 4 etiqueta é reconhecido pelo anticorpo monoclonal OX68 e é utilizado para quantificar a expressão das proteínas de isco por ELISA. As proteínas de isca são, portanto, monomérica e monobiotinylated. Vectores de isco de proteína adicionais onde o péptido biotinylatable é substituída por uma etiqueta de 6-o seu para a purificação estão disponíveis. </li><li> Presas: As presas também conter um rato Cd4d3 4 tag seguido por uma sequência peptídica a partir do rato de proteína oligomérica matriz da cartilagem (COMP) e um C-terminal da enzima β-lactamase. O péptido COMP assegura formas os pentâmeros presas uma vez expressa (Fig. 2B). </li></ol></li></ol> 2. Prey e Expressão da proteína-Bait Usamosum sistema de expressão de alto nível conveniente usando cultura de suspensão da linha de células HEK293E 4 para produzir bibliotecas de nossa proteína, mas qualquer sistema de expressão de mamífero deve ser apropriada. Uma alternativa comercialmente disponível é o sistema de Freestyle. As células são rotineiramente cultivadas em uma plataforma de agitação (125 rpm) a 37 ° C, 5% de CO2 a 70% de humidade relativa. Proteínas de controle positivos e negativos devem ser expressas. O rato Cd4d3 4 tag fragmento somente está disponível como isca e presa e são adequados controles negativos. Da mesma forma, isca presa e vetores que codificam um controlo positivo estão disponíveis (Addgene); que normalmente usam o rato Cd200-Cd200R interação 8. <ol><li> Semente as células HEK293E o dia antes da transfecção, a uma densidade de 2,5 x 10 5 células mL -1. Nós cultura rotineiramente as células em volumes de 50 mL em meios Freestyle293 seguindo as recomendações do fabricante. Para garantir biotinilação eficiente, complemento tele meio de cultura de células usadas para produzir proteínas de isca com D-biotina até uma concentração final de 100 uM. Meio utilizado para expressar as proteínas de presa não necessita de ser complementada com adicional D-biotina. </li><li> No dia seguinte, as células transfectar usando um reagente de transfecções adequado (por exemplo, 293fectin). Use 25 ug do isco ou presas construções de plasmídeo para transfectar uma cultura de 50 mL. Para produzir os iscos biotinilados, co-transfectar codificação do plasmídeo a isca construir com um plasmídeo que codifica uma forma segregada da proteína-biotina ligase E.coli ( BirA), que está disponível a partir Addgene. Co-transfecção de plasmídeos isca em uma razão de 10:1 (2,5 ug) do plasmídeo que codifica a proteína secretada BirA. </li><li> Culturas de colheita cinco dias após a transfecção por primeira granulação as células por centrifugação a 3000 X g durante 20 minutos, seguido por filtração do sobrenadante através de um filtro de 0,22 uM. </li></ol> [Dica: Bait e proteína presas deve ser armazenado diluído a 4 ° C e como uma diretriz geral deve ser usado dentro de um ano. Adicionar bacteriostáticos, tais como 50 ug / mL polimixina B sulfato ou 10 mM de NaN3 para evitar a contaminação bacteriana dos sobrenadantes.] 3. A normalização do Isca e amostras rapina Uma das características essenciais do ensaio AVEXIS é que, porque as proteínas recombinantes são secretadas podem ser diluído ou concentrado (normalizado) para dentro de actividades de limiar estabelecido antes de serem utilizados no ensaio. Verificou-se que os níveis em que as proteínas recombinantes são expressos abrangem uma grande variedade - até 4 ordens de magnitude - e assim o passo de normalização reduz significativamente o número de falsos positivos durante as telas. 3,1 normalização Bait Nota: não conjugada D-biotina deve ser removido a partir do suporte (tipicamente por diálise) uma vez que irá competir com a bai biotiniladot proteína para a ligação a estreptavidina sítios de ligação. <ol><li> Transferir sobrenadantes de isca em rótulo de diálise, tubos, cortar de forma segura e diálise extensivamente contra um tampão adequado, tal como PBS para remover a biotina livre. </li></ol> [Tip: Nós descobrimos que a diálise suficiente é normalmente conseguido por 6 x 50 mL sobrenadantes de isca contra um volume de 4,5 L de PBS com 4 mudanças ao longo de um período de 24 horas. Diálise insuficiente pode ser observada por um inibição da ligação da proteína em diluições baixas durante o passo de normalização isca (Fig. 3A). <ol start="2"><li> Executar um ELISA para determinar os níveis relativos em que as proteínas de isca são expressos. Prepara-se uma série de diluições das proteínas biotiniladas isca e capturá-los em uma placa de microtitulação de estreptavidina-revestido. Use o rato Cd4d3 4 tag para detectar e quantificar as proteínas de isco capturadas utilizando um anticorpo monoclonal (OX68). Concentrar ou diluir proteínas isca para o valor mínimo necessário para saturar toda a biotem sítios de ligação no poço de uma placa de estreptavidina-revestido. </li><li> Bloquear os poços de uma placa de estreptavidina-revestida com tampão fosfato saline/0.1% de Tween-20 (PBST) / 2% de albumina sérica bovina (BSA) durante 15 minutos. </li><li> Numa placa separada, fazer uma série de diluição (quatro diluições 1:3 são normalmente suficientes) das proteínas isca em PBST BSA / 2% e transferência para poços de uma