Este protocolo pode ser usado para produzir filmes de lapso de tempo de Pseudomonas aeruginosa swarming e para capturar a repulsão de enxame por bacteriófago ou antibióticos. Os filmes de lapso de tempo capturam a dinâmica detalhada da resposta a antibióticos e bacteriófagos e a técnica requer apenas um desumidificador, computador, incubadora e scanner de documentos. Para preparar placas de ágar para imagens de lapso de tempo de P.aeruginosa, use uma pipeta de 25 mililitros para adicionar 20 mililitros de solução de ágar a cada placa experimental de 10 centímetros de diâmetro de Petri.
Coloque as placas em uma única pilha com tampas durante uma hora em temperatura ambiente. Ligue um desumidificador para diminuir a umidade relativa da sala para 40-50%Quando o ágar se solidificar, seque as placas de ágar por mais 30 minutos em um capô de fluxo laminar com as tampas desligadas e encare a 300 pés cúbicos por minuto com uma umidade relativa de 40-50% à temperatura ambiente. Em seguida, armazene as placas secas de ágar a quatro graus Celsius por até 24 horas.
Para emplacar ágar swarming, segure uma ponta de pipeta P20 carregada com cinco microliters de uma cultura P.aeruginosa durante a noite em um ângulo de 10-45 graus 2-1/2 centímetros acima do centro de uma placa de enxame e deprimir o êmbolo para a primeira parada tocando o ágar com apenas a gota líquida. Use um modelo para posicionar o local consistentemente entre as diferentes placas de ágar. Para emplacar uma infecção por phage, misture primeiro 30 microlitadores de P.aeruginosa cultivados durante a noite com seis microlitadores de uma vez 10 para as 12 unidades formadoras de placas por mililitro de phage DMS3 vir e adicione imediatamente seis microliters da mistura de phage P.aeruginosa em seis posições satélites equidistantes em um círculo concêntrico de raio de 2,8 centímetros como demonstrado.
Use um modelo para posicionar o local consistentemente em diferentes placas de ágar. Para aplacar os tratamentos com antibióticos, misture 30 microlitadores de P.aeruginosa cultivados durante a noite com a concentração e o volume apropriados do antibiótico de interesse e adicione imediatamente seis microliters da bactéria tratada com antibióticos em seis posições de satélite equidistantes em um círculo concêntrico de raio de 2,8 centímetros sobre o centro da antena. Use um modelo para posicionar o local consistentemente entre as diferentes placas de ágar.
Quando todas as culturas tiverem sido banhadas, substitua as tampas claras da placa de Petri por tampas pretas personalizadas. Coloque cuidadosamente as placas de ágar em um scanner em uma incubadora fixada a 37 graus Celsius com um banho de água de 10 litros para manter a umidade em 75% Depois de colocar as placas no scanner, abra o arquivo e salve as configurações para definir o caminho de salvamento para as imagens e clique em digitalizar e OK em intervalos de 30 minutos. Para automatizar a aquisição de imagens, use o software de scripting.
Selecione a varredura ociosa e a varredura única e clique à direita na varredura ociosa e, em seguida, clique à esquerda ativado. No final da incubação, importe todas as imagens digitalizadas para ImageJ. Na janela de opções de sequência, o número de imagens indicará o número de imagens selecionadas.
Mantenha a imagem inicial em uma para começar a partir da primeira imagem na pasta e as imagens de escala em 100% para conservar o tamanho original das imagens. Clique em capa para RGB para manter as imagens em cores. Deixe usar pilha virtual sem controle e clique em OK para carregar as imagens.
Clique em arquivo, salve como e AVI para mesclar as imagens em um arquivo AVI. Ajuste a compressão para JPEG e a taxa de quadros para cinco quadros por segundo. Em seguida, salve o lapso de tempo da AVI na pasta de armazenamento apropriada.
Imagens de lapso de tempo de uma única colônia de P.aeruginosa tipo selvagem de uma placa de ágar LB em caldo LB durante a noite a 37 graus Celsius e avistadas no centro de uma placa de ágar infestada revela um crescimento inicial na forma de uma colônia no centro da placa que se espalha em tendrils radialmente da colônia. Enxames se movem do centro das placas de ágar para a periferia e são repelidos por um sinal de estresse emitido pelas bactérias que foram infectadas com phages ou tratadas com Gentamicina. Phages ou Gentamicina vistas sozinhas nas posições de satélite não fazem com que populações em chamas evitem essas áreas.
Use uma pipeta de 25 mililitros para garantir que as placas de ágar infestadas contenham exatamente 20 mililitros. Também é importante ajustar o tempo de secagem da placa de acordo com o ambiente laboratorial. Nossa técnica nos permite visualizar os padrões globais de enxame das populações pseudomonas aeruginosa.
O próximo objetivo é monitorar a motilidade celular individual usando microscopia Brightfield.
