Os autores são muito gratos a Bob Fischer (LV, DIR, NIAID, NIH), que atuou como narrador, assim como Austin Athman (RTB, DIR, NIAID, NIH) e Megan Morgan (DOHS, ORS, OD, NIH) para sua ajuda em fazer o filme que acompanha este artigo. Além disso, gostaríamos de agradecer a Allison Groseth (LV, DIR, NIAID, NIH) para a leitura crítica do manuscrito. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa do NIH, NIAID Research intramuros.

1 Divisão de células produtoras de produção inicial de trVLPs <ol><li> Remova o meio 80-90% confluentes células 293 cultivadas em 75 cm2 em frascos de alta glucose do meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, e 1x pen / estrep (DMEM10 ). Lave as células duas vezes com 10 ml de solução salina de fosfato tamponada (PBS), tendo o cuidado para não deslocar as células, e adicionar 2 ml de tripsina-EDTA para as células. </li><li> Incubar as células à temperatura ambiente até que as células mostram arredondamento significativo quando observados sob um microscópio (de cerca de 30 seg). Desalojar células por frasco tocando, e adicionar 8 ml DMEM10. Absolutamente ressuspender as células suavemente pipetando para cima e para baixo, até uma suspensão de células isoladas é observado quando visto ao microscópio. </li><li> Contar as células utilizando um contador de células automatizado. Dilui-se as células para 2 x 10 5 células por ml em DMEM10. Pipeta de 2 ml de suspensão celular por poço em placas de 6 poços (4 x 105 células por poço). </li><li> Incubar as placas em uma incubadora de cultura de tecidos humidificada a 37 ° C com 5% de CO 2. </li></ol> 2 A transfecção de células produtoras de produção inicial de trVLPs <ol><li> 24 horas após a divisão das células (ver Figura 5 para obter uma visão geral do tempo da experiência), pipeta plasmídeo DNA 15 (para valores ver Tabela 1) para um estéril 2 ml cryovial utilizando a ponta dos filtrados. Adicionam-se 100 ul por poço de OptiMEM com o ADN. Vortex a mistura brevemente e suavemente girar os tubos utilizando uma microcentrífuga. Se vários poços estão a ser transfectada com plasmídeos idênticos, um mastermix para vários poços pode ser feito. </li><li> Resumidamente vortex o frasco com a Transit LT1 antes do uso. Adicionar 7,5 mL de trânsito LT1 por poço para o ADN diluído. Vortex suavemente a mistura, tendo o cuidado de não recolher líquido na tampa do frasco de congelação, e incubar durante 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Misture delicadamente a transfecçãocomplexo pipetando para cima e para baixo. Adicionam-se 100 ul dos complexos de transfecção, gota a gota a cada poço. Balance o prato para frente / trás e para os lados para distribuir os complexos de transfecção. Não rode a placa, pois isso vai causar desigual difusão dos complexos de transfecção. </li><li> Retorne as células para a incubadora. </li><li> Após 24 horas, remover o sobrenadante a partir de células. Adicionar 4 ml de DMEM com 5% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 1x pen / estrep (DMEM5) para as células. Este passo pode ser feito para cima de 3 poços de uma vez, sem a secagem dos poços, assumindo que os poços contêm amostras idênticas (de outro modo, devido à natureza auto-amplificação das trVLPs neste sistema, a contaminação cruzada pode tornar-se um problema e este passo deve ser feito um poço de cada vez). </li><li> Retorne as células para a incubadora. </li></ol> 3 Preparação de Células Alvo <ol><li> Dividir 293 como descrito na seção 1, semeando 4 x 10 5 células em 2 ml DMEM10 por poço de umaPlaca de 6 poços. </li><li> 24 h depois da separação das células alvo e 24 horas antes da infecção, as células alvo transfecção como descrito na secção 2, utilizando o ADN ascende na Tabela 1, e 4,5 mL por poço Trânsito LT1. </li></ol> 4. infecção das células-alvo e colheita de células produtoras <ol><li> Transfira os sobrenadantes das células produtoras de tubos de 15 ml. Retire e descarte qualquer sobrenadante restante usando uma mangueira de vácuo. Adicionar 250 ul de tampão de lise Glo para as células. </li><li> Sobrenadante Centrifugar durante 5 minutos a 800 x g e à temperatura ambiente para eliminar as amostras de detritos celulares. </li><li> Retirar o sobrenadante a partir de um poço de células alvo. Adicione cuidadosamente 3 ml de apuradas sobrenadante de células produtoras de células alvo, utilizando a menor velocidade de pipeta. Evitar pipetando directamente sobre as células, a fim de evitar a ruptura da monocamada de células. Este passo deve ser feito um poço de cada vez. </li><li> Quando todas as amostras terem sido transridos, o retorno das células-alvo para a incubadora para permitir a sedimentação dos trVLPs e infecção de células alvo. </li><li> Após 15 min de incubação à temperatura ambiente no tampão de lise Glo, voltar a suspender as células produtoras em tampão de lise utilizando uma micropipeta ajustado para 150 mL, e transferir a amostra para um criotubo de 2 mL. Neste momento, os lisados ​​podem ser congeladas a -80 ° C, ou medido directamente, tal