placa de estreptavidina-revestido. Incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Lavar 3x em PBST. Adicionar 100 uL de 2 ug / mL de ratinho anti-rato IgG Cd4d3 4 incubar (OX68) durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Lavar 3x em PBST. Adicionar 100 uL de rato anti-fosfatase alcalina a 1:5.000 de diluição em PBST / BSA a 2% e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Lavar 3x em PBST e realizar uma lavagem final em PBS para remover qualquer resíduo de detergente. Adicionar 100 uL de 1 mg / mL de substrato em 104 dietanolamina tampão (dietanolamina a 10% (v / v), 0,5 mM de MgCl2, 10 mM de NaN3, pH9.8, armazenada ao abrigo da luz a 4° C). </li><li> Após uma hora, a absorvância medida a 405 nm. Os resultados representativos de normalização de isca são mostrados na Figura 3A. </li><li> Proteínas de isco que são expressas em níveis que são suficientes para saturar todos os sítios de ligação de biotina de uma placa de estreptavidina-revestidos, quando usado sem diluição, deve ser concentrada utilizando concentradores Vivaspin (Vivascience, 10kDa MWCO). Como guia, estima-se que ~ ug 5 de uma proteína isco típico (~ 80 kDa) é suficiente para saturar uma placa de 96 poços. <ol><li> Proteínas de isco expressas em níveis elevados podem ser diluídos em PBST BSA / 2% a uma concentração suficiente para saturar a placa de estreptavidina-revestido. A actividade dos iscos deve ser reverificados após diluição ou concentração para garantir que eles saturar todos os sítios de ligação de biotina na placa de estreptavidina-revestido. </li></ol></li></ol> 3,2 normalização Prey <ol><li> Quantificar os níveis relativos em que as proteínas alimentares são expressas utilizando o β-lactamaseatividade enzimática. </li><li> Em primeiro lugar, fazer uma série de diluições do sobrenadante contendo as proteínas de presa em PBST / 2% de tampão de BSA. Em seguida, adicionar 20 uL das diluições a 60 uL de uma 242 iM (0,125 mg / mL) de solução nitrocefina (Calbiochem). </li><li> Imediatamente transferir a placa para um leitor de placas de microtitulação que leva uma medição da absorvância a 485 nm, a cada minuto durante 20 minutos à temperatura ambiente. Os resultados representativos de normalização presas são mostrados na Figura 3B. </li><li> Concentre-se amostras utilizando concentradores centrífugos ou diluí-los em BSA PBST / 2% para chegar a um limiar de atividade de ~ nmol min 2 -1 volume de negócios de nitrocefin. Praticamente, isto é alcançado se tudo o nitrocefina é hidrolisado no interior ~ 7 minutos. </li></ol> 4. AVEXIS Procedimento de Triagem <ol><li> Lavar uma placa de estreptavidina-revestido em PBST. </li><li> Adicionar 100 uL de BSA PBST / 2% a cada poço e incubar durante 30 minutos para bloquear quaisquer locais de ligação de proteína espúrias dentro de cada poço. </li&gt; </ol> [Dica: para remover qualquer tampão de lavagem residual após as etapas de lavagem, a placa é aproveitado - energicamente - em toalhas de papel] <ol start="3"><li> Remover a solução de bloqueio com um movimento inteligente da placa ao longo de um dissipador e adicionar 100 uL de isca biotinilado normalizada monomérica aos poços apropriados e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Remover as amostras de isco a partir da placa, por viradas para cima, a placa e inteligentemente flicking sobre uma pia, e lavar 3 vezes em PBST. </li><li> Adicionar 100 uL da presa pentamerized normalizada construir a cada poço e incubar à temperatura ambiente durante 1 hora, lavar como no passo 4,4 e realizar uma lavagem final com apenas PBS. </li><li> Adicionar 60 ul de 242 mM solução nitrocefina (dissolver 5 mg de nitrocefina em 500 uL de DMSO, misturar bem e em seguida diluir o nitrocefina em 40 mL de PBS e passar através de um filtro de 0,22 um antes da adição às placas) e incubar à temperatura ambiente . Interacções positivas pode ser observadopelo olho uma vez que o nitrocefina amarelo é hidrolisado para uma cor vermelha. Quantificar por leitura da absorvância a 485 nm usando um leitor de placas. Uma placa de típico e quantificação é mostrado na fig. 4. </li></ol> [Tip: interacções positivas são geralmente observadas no prazo de 2 horas à temperatura ambiente, embora as chapas devem ser colocadas a 4 ° C durante 16 horas para garantir que todos os potenciais interacções são detectados. Descobrimos também que nitrocefina precipitado e imperfeições no plástico da placa de microtitulação tais como riscos / impressões digitais podem ocasionalmente levar a artefatuais falsos positivos a 485 nm, apesar de não hidrólise nitrocefina evidente. Portanto, é aconselhável para tirar fotos das placas para registrar visualmente volume de negócios nitrocefin nos poços.] 5. Os resultados representativos Um exemplo representativo de uma placa de rastreio AVEXIS é mostrado na Figura 4. Deve-se observar hidrólise (amarelo para vermelho) do substrato nitrocefina nocontrolo positivo poços (tanto o mediada por anticorpo de controlo de captura de presas e também a interacção de controlo positivo) dentro de cerca de 10 minutos. Algumas interações dentro da tela também são observados dentro dessa escala de tempo, mas outros podem demorar mais tempo (algumas horas) para aparecer. Tipicamente, uma taxa de sucesso de cerca de 0,4-0,6% (uma interacção positiva para cada 150-250 interacções a ser rastreados) é típica, dependendo das bibliotecas de proteína a ser rastreados. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig1.jpg" /> Figura 1. Identificação de interacções receptor-ligando que medeiam os processos de reconhecimento celular usando AVEXIS. O esquema mostra duas células interagindo (A e B) troca de informações através das interações realizadas entre as proteínas de membrana incorporadas receptores. AVEXIS é um ensaio de interacção proteína escalável especificamente concebidos para identificar novos pares receptor-ligando que são caracterizadas por forças de interacção muito fracas. Recombinante parabibliotecas de proteínas luble representando o ectodomínio totalidade do repertório de receptor na superfície celular de ambas as células são compilados quer como pentamérica presas β-lactamase marcados (tipo de célula A) ou monoméricos iscos marcado com biotina (para B tipo de célula). O pentamerisation das presas aumenta a concentração local de ectodomínios para efectuar um ganho de avidez geral de modo que as interacções mesmo muito transientes podem ser detectadas. A biblioteca isca é vestida em estreptavidina placas revestidas e sistematicamente sondado para interacções com as proteínas presas. Depois de uma lavagem breve, quaisquer presas capturadas são detectados utilizando a actividade β-lactamase associado com a presa. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig2.jpg" /> Figura 2. Bait e design construção presa. (A) A proteína do receptor de rato Cd200 é fornecido como um exemplo de como os ectodomínios inteiras de proteínas de células de receptor de superfície são determinados e os iniciadores são concebidos para tornar tanto iscae expressão construções presas. A sequência da proteína traduzida de cDNA e são mostrados a partir do péptido de sinal N-terminal para a membrana-medindo região transmembranar de rato Cd200. Um iniciador de sentido é concebido de modo a incluir um 5 &#39;Notl sítio de enzima de restrição ea sequência de Kozak óptima seguido por 25 bases da sequência correspondência exacta para a sequência de cDNA Cd200. O iniciador anti-sentido contém um local de Asei e 25 bases da sequência correspondência exacta localizado imediatamente a montante do resíduo seleccionado ectodomínio truncamento. Para manter o ectodomínio no quadro com o rato Cd4d3 4 tag, o local de Asei deve traduzir como Gly-Ala-Pro. (B) representações esquemáticas da isca e construções de expressão presas. Cada um contém ectodomínios receptores ladeado por Notl e sites de ascos e uma etiqueta de 4 Cd4d3. Os iscos conter uma sequência de peptídeo C-terminal que pode ser especificamente monobiotinylated por cotransfecção com um plasmídeo expressando um secretada enzima BirA. As presas são seguidos pela seqüência pentamerisationa partir da proteína da matriz da cartilagem oligomérico (COMP) ea enzima β-lactamase. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig3.jpg" /> Figura 3. Normalização da isca e proteínas presas. (A) exemplos representativos de normalização isca. Uma série de diluições de quatro diferentes sobrenadantes de isco dialisados ​​foram detectados por ELISA utilizando um anticorpo anti-CD4 tag monoclonal. Os quatro iscas são expressos em diferentes níveis 1&gt; 2&gt; 3&gt; 4. Iscos devem ser normalizados para um nível de limiar que satura os locais de ligação de biotina em cada poço. Iscos altamente expressos podem ser diluídas para conservar a proteína (por exemplo, um isco pode ser diluído ~ 1:100), e iscos mal-expressas concentrou-se. Leituras diminuíram em diluições de baixo custo são, por vezes, observada em alguns iscos (por exemplo, a isca 2) que é atribuível à presença de D-biotina não conjugada devido à diálise incompleta. (B) Os níveis em que atacam as proteínas são expressionado é quantificado utilizando a taxa de hidrólise de um substrato β-lactamase, nitrocefina. No exemplo mostrado, os três presas são expressos em níveis diferentes: 1 presa&gt; 2&gt; 3. Presas devem ser normalizados para uma actividade de ~ 2 nmol min -1, o que corresponde a completar a hidrólise de 14,5 nmol nitrocefina em ~ 7 minutos (por exemplo, presa 1). As presas outros neste exemplo deve ser concentrado antes da utilização na triagem. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig4.jpg" /> Figura 4. Triagem representativas resultados AVEXIS. (A) Uma fotografia de uma placa representativa triagem AVEXIS. A proteína está presa sondado contra 41 iscas diferentes e uma interação positiva é detectada em E2 também. Controlos utilizados nas placas de rastreio incluem: um anticorpo anti-CD4 biotinilado para capturar toda a proteína a presa adicionado ao poço (G6), uma interacção de controlo: rato Cd200 (isco)-Cd200R (presas) com o Cd200R presas utilizadas na diluição limite (H3), 1:10 (H4) e 1:100 (H5). Controles negativos foram: a Cd4d3 4 isca sondado com a proteína presa sendo exibido (H1) ea presa Cd200R (H2). (B) Quantificação dos valores de absorvância de a mesma tela realizada em triplicado. Os pontos de dados são a média ± DP.