como descrito na secção 6. </li><li> 24 horas após a infecção, remover o sobrenadante a partir de células alvo. Adicionar 4 ml DMEM5 por poço para as células. Este passo pode ser feito por até três poços ao mesmo tempo, se os poços contêm amostras idênticas (de outra forma, devido à natureza auto-amplificação das trVLPs neste sistema, a contaminação cruzada pode tornar-se um problema, e este passo deve ser feito um poço de cada vez). </li></ol> 5. Colheita de células-alvo para a Infecção ciclo único <ol><li> Se apenas um único ciclo de infecção devem ser avaliadas, em 72 horas após a infecção remove tele sobrenadante das células alvo, utilizando um tubo de vácuo. </li><li> Colher as células em 250 mL de tampão de lise Glo conforme descrito na seção 4 para células produtoras. </li></ol> 6. Colheita de células alvo e Passaging contínua de trVLPs <ol><li> Se trVLPs são continuamente passadas, preparar um novo grupo de células alvo, tal como descrito na secção 3 de modo a que eles estão prontos para a infecção de 72 h após a infecção do primeiro conjunto de células alvo (ver Figura 5). </li><li> Infect o novo conjunto de células alvo, tal como descrito no ponto 4 (usando o primeiro conjunto de células alvo, em lugar das células produtoras). </li><li> Repita essas etapas a cada 72 horas. </li></ol> 7 Análise Repórter de Actividade <ol><li> Se os lisados ​​de células foram congeladas, o descongelamento à temperatura ambiente. Certifique-se de que as amostras tenham atingido a temperatura ambiente antes da medição. </li><li> Descongelar a quantidade necessária (40 ul por amostra) de tampão de ensaio de Renilla Glo (i idealmente congeladon alíquotas) à temperatura ambiente. Certifique-se de que o buffer atingir a temperatura ambiente antes da medição. </li><li> Adicione 1/100 º volume de substrato Renilla Glo para o tampão de ensaio Renilla Glo obter reagente Renilla Glo, e misturar em vortex. Pipetar 40 ul de reagente de Renilla Glo em um de 96 poços branca placa. </li><li> Adicionar 40 ul de amostra com o reagente de Renilla-Glo. Espere 10 min, em seguida, medir as amostras em um luminometer utilizando um tempo de integração de 1 segundo. </li></ol>

<ol>
	<li>Kuhn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+perceived+threat+differences+posed+by+filovirus+variants.">Evaluation of perceived threat differences posed by filovirus variants.</a> Biosecurity and bioterrorism : biodefense strategy, practice, and science. 9, 361-371 (2011).</li><li>Falzarano, D., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+leap+ahead+in+filovirus+therapeutics.">Possible leap ahead in filovirus therapeutics.</a> Cell research. , (2014).</li><li>Hoenen, T., Groseth, A., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+ebola+vaccines.">Current ebola vaccines.</a> Expert opinion on biological therapy. 12, 859-872 (2012).</li><li>Beniac, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organisation+of+ebola+virus+reveals+a+capacity+for+extensive,+modular+polyploidy.">The organisation of ebola virus reveals a capacity for extensive, modular polyploidy.</a> PloS one. 7, e29608 (2012).</li><li>Basu, A., Mills, D. M., Bowlin, T. L., Enna, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13,+Unit+13B+13,+High-throughput+screening+of+viral+entry+inhibitors+using+pseudotyped+virus.">Chapter 13, Unit 13B 13, High-throughput screening of viral entry inhibitors using pseudotyped virus.</a> Current protocols in pharmacology. , (2010).</li><li>Wong, A. C., Sandesara, R. G., Mulherkar, N., Whelan, S. P., Chandran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+forward+genetic+strategy+reveals+destabilizing+mutations+in+the+Ebolavirus+glycoprotein+that+alter+its+protease+dependence+during+cell+entry.">A forward genetic strategy reveals destabilizing mutations in the Ebolavirus glycoprotein that alter its protease dependence during cell entry.</a> J Virol. 84, 163-175 (2010).</li><li>Muhlberger, E., Weik, M., Volchkov, V. E., Klenk, H. D., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+transcription+and+replication+strategies+of+marburg+virus+and+Ebola+virus+by+using+artificial+replication+systems.">Comparison of the transcription and replication strategies of marburg virus and Ebola virus by using artificial replication systems.</a> J Virol. 73, 2333-2342 (1999).</li><li>Hoenen, T., Groseth, A., de Kok-Mercado, F., Kuhn, J. H., Wahl-Jensen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minigenomes,+transcription+and+replication+competent+virus-like+particles+and+beyond:+reverse+genetics+systems+for+filoviruses+and+other+negative+stranded+hemorrhagic+fever+viruses.">Minigenomes, transcription and replication competent virus-like particles and beyond: reverse genetics systems for filoviruses and other negative stranded hemorrhagic fever viruses.</a> Antiviral Res. 91, 195-208 (2011).</li><li>Hoenen, T., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics+systems+as+tools+for+the+development+of+novel+therapies+against+filoviruses.">Reverse genetics systems as tools for the development of novel therapies against filoviruses.