<ol>
	<li>Fagerberg, L., Jonasson, K., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+the+human+membrane+proteome.">Prediction of the human membrane proteome.</a> Proteomics. 10, 1141-1141 (2010).</li><li>Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+initiation+in+biological+systems:+the+properties+and+detection+of+transient+extracellular+protein+interactions.">Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions.</a> Molecular bioSystems. 5, 1405-1405 (2009).</li><li>Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screening+for+novel+low-affinity+extracellular+protein+interactions.">Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions.</a> Genome research. 18, 622-622 (2008).</li><li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells.">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic acids research. 30, e9-e9 (2002).</li><li>Bendtsen, J. D., Nielsen, H., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Prediction+of+Signal+Peptides:+SignalP+3.0.">Improved Prediction of Signal Peptides: SignalP 3.0.</a> Journal of molecular biology. 340, 783-783 (2004).</li><li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+markov+model:+application+to+complete+genomes.">Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes.</a> Journal of molecular biology. 305, 567-567 (2001).</li><li>Brown, M. H., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+immunoglobulin+and+scavenger+receptor+superfamily+domains+as+chimeric+proteins+with+domains+3+and+4+of+CD4+for+ligand+analysis.">Expression of immunoglobulin and scavenger receptor superfamily domains as chimeric proteins with domains 3 and 4 of CD4 for ligand analysis.</a> Protein engineering. 7, 515-515 (1994).</li><li>Wright, G. J., Puklavec, M. J., Willis, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid/neuronal+cell+surface+OX2+glycoprotein+recognizes+a+novel+receptor+on+macrophages+implicated+in+the+control+of+their+function.">Lymphoid/neuronal cell surface OX2 glycoprotein recognizes a novel receptor on macrophages implicated in the control of their function.</a> Immunity. 13, 233-23 (2000).</li><li>Dustin, M. L., Golan, D. E., Zhu, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+affinity+interaction+of+human+or+rat+T+cell+adhesion+molecule+CD2+with+its+ligand+aligns+adhering+membranes+to+achieve+high+physiological+affinity.">Low affinity interaction of human or rat T cell adhesion molecule CD2 with its ligand aligns adhering membranes to achieve high physiological affinity.</a> The Journal of biological chemistry. 272, (1997).</li><li>Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+identification+of+transient+extracellular+protein+interactions.">High-throughput identification of transient extracellular protein interactions.</a> Biochemical Society transactions. 38, (2010).</li><li>de Wildt, R. M., Tomlinson, I. M., Ong, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+receptor-ligand+pairs+by+capture+of+long-lived+multivalent+interaction+complexes.">Isolation of receptor-ligand pairs by capture of long-lived multivalent interaction complexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, (2002).</li><li>Jiang, L., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+leucocyte+surface+protein+interactions+by+high-throughput+screening+with+multivalent+reagents.">Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents.</a> Immunology. 129, 55-55 (2010).</li><li>Urech, D. M., Lichtlen, P., Barberis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+growth+selection+system+to+detect+extracellular+and+transmembrane+protein+interactions.">Cell growth selection system to detect extracellular and transmembrane protein interactions.</a> Biochimica et biophysica acta. 1622, 117-117 (2003).</li><li>Voulgaraki, D., Mitnacht-Kraus, R., Letarte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+recombinant+proteins+for+probing+functions+of+leucocyte+surface+proteins+such+as+the+CD200+receptor.">Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor.</a> Immunology. 115, 337-337 (2005).</li><li>Wojtowicz, W. M., Wu, W., Andre, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vast+repertoire+of+Dscam+binding+specificities+arises+from+modular+interactions+of+variable+Ig+domains.">A vast repertoire of Dscam binding specificities arises from modular interactions of variable Ig domains.</a> Cell. 130, 1134-1134 (2007).</li><li>Martin, S., Sollner, C., Charoensawan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+Large+Extracellular+Protein+Interaction+Network+and+Its+Resolution+by+Spatiotemporal+Expression+Profiling.">Construction of a Large Extracellular Protein Interaction Network and Its Resolution by Spatiotemporal Expression Profiling.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9, 2654-2654 (2010).</li><li>Crosnier, C., Bustamante, L. Y., Bartholdson, S. J., Bei, A. K., Theron, M., Uchikawa, M., Mboup, S., Ndir, O., Kwiatkowski, D. P., Duraisingh, M. T., Rayner, J. C., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basigin+is+a+receptor+essential+for+erythrocyte+invasion+by+Plasmodium+falciparum.">Basigin is a receptor essential for erythrocyte invasion by Plasmodium falciparum.</a> Nature. 480, 534-537 (2011).</li><li>Sollner, C., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+surface+interaction+network+of+neural+leucine-rich+repeat+receptors.">A cell surface interaction network of neural leucine-rich repeat receptors.</a> Genome biology. 10, R99-R99 (2009).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Quando células vivas são observados in vivo, suas membranas plasmáticas exibem comportamentos altamente dinâmicos: ampliação e processos de membrana de retracção como contatar e se comunicar com seus 2 vizinhos. As interacções físicas entre as proteínas de membrana incorporados receptores que medeiam muitos destes contactos evoluíram para ser extremamente fraca, de modo a permitir que este comportamento altamente móveis. Estimou-se que as forças de interacção monoméricas como fraco como 50 uM poderia ser suficiente para impulsionar as interacções espontâneas em densidades de receptores fisiológicos 9, o que torna a detecção de interacções novos extremamente desafiantes 2,10. O método AVEXIS aqui descrito fornece um método sensível para a detecção de proteína extracelular transitória: interações protéicas que podem ser implementadas de uma forma escalável com uma baixa taxa de falsos positivos. Enquanto outros métodos escaláveis ​​têm sido desenvolvidos para detectar interacções extracelulares 11-15,Uma vantagem de AVEXIS é que os parâmetros experimentais, tais como a isca e actividades de presas foram quantificados para detectar mesmo os mais fracos das interacções (t 1/2 ≤ 0,1 s), mantendo uma baixa taxa de falsos positivos 3. Além disso, os procedimentos de preparação simplificados e robustos amostra permitiram este ensaio a ser implementado em uma escala muito maior do que outros ensaios e recentemente descrita uma tela de interação sistemática, totalizando mais de 16.500 potenciais interacções do ~ 16. O ensaio pode ser realizado em qualquer proteína para a qual é possível expressar um fragmento de proteína recombinante solúvel. Este inclui, portanto, as proteínas que contêm um péptido de sinal N-terminal, tal como o tipo I, IGP-ligados e secretada proteínas. Recentemente, concebemos um conjunto de vetores que agora nos permitem expressar proteínas do tipo II como iscas 17. O ensaio não é geralmente adequado para proteínas de membrana, tais como multipass transportador de iõess ou bombas, uma vez que não são susceptíveis de ser correctamente dobrada fora do contexto de uma membrana plasmática. Temos aplicado este a uma variedade de diferentes sistemas e com êxito expressaram proteínas extracelulares a partir de peixe-zebra 3,16,18, humano, rato e P. falciparum para telas de interação. Em termos de os recursos necessários para configurar uma tela AVEXIS, nós descobrimos que um gargalo significativo é a selecção de construção, e sequenciação completa dos plasmídeos de expressão. Este aspecto do método pode levar até um ano para fazer ~ isca 100 e construções de presa, no entanto, com o custo decrescente de síntese de genes, que agora favorecer comercialmente terceirizando este aspecto do projecto. O sistema de expressão de mamífero em conjunto com uma grande agitação de cultura de tecidos incubadora (usamos um INFORS HT celular Multitron) permite um único pesquisador para expressar e normalizar até ~ 100 isca e proteínas de presas de um mês. Uma vez que as proteínas são produzidas e normalizados, screening para interacções é rápida, com até 12 placas de 96 poços a ser convenientemente transformados por dia. O equipamento apenas por medida que têm desenvolvido para facilitar a produção de um número tão grande de proteínas é um comprimido pistão de ar de propulsão, que é utilizada para passar até cinco sobrenadantes através de um filtro 0.22μm em paralelo. A classe principal de interacções que podem ser perdidas, quando comparado com as interacções esperados a partir da literatura (falsos negativos) são interacções homofílico, embora alguns destes interacções podem ser detectados 3. Nos casos em que as interacções esperados não são detectados, acreditamos que isto é devido à formação de interacções homofílico pelas proteínas de presa (uma presa &quot;mascaramento&quot; efeito) que, em seguida, impede interacções adicionais com proteínas de isco imobilizadas. A frequência com que as interacções são detectados depende do conteúdo da biblioteca de proteína a ser rastreada. Como um guia para o leitor, uma tela de&gt; 30, 000 interacções dentro da superfamília das imunoglobulinas do peixe-zebra resultou em 188 positivos - uma frequência de 0,6% 3,16,18. Uma verificação muito rápida que pode ser realizada para verificar todos os acessos positivos é para determinar se a interacção pode ser detectada em ambas as orientações isca-presa, isto é, a mesma interacção pode ser detectada independentemente do facto de as proteínas de ligação estão presentes tanto como isco um ou uma presa. Sempre que têm observado este comportamento reciprocidade, a ligação foi subsequentemente demonstrado ser específico, demonstrando ligação saturável directa de proteínas purificadas utilizando ressonância plasmon de superfície. Ressalte-se que pelo fato de aumentar a avidez de ligação por artificialmente pentamerising as proteínas presas, nós não consideramos o teste apropriado para comparar quantitativamente força de interação. Para obter biofísicos parâmetros de ligação de interações que usamos proteínas monoméricas e ressonância plasmon de superfície. Finalmente, uma vez uma interacção tenha sido identificada, o oinatureza rendimento gh do ensaio torna relativamente fácil de se adaptar o ensaio a tela para reagentes tais como anticorpos ou moléculas pequenas que bloqueiam a interacção.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Cat. Número </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Freestyle mídia </td><td> Invitrogen </td><td> 12338018 </td><td></td></tr><tr><td> Nitrocefin </td><td> Calbiochem </td><td> 484400 </td><td></td></tr><tr><td> SA-revestidos placas de microtítulo </td><td> Nunc </td><td> 734-1284 </td><td></td></tr><tr><td> OX68 anticorpo </td><td> AbDSerotec </td><td> MCA1022R </td><td></td></tr><tr><td> Tubo de diálise </td><td> Perfurar </td><td> PN68100 </td><td></td></tr><tr><td> A polimixina B </td><td> Sigma </td><td> P4932 </td><td></td></tr><tr><td> D-biotina </td><td> Sigma </td><td> B4639-5G </td><td></td></tr><tr><td> Substrato-104 </td><td> Sigma </td><td> 1040-506 </td><td></td></tr><tr><td> Vivaspin-20 concentradores centrífugos </td><td> Músculo da coxa </td><td> VS2002 </td><td></td></tr><tr><td> Filtros de 0,22 uM </td><td> Nalgene </td><td> 190-2520 </td><td></td></tr></tbody></table>