</a> Expert Rev Anti Inf Ther. , 1253-1263 (2014).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+naive+target+cells+with+virus-like+particles:+implications+for+the+function+of+ebola+virus+VP24.">Infection of naive target cells with virus-like particles: implications for the function of ebola virus VP24.</a> J Virol. 80, 7260-7264 (2006).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+novel+ebola+virus-like+particles+from+cDNAs:+an+alternative+to+ebola+virus+generation+by+reverse+genetics.">Production of novel ebola virus-like particles from cDNAs: an alternative to ebola virus generation by reverse genetics.</a> J Virol. 78, 999-1005 (2004).</li><li>Hoenen, T., Jung, S., Herwig, A., Groseth, A., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+matrix+proteins+of+Ebola+virus+contribute+to+the+regulation+of+viral+genome+replication+and+transcription.">Both matrix proteins of Ebola virus contribute to the regulation of viral genome replication and transcription.</a> Virology. 403, 56-66 (2010).</li><li>Watanabe, S., Noda, T., Halfmann, P., Jasenosky, L., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+virus+(EBOV)+VP24+inhibits+transcription+and+replication+of+the+EBOV+genome.">Ebola virus (EBOV) VP24 inhibits transcription and replication of the EBOV genome.</a> J Infect Dis. 2 (196 Suppl 2), S284-S290 (2007).</li><li>Spiegelberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genus-specific+recruitment+of+filovirus+ribonucleoprotein+complexes+into+budding+particles.">Genus-specific recruitment of filovirus ribonucleoprotein complexes into budding particles.</a> J Gen Virol. 92, 2900-2905 (2011).</li><li>Watt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+lifecycle+modeling+system+for+Ebola+virus+shows+a+genome+length-dependent+role+of+VP24+on+virus+infectivity.">A novel lifecycle modeling system for Ebola virus shows a genome length-dependent role of VP24 on virus infectivity.</a> J Virol. , (2014).</li><li>Kondratowicz, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+immunoglobulin+and+mucin+domain+1+(TIM-1)+is+a+receptor+for+Zaire+Ebolavirus+and+Lake+Victoria+Marburgvirus.">T-cell immunoglobulin and mucin domain 1 (TIM-1) is a receptor for Zaire Ebolavirus and Lake Victoria Marburgvirus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 8426-8431 (2011).</li><li>Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Ebola+virus+expressing+luciferase+allows+for+rapid+and+quantitative+testing+of+antivirals.">A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals.</a> Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+bodies+are+a+site+of+ebolavirus+replication.">Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication.</a> J Virol. 86, 11779-11788 (2012).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O ensaio trVLP tetracistronic descrito neste manuscrito permite a modelagem do ciclo de vida do vírus da Ebola ao longo de vários ciclos infecciosos. É importante ressaltar que os trVLPs produzidas neste sistema, não contêm a informação genética para as proteínas nucleocapsídeo NP, VP35, VP30, e L, que juntos compõem quase 60% do genoma do vírus Ebola e são essenciais para a replicação viral. Em vez disso, estas proteínas têm que ser fornecidos em células alvo em trans a partir de plasmídeos de expressão, e qualquer infecção de células que não expressam todas as 4 dessas proteínas é abortada. É importante notar que não existe qualquer evidência de recombinação genética para filovírus, e não existem regiões homólogas partilhadas entre o minigenoma tetracistronic e os plasmídeos de expressão para as proteínas da nucleocápside. Portanto, não há qualquer evidência prática nem qualquer base teórica que poderia prever a possibilidade de geração de corpo inteiro genomas do vírus Ebola, que poderia potencialmente resultar ema produção de vírus Ebola infecciosos, tornando este sistema seguro para o uso sob condições de BSL2. Existem dois passos críticos no ensaio trVLP tetracistronic que são influenciados pelas condições experimentais, ou seja, a produção de trVLPs, e a infecção das células alvo com estes trVLPs. Produção de trVLPs é dependente de níveis elevados de replicação e transcrição de minigenoma, o qual por sua vez é dependente de uma elevada eficácia de transfecção. A transfecção eficácia pode ser facilmente avaliada através da inclusão de um controlo-L, em que o plasmídeo de expressão para L é trocado por um plasmídeo de expressão que codificam eGFP. Taxas de transfecção nestas condições deve ser superior a 50% por inspeção com um microscópio de fluorescência 24 horas após a transfecção. Além disso, as células têm que ser livres de micoplasma, uma vez que em nossa experiência micoplasma contaminação prejudica drasticamente a replicação e transcrição minigenoma (dados não publicados). Devido a sua alta transfectabilidade 293 cells são a linha de células de escolha para os ensaios trVLP; no entanto, estas