avidity-based extracellular interaction screening (avexis) for the scalable detection of low-affinity extracellular receptor-ligand interactions

Proteína extracelular: interações entre proteínas secretadas ou de membrana ancoradas proteínas são fundamentais para a coesão de iniciar a comunicação intercelular e garantir dentro de organismos multicelulares. Proteínas predito para formar interacções extracelulares são codificados por aproximadamente um quarto de genes humanos 1, mas apesar da sua importância e abundância, a maioria destas proteínas não têm documentado parceiro de ligação. Primeiramente, isto é, devido à sua intratabilidade bioquímica: proteínas de membrana-incorporados são difíceis de solubilizar na sua conformação nativa e conter estruturalmente importantes modificações pós-tradução. Além disso, as afinidades de interação entre proteínas receptoras são geralmente caracterizadas por força de interação extremamente baixas (meia-vida &lt;1 segundo) que impossibilitam sua detecção com muitos comumente utilizados métodos de alto débito 2. Aqui, nós descrevemos um ensaio, AVEXIS (avidez de base EXtracellular Interação Tela) que supera estes desafios técnicos que permitam a detecção de interações protéicas muito fraco (t 1/2 ≤ 0,1 seg), com uma baixa taxa de falsos positivos 3. O ensaio é executado geralmente num formato de alta taxa de transferência, para permitir o rastreio sistemático de muitos milhares de interacções em um formato conveniente de microtitulação de placa (Fig. 1). Baseia-se na produção de bibliotecas solúveis de proteínas recombinantes que contêm os fragmentos ectodomínio de receptores de superfície celular ou proteínas secretadas dentro do qual a tela para interacções, portanto, esta abordagem é adequada para o tipo I, tipo II, a GPI-linked receptores da superfície celular e secretada proteínas, mas não para as proteínas de membrana multipass tais como canais de iões ou transportadores. As bibliotecas de proteínas recombinantes são produzidos usando um sistema de expressão conveniente e de alto nível de mamífero 4, para assegurar que as modificações pós-tradução importantes, tais como glycosylação e ligações dissulfeto são adicionados. Expressas proteínas recombinantes são secretados para o meio e produzida em duas formas: uma isca biotinilado, que pode ser capturado em uma fase de estreptavidina-revestido sólido adequado para o rastreio, e uma enzima pentamerised-etiquetados presa (β-lactamase). A isca e as proteínas são apresentados presas umas às outras de uma forma binária para detectar interacções directas entre eles, semelhantes a um ELISA convencional (Fig. 1). O pentamerisation das proteínas no presa é conseguido através de uma sequência peptídica da proteína matriz da cartilagem oligomérico (COMP) e aumenta a concentração local de ectodomínios proporcionando assim ganhos de avidez significativas para permitir interacções mesmo muito transientes a ser detectado. Normalizando as actividades de ambos isca e presa a níveis predeterminados antes de rastreio, que mostraram que as interacções com monoméricos meias-vidas de 0,1 seg pode ser detectada com baixas taxas de falsos positivos 3.

Watch this Scientific Journal Video about Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions at JoVE.com

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS é uma alta taxa de ensaio interação proteína desenvolvida para a tela de forma sistemática para novas extracelular do receptor-ligante pares envolvidos em processos de reconhecimento celular. Ele é projetado especificamente para detectar interações protéicas transitórios que são difíceis de identificar com outras abordagens de alto rendimento.

Avidez baseado Triagem Interação Extracelular (AVEXIS) para a detecção escalável de baixa afinidade Extracelular receptor-ligante Interações

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

avidity-based-extracellular-interaction-screening-avexis-for-scalable

Research

JoVE Journal

Biology

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

21.4K visualizações.  Wellcome Trust Sanger Institute. AVEXIS é uma alta taxa de ensaio interação proteína desenvolvida para a tela de forma sistemática para novas extracelular do receptor-ligante pares envolvidos em processos de reconhecimento celular. Ele é projetado especificamente para detectar interações protéicas transitórios que são difíceis de identificar com outras abordagens de alto rendimento.

Vídeo: Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

Oligo Profiling Massa (OLIMP) de polissacarídeos extracelulares

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Biologia

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

Técnicas de Análise de vesículas extracelulares utilizando citometria de fluxo

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Medição de Extracelular Ion Fluxos Usando a técnica microeletrodos de auto-referência íon-seletivo

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

Expressão Mammalian Cell eficiente e de uma etapa de purificação extracelular glicoproteínas para a cristalização