células são relativamente pouco sensíveis (embora não completamente refração) a infecção com o vírus Ebola 16. Expressão de um factor de fixação, tais como Tim-1 aumenta a infecção de células 293 com trVLPs cerca de 100 vezes, e é crucial para o sucesso deste sistema ao longo de várias passagens. Enquanto trVLPs tetracistronic não são auto-replicante por conta própria, eles são auto-replicante em células que expressam as proteínas nucleocapsídeo. Como tal, as precauções têm de ser feitas para evitar contaminações cruzadas entre os poços que contêm diferentes trVLPs (por exemplo, com diferentes mutações no minigenoma). De um ponto de vista mais técnico, devido à grande diferença entre sinais positivos e negativos neste ensaio (cerca de 4 toras), conversa cruzada entre as amostras em que a medição da actividade da luciferase pode ser um problema; no entanto, esta pode ser facilmente evitada, deixando uma cavidade vazia entre cada uma das amostras noPlaca de 96 poços utilizados para medir a actividade da luciferase. Há uma infinidade de aplicações possíveis para trVLPs tetracistronic. Obviamente, eles estão bem adaptados para estudar a entrada de partículas filovírus, desde trVLPs infecciosas tem a estrutura típica do tipo fio de filovírus infecciosas 14, e contêm os mesmos componentes como partículas virais filovírus. É importante notar que não contêm componentes de outros vírus, como é o caso quando se utiliza pseudotipados viriões ou partículas semelhantes a vírus, tais como partículas de retrovírus que ostentam GP 1,2, ou de vírus recombinantes, tais como recombinantes de vírus da estomatite vesicular que expressam GP 1,2 . A necessidade de factores de fixação 293 quando se usa células como células alvo, neste sistema pode ser explorada para a tela e para investigar o papel de tais factores de fixação, enquanto que as funções de outros factores celulares, tais como os envolvidos na replicação do genoma e transcrição, bem como morfogênese e brotoding, pode ser investigado utilizando a tecnologia de RNAi. O efeito de mutações em proteínas virais no ciclo de vida do vírus pode também ser estudado, ainda tem de se ter em mente que, enquanto VP40, GP 1,2, e VP24 são expressas após a transcrição virai, a expressão de outras proteínas virais é alcançada a partir da expressão plasmídeos, de forma que, devido a efeitos da sobre-expressão destas proteínas têm de ser tidas em conta. Além disso, deve ser tomado cuidado para que as mutações no minigenoma não alteram significativamente a duração do minigenoma, desde que a atividade repórter é diretamente afetado pela minigenoma comprimento 15. Finalmente, uma vez minigenomas tetracistronic são análogos genoma viral que carregam genes virais e são replicados pelo complexo polimerase viral, também deve ser possível estudar a evolução desses genes em resposta a mutações em condições BSL2. Assim, embora mais estudos ainda são necessários nesse sentido, deve ser possível, por exemplo, a introdução abaixo do idealMutações em genes dentro dos minigenoma e depois trVLPs passagem até mutações cortesia emergir. Uma limitação do ensaio trVLP tetracistronic que tem de ser mantido em mente é o facto de que, embora a maioria dos modelos de ciclo de vida do vírus, a transcrição primária em células alvo não é modelado por este sistema, uma vez que as células alvo tem que expressam as proteínas da nucleocápside de trans para que os trVLPs replicar. Se a transcrição primária tem de ser avaliado, é possível a utilização de células-alvo ingênuas 10; no entanto, neste caso não replicação do genoma ocorre em células-alvo, e não mais trVLPs infecciosas são produzidos, abortando a infecção. Este é um problema principais que não pode ser ultrapassada sem tornar as trVLPs completamente auto-replicante, incluindo os genes para as proteínas da nucleocápside na minigenoma, o que, de facto, transformá-los em vírus Ebola recombinantes infecciosos. Na verdade, Ebolum vírus que expressam luciferase ou outros repórteres ter sido gerado e pode ser utilizada para avaliar e estudar a replicação e transcrição do genoma 17,18; no entanto, a sua utilização é restrita a laboratórios BSL4. Além disso, tem que ser mantido em mente que, enquanto VP40, GP 1,2, e VP24 são expressos a partir de um análogo do genoma viral, a sua posição no minigenoma (2 ª, 3 ª, 4 ª e unidade de transcrição) não é idêntica à a sua posição no genoma do vírus (3 º, 4 º, e 6 de unidade de transcrição), o que poderia influenciar os seus níveis de expressão absolutas, assim como os seus níveis de expressão relativos em relação uns aos outros. No geral, o ensaio trVLP tetracistronic representa o sistema de modelagem de ciclo de vida mais abrangente para os vírus Ebola disponíveis até à data, e permite a modelagem da replicação do genoma e transcrição, partícula morfogênese e brotação, bem como apego e entente em células alvo ao longo de vários ciclos infecciosos. Como tal, tem um grande potencial para a utilização em investigar a biologia do vírus Ebola, sob condições BSL2.

Vírus Ébola são o agente causador da febre hemorrágica grave em seres humanos e primatas não-humanos, com as taxas de mortalidade de até 90% em surtos em humanos 1. Embora tenha havido progressos significativos nos últimos anos no desenvolvimento de vacinas, bem como tratamentos específicos (revisada em 2,3), estes não são aprovados para uso humano. Partículas de vírus Ebola tem uma aparência em forma de rosca característica com um comprimento de cerca de 1 ^ m e um diâmetro de 96 a 98 nm de 4. Forma-se um núcleo do nucleocapsídeo das partículas virais e consiste em 1) o genoma não segmentado de cadeia simples de sentido negativo de ARN, que codifica os genes Ebolavirus 7 (Figura 1), 2) a nucleoproteína NP, que encapsidates o genoma, 3 ) do complexo de polimerase viral que consiste na polimerase L e seu co-factor VP35, e 4) o activador transcricional VP30. Além disso, foi recentemente mostrado que a proteína VP24 está também associada com nucleocápsides 4. A nucleocápside está rodeado por o espaço da matriz em que a proteína de matriz de VP40, que é responsável pela morfogénese de viriões e gemulação, está localizado. Partículas de vírus são mais envolvido, e incorporado no envelope que é a única proteína de superfície GP 1,2, o qual é responsável pela ligação do virião e entrada. Trabalho com vírus Ebola infecciosas deve ser realizada em um laboratório de contenção máxima no nível de biossegurança (BSL) quatro condições, o que restringe esse trabalho a algumas instalações em todo o mundo. A fim de estudar a biologia destes vírus ou o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos, em condições BSL2, investigadores dependem quer por sobre-expressão de proteínas recombinantes do vírus Ebola, ou em sistemas de modelagem de ciclo de vida, os quais podem ser trabalhados com a ausência de vírus Ebola infecciosa. Recombinante de expressão de proteínas do vírus Ebola ou é alcançada a partir de plasmídeos de expressão ou de vectores virais. Um caso especial desta estratégia é ogeração de viriões ou partículas semelhantes a vírus com base em outros vírus do que os vírus Ebola (mais comumente retrovírus ou vírus da estomatite vesicular), na presença de forma recombinante expressa GP 1,2, conduzindo à geração de partículas pseudotipados, o qual pode ser utilizado para estudar o processo de entrada de filoviruses e tela de inibidores de entrada 5. Alternativamente, os vírus recombinantes (por exemplo, vírus da estomatite vesicular) que codificam o vírus Ebola GP 1,2 em vez do seu próprio glicoproteína pode ser gerado e utilizado para estudar a entrada do vírus sob condições de nível de segurança 2 6. Sistemas de modelagem de ciclo de vida são formas de sistemas de genética inversa que caracterizam a utilização de análogos truncados do genoma do vírus Ebola (minigenomas), que são produzidos inicialmente a partir de cDNA e depois replicados e transcritos por proteínas do vírus Ebola fornecidas em trans. O primeiro sistema minigenoma para o vírus Ebola foi desenvolvido há mais de 15 anos atrás 7, E uma vez que tem sido usado para estudar a replicação do genoma do vírus Ebola e a transcrição (revista em 8,9). Neste sistema um minigenoma monocistrónicas consistindo de um único gene repórter flanqueado pelas regiões terminais não-codificantes do genoma do vírus Ebola (chamado o líder e reboque) (Figura 1) é expressa em células de mamífero (normalmente através de transcrição usando polimerase de RNA de T7) em conjunto com as proteínas virais L, VP35, VP30 e NP. O minigenoma está encapsidado pela NP, e, em seguida, replicado e transcrito pelas outras proteínas da nucleocápside, utilizando sinais de actuação cis localizadas no líder e reboque, levando a actividade repórter que reflecte estes dois aspectos do ciclo de vida do vírus (Figura 2). De forma a modelar passos adicionais do ciclo de vida viral, transcrição e replicação competente partícula semelhante a vírus sistemas (trVLP) têm sido desenvolvidos, que são baseados em sistemas de minigenoma clássicos, mas apresentam o umexpressão dicional das outras proteínas virais VP24, VP40 e GP 1,2 de plasmídeos de expressão 10,11. A presença de VP40 conduz à formação de trVLPs, que suportará GP 1,2 na sua superfície, e realizar uma nucleocápside contendo minigenoma no interior. Estes trVLPs pode ser utilizado para infectar as células-alvo, que foram ambos pretransfected com plasmídeos de expressão de L, VP35, VP30 e NP, a fim de facilitar a replicação e transcrição de minigenomas trazidos para dentro das células alvo dentro trVLPs 11, ou são células alvo ingénuos (isto sem expressão orientada por plasmídeo de proteínas do vírus Ebola) 10. Isto resulta na actividade repórter nas células-alvo, o que reflecte a replicação dos minigenomas no células produtoras, a morfogénese e brotação de trVLPs, a sua entrada nas células alvo, e 1), no caso das células-alvo do genoma, também pretransfected replicação e transcrição secundários ( ou seja, a transcrição por proteínas virais produced em células-alvo) nas células alvo, ou 2) no caso das células-alvo também ingénuos primária de transcrição (ou seja, a transcrição por proteínas virais trazidos para dentro de células-alvo trVLPs) (Figura 3). É importante notar que estes sistemas só têm sido usados ​​para modelar um único ciclo de infecção, e contam com a sobre-expressão de todas as proteínas virais, que no caso de VP24 e VP40 é particularmente problemático, uma vez que estas proteínas têm mostrado ser fortes reguladores negativos da replicação do genoma e quando superexpresso