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix biology, there are still major gaps related to how the matrix is formed, how physiological and pathological remodeling differ, and most importantly how matrix dynamics might be manipulated to promote healing and inhibit fibrosis. There is currently no treatment option for controlling, preventing, or reversing cardiac fibrosis. Part of the reason is likely the sheer complexity of cardiac scar formation, such as occurs after myocardial infarction to immediately replace dead or dying cardiomyocytes. The extracellular matrix itself participates in remodeling by activating resident cells and also by helping to guide infiltrating cells to the defunct lesion. The matrix is also a storage locker of sorts for matricellular proteins that are crucial to normal matrix turnover, as well as fibrotic signaling. The matrix has additionally been demonstrated to play an electromechanical role in cardiac tissue. Most techniques for assessing fibrosis are not qualitative in nature, but rather provide quantitative results that are useful for comparing two groups but that do not provide information related to the underlying matrix structure. Highlighted here is a technique for visualizing cardiac matrix ultrastructure. Scanning electron microscopy of decellularized heart tissue reveals striking differences in structure that might otherwise be missed using traditional quantitative research methods.

Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

Microscopia Eletrônica de Varredura do Tecido macerado para visualizar a matriz extracelular

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

A rápida, Método Scalable para o isolamento, estudo funcional, e Análise de matriz extracelular derivado de celular

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Estabelecimento de um pH extracelular ácido sistema de cultura

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native receptor and the ligand are challenging since the ligand of a specific receptor may be unknown and experimental procedures with the native ligand can be technically complicated. To address these obstacles, we describe a reporter system to detect the binding and activation of a specific receptor by a ligand of interest. In this reporter system, the extracellular domain of a specific receptor is conjugated to mouse CD3&#950; and this chimeric protein is then expressed in mouse BW cells. These transfected BW cells can then be incubated with different targets (e.g., cells or antibodies). Activation of a transfected receptor leads to the secretion of mouse interleukin-2 (mIL-2) which can be detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). This reporter system has the advantages of being sensitive and specific to a single receptor. In addition, the activation level of a specific receptor can easily be quantified and can be used even in cases where the ligand of the receptor is unknown. This system has been implemented successfully in many of our studies to characterize receptor-ligand interactions. We have recently employed this system to study the activation of human Fc&#947; receptors (Fc&#947;Rs) by different monoclonal anti-CD20 antibodies in clinical use.

This protocol describes how to establish a reporter system that can be used to identify and quantify receptor-ligand interactions.

Um sistema BW repórter para estudar interações ligante-Receptor

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving area of research. There are many different methods for EV isolation, each with distinct advantages and disadvantages that affect the downstream yield and purity of EVs. Thus, characterizing the EV prep isolated from a given source by a chosen method is important for interpretation of downstream results and comparison of results across laboratories. Various methods exist for determining the size and quantity of EVs, which can be altered by disease states or in response to external conditions. Nanoparticle tracking analysis (NTA) is one of the prominent technologies used for high-throughput analysis of individual EVs. Here, we present a detailed protocol for quantification and size determination of EVs isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma using a breakthrough technology for NTA representing major advances in the field. The results demonstrate that this method can deliver reproducible and valid total particle concentration and size distribution data for EVs isolated from different sources using different methods, as confirmed by transmission electron microscopy. The adaptation of this instrument for NTA will address the need for standardization in NTA methods to increase rigor and reproducibility in EV research.

We demonstrate how to use a novel nanoparticle tracking analysis instrument to estimate the size distribution and total particle concentration of extracellular vesicles isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma.

Análise de rastreamento de nanopartículas para a quantificação e determinação de tamanho de vesículos extracelulares

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular communication in various research fields; cancer biology, neuroscience, and drug delivery. Many EV uptake assays have been reported in the literature; however, there is a lack of practical, detailed experimental methodology. EV uptake can be assessed by fluorescently labeling EVs to detect their location within cells. Distinguishing between internalized EVs in cells and the superficial EVs on cells is difficult, yet critical, to accurately determine the EV uptake. Therefore, an assay that efficiently quantifies EV uptake through three-dimensional (3D) fluorescence confocal microscopy is proposed in this work. Fluorescently labeled EVs were prepared using a nano-filtration-based microfluidic device, visualized by 3D confocal microscopy, and then analyzed through advanced image-processing software. The protocol provides a robust methodology for analyzing EVs on a cellular level and a practical approach for efficient analysis.

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Extracellular vesicles (EVs) contribute to cellular biology and intercellular communications. There is a need for practical assays to visualize and quantify EVs uptake by the cells. The current protocol proposes the EV uptake assay by utilizing three-dimensional fluorescence imaging via confocal microscopy, following EV isolation by a nano-filtration-based microfluidic device.

Ensaio de absorção de vesícula extracelular via análise de imagens de microscópio confocal

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...