transcrição a partir de plasmídeos 12,13. Além disso, os preparativos trVLP produzidos nestes sistemas contêm uma elevada proporção de partículas não infecciosas, colocando desafios para a análise bioquímica do trVLPs infecciosas 14. A fim de superar estes problemas, desenvolvemos recentemente um sistema de minigenoma tetracistronic que, para além de um gene repórter, também contém os genes que codificam para VP40, 1,2 e GPVP24 (Figura 1). Semelhante ao sistema de minigenoma monocistrónicas clássica, este sistema acarreta a produção de trVLPs que podem infectar as células-alvo (Figura 4) 15. No entanto, em contraste com o sistema clássico de minigenoma, VP40, GP 1,2, e VP24 são produzidas após a transcrição do genoma viral em vez de ser sobre-expressa a partir dos plasmídeos. Como resultado, a cinética e os níveis de expressão destas proteínas muito mais intimamente imitar os encontrados durante o ciclo de vida viral e, consequentemente, o rácio de infeccioso para trVLPs não infecciosas é aumentada cerca de 500 vezes no presente sistema 15. Além disso, a utilização deste sistema foi possível continuamente passagem trVLPs contendo minigenoma tetracistronic, modelando múltiplos ciclos infecciosas. Como tal, trVLPs tetracistronic Atualmente o sistema de modelagem de ciclo de vida mais abrangente disponível para estudar a biologia do vírus Ebola em condições BSL2. Aqui, nós fornecemos informações detalhadas sobre o uso of este sistema, assim como os resultados esperados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">75cm2 cell culture flask</td>
			<td style="width:157px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:123px;">430641</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMEM</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D6546</td>
			<td>preheat to 37&#176;C prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">FBS</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>heat inactivate 30 min @ 56&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">25030-081</td>
			<td>100X&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Pen Strep</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">15070-063</td>
			<td>100X&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:259px;">PBS</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:239px;">8 g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, H2O ad 1 liter; autoclave and store at room temperature&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6-well plates</td>
			<td style="width:157px;">Costar</td>
			<td style="width:123px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Opti-MEM I</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Transit LT1</td>
			<td style="width:157px;">Mirus</td>
			<td style="width:123px;">MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Glo lysis buffer</td>
			<td style="width:157px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Renilla Glo luciferase assay system</td>
			<td style="width:157px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">96-well assay plate (white)</td>
			<td style="width:157px;">Costar</td>
			<td style="width:123px;">3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Modulus microplate luminometer</td>
			<td style="width:157px;">Turner Microsystems</td>
			<td style="width:123px;">998-9300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling the lifecycle of ebola virus under biosafety level 2 conditions with virus-like particles containing tetracistronic minigenomes

Vírus Ebola causar febres hemorrágicas graves em seres humanos e primatas não-humanos, com letalidade de até 90%. Não há vacinas aprovadas ou tratamentos específicos para a doença causada por estes vírus, e trabalhar com os vírus Ebola infecciosas é restrito a nível de biossegurança 4 laboratórios, limitando significativamente a investigação sobre estes vírus. Ciclo de vida de sistemas de modelagem modelo de ciclo de vida do vírus sob nível de biossegurança 2 condições; no entanto, até recentemente, esses sistemas têm sido limitados a tanto aspectos individuais do ciclo de vida do vírus, ou um único ciclo infeccioso. Minigenomas Tetracistronic, que consistem em vírus Ebola regiões não-codificadoras, um gene repórter, e três genes do vírus Ebola, envolvidos na morfogénese de brotamento, e entrada (VP40, GP 1,2, e VP24), pode ser usado para produzir a replicação e transcrição partículas -competent semelhantes a vírus (trVLPs) que contêm estas minigenomas. Estes trVLPs pode infectar continuamente células que expressam o Ebolaproteínas do vírus responsáveis ​​pela replicação do genoma e transcrição, o que nos permite modelar com segurança múltiplos ciclos infecciosos sob nível de biossegurança 2 condições. É importante notar que os componentes virais deste sistemas são exclusivamente derivados de vírus Ebola e não de outros vírus (como é, por exemplo, o caso em sistemas que utilizam vírus pseudotipados) e VP40, VP24 GP 1,2 e não são sobre-expresso neste sistema , tornando-a ideal para o estudo da morfogênese, a brotação ea entrada, apesar de outros aspectos do ciclo de vida do vírus, tais como replicação e transcrição do genoma também podem ser modelados com este sistema. Portanto, o ensaio trVLP tetracistronic representa o sistema de modelagem de ciclo de vida mais abrangente disponível para os vírus Ebola, e tem um tremendo potencial para uso na investigação da biologia do vírus Ebola no futuro. Aqui, nós fornecemos informações detalhadas sobre a utilização deste sistema, bem como sobre os resultados esperados.

A transfecção de células 293 produtores com plasmídeos de expressão que codifica as proteínas do vírus Ebola nucleocapsídeo NP, VP35, VP30, e L, um minigenoma tetracistronic e os acessórios T7 resultados polimerase em minigenoma replicação e transcrição e atividade repórter que é facilmente detectável em 72 horas (Figura 6 ). É importante notar que a actividade repórter observado (10 5,6 unidades de luminescência relativa (RLU)) excede a de um controlo negativo em que o plasmídeo de expressão que codifica L foi omitido da transfecção (10 3 RLU) por mais do que 2 logs. O baixo nível de actividade observada mesmo na ausência de L é provavelmente devido a um promotor críptico no plasmídeo de minigenoma. As células alvo infectadas com trVLPs partir do sobrenadante de células produtoras realmente apresentam níveis de actividade repórter ligeiramente aumentada quando comparada com células produtoras, e alcançar valores entre 10 6 e 10 7 RLUs, dependendo da passagem. Em contraste, wuando o sobrenadante de células produtoras de controlo -L se subculturas em células alvo (que expressam toda a proteína da nucleocápside, incluindo L), a actividade repórter não exceda o ruído do luminómetro (cerca de 10 RLU 2) de fundo. O ensaio trVLP tetracistronic pode ser utilizado para estudar o ciclo de vida do vírus Ebola. Por exemplo, a infecção de células 293 com trVLPs é dependente da presença de factores de fixação, tais como Tim-1 16, o qual tem de ser fornecida em trans nestas células. Por conseguinte, num ensaio de trVLP tetracistronic uma queda na actividade repórter nas células-alvo de cerca de 100 vezes é observado na ausência de Tm-1 (Figura 7A). O papel das proteínas específicas (virais ou celulares) no ciclo de vida do vírus também pode ser avaliada utilizando a tecnologia de ARNi em conjunto com esta abordagem. Como um exemplo, ARNi mediado regulação descendente dos resultados L em uma queda na actividade repórter de cerca de 100 vezes, o que reflecte o papel fundamental de L emreplicação e transcrição (Figura 7B) 7. Além disso, é possível manipular directamente o minigenoma de avaliar o efeito de mutações no ciclo de vida do vírus. Como um exemplo, quando VP24-expressão do minigenoma é abolida através da introdução de três codões de paragem imediatamente a jusante do codão de iniciação, a actividade repórter nas células produtoras não é alterada drasticamente; contudo, a actividade repórter nas células-alvo é reduzida em cerca de 20 vezes após uma passagem, e de 400 vezes após duas passagens, o que indica um papel de VP24 na produção de trVLPs infecciosos (Figura 7C) 15. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 Estrutura do genoma do vírus Ebola, assim como minigenomas monocistrónicas e tetracistronic. Regiões para a proteína do vírus Ebola codificação são mostrados como vermelho (NP,VP35, VP30, e L), amarelo (VP40 e VP24) ou azul (GP 1,2) caixas. Regiões não codificante (NCRs) são mostrados em verde, com as regiões líder e reboque indicados. O subscrito indica que NCR viral foi usado para unir as regiões de codificação. A região de codificação para o repórter (REP) é mostrado em roxo. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 Ensaio de minigenoma monocistrónicas. Células são transfectadas com os plasmídeos de expressão para as proteínas da nucleocápside do vírus Ebola (NP, VP35, VP30, L), de um minigenoma monocistrónicas (mg) e a polimerase de T7. O minigenoma é inicialmente transcrita pela polimerase de T7 (a) para dentro de um RNA de minigenoma unencapsidated na mesma orientação do genoma viral (ARNv), que é então encapsidado pela NP (b). Este encapsidado ARNv é replicado por meio de um RNA de minigenoma complementar (cRNA) intermediate (c), e, em seguida transcrita em mRNAs repórter (d) que são traduzidos em proteína repórter (e). <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. ensaio trVLP com um minigenoma monocistrónicas. Células são transfectadas com os plasmídeos de expressão para as componentes do ensaio de minigenoma (as proteínas da nucleocápside do vírus Ebola NP, VP35, VP30, L, um minigenoma monocistrónicas e a polimerase de T7), bem como VP40, um GP , 2 e VP24. Isto leva à formação de trVLPs que incorporam nucleocápsides contendo minigenoma (f). Estes trVLPs pode infectar as células-alvo (g), que são ou pretransfected com plasmídeos de expressão para NP, VP35, VP30, e L (em cima), o que resulta em replicação e transcrição secundários (d), que conduz a expressão de repórter (e), ou ingénuo células-alvo (em baixo), resultando na transcrição primária da minigenomes (h), também levando a expressão repórter (e). <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. ensaio trVLP com um minigenoma tetracistronic. Células são transfectadas com os plasmídeos de expressão para as proteínas da nucleocápside do vírus Ebola (NP, VP35, VP30, L), de um minigenoma tetracistronic (mg) e a polimerase de T7. Transcrição inicial (a), a encapsidação (b), a replicação do genoma (c) e de transcrição (d), bem como a tradução (e) ocorrer num ensaio de minigenoma monocistrónicas. No entanto, para além de ARNm repórter, os mRNAs para VP40, VP24 GP 1,2 e são também transcrito a partir do minigenoma tetracistronic, resultando na formação de trVLPs (f). Estes trVLPs infectar as células-alvo que foram pretransfected com os plasmídeos de expressão para as proteínas da nucleocápside NP, VP35, VP30 e L, bem como o vírus Ebola celularfactor de fixação Tim-1, resultando na replicação do genoma e da transcrição, e a produção de trVLPs que podem ser utilizados para infectar células alvo frescos. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5 Tempo de um ensaio trVLP tetracistronic por 3 passagens consecutivas. Os dias de células de sementeira (s), a transfecção de células (t), infectando as células (i), troca de meio (c) e a colheita de células e trVLPs (h) são indicada por três passagens consecutivas (indicado pelas setas). <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6 níveis típicos da atividade de repórter observada em um ensaio trVLP tetracistronic. Um ensaio trVLP tetracistronic foi realizada ao longo de 5 passagens seguindo o protocolool descrito neste artigo. Como um controlo negativo, o plasmídeo de expressão que codifica L foi omitido (-L) a partir da transfecção de células produtoras p0. As células alvo em passagens P1 a P5 foram transfectadas com os plasmídeos de expressão para todas as proteínas da nucleocápside, incluindo L. O ruído de fundo é o luminómetro indicadas como uma linha tracejada. Médias e desvios-padrão de 4 repetições biológicas de três experimentos independentes são mostrados. <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7 Avaliando o impacto de vários fatores virais e celulares no ciclo de vida viral usando trVLPs tetracistronic. (A) Tim-1 como um factor de fixação. Células alvo que foram pretransfected com plasmídeos de expressão que codificam para as proteínas da nucleocápside e com ou sem um plasmídeo que codifica para Tm-1 (descrito em 15) foram infectados com tettrVLPs racistronic. 72 hr atividade repórter infecção pós em células alvo p1 foi determinada. As médias e desvios-padrão de 4 repetições biológicas de quatro experimentos independentes são mostrados. (B) Efeito do RNAi knockdown de L na replicação do genoma e transcrição. Células-alvo que foram pretransfected com plasmídeos de expressão para os componentes nucleocapsídeo, tim-1 e miRNAs contra L (anti-G) ou uma proteína não relacionada (anti-GFP) (descrito em 15) foram infectados com trVLPs tetracistronic. 72 hr atividade repórter infecção pós em células alvo p1 foi determinada. As médias e desvios-padrão de cinco repetições biológicos de dois experimentos independentes são mostrados. (C) Efeito de mutações no minigenoma em trVLP infectividade. Um ensaio trVLP tetracistronic foi realizado usando um tipo selvagem minigenoma (4cis-WT) ou um minigenoma em que três codões de paragem foram introduzidos imediatamente após o codão de iniciação de VP24, que suprime o expressandof esta proteína, mas introduzindo apenas mudanças mínimas para o minigenoma em relação ao comprimento, composição de ácido nucleico, estruturas secundárias etc atividade Reporter em P0, P1 e P2 foi medida 72 horas após a transfecção / infecção. Médias e desvios padrão de três repetições biológicas de três experimentos independentes são mostrados. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;width:115px;"></td><td style="width:127px;"> Células produtoras (P0) </td><td style="width:180px;"> As células-alvo (P1 e superior) </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-NP </td><td> 125 </td><td> 125 </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-VP35 </td><td> 125 </td><td> 125 </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-VP30 </td><td> 75 </td><td> 75 </td></tr><tr height="19"><td height = &quot;19&quot; style = &quot;height: 19px;&quot;&gt; pCAGGS-L </td><td> 1000 </td><td> 1000 </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> p4cis-vRNA-RLuc </td><td> 250 </td><td> - </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-T7 </td><td> 250 </td><td> - </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-Tim1 </td><td> - </td><td> 250 </td></tr></tbody></table> Tabela 1 de ADN equivale a transfecção. A quantidade de cada um dos plasmídeos necessários para a transfecção de células produtoras e alvo é mostrado em ng por poço de uma placa de 6 poços. Todos os plasmídeos estão descritos em Watt et al 15.

Watch this Scientific Journal Video about Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes at JoVE.com

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Trabalho com vírus Ebola infecciosas é restrito a nível de biossegurança 4 laboratórios. Tetracistronic replicação e transcrição do vírus-competente como partículas contendo minigenoma (trVLPs) representam um sistema de modelagem do ciclo de vida que nos permite modelar com segurança múltiplos ciclos infecciosos sob nível de biossegurança 2 condições, baseando-se exclusivamente em componentes vírus Ebola.

Modelando o ciclo de vida do vírus Ebola Sob Nível de Biossegurança 2 condições com partículas semelhantes a vírus contendo Tetracistronic minigenomas

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

modeling-lifecycle-ebola-virus-under-biosafety-level-2-conditions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

35.9K visualizações.  National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health.  Trabalho com vírus Ebola infecciosas é restrito a nível de biossegurança 4 laboratórios. Tetracistronic replicação e transcrição do vírus-competente como partículas contendo minigenoma (trVLPs) representam um sistema de modelagem do ciclo de vida que nos permite modelar com segurança múltiplos ciclos infecciosos sob nível de biossegurança 2 condições, baseando-se exclusivamente em componentes vírus Ebola. 

Vídeo: Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral subtypes2. Human pandemics of flu originally stem from AIVs3. Many fatal human cases during the H5N1 outbreaks in recent years were reported. Lately, a new AIV related strain swept through the human population, causing the 'swine flu epidemic'4. Although human trading and transportation activity seems to be responsible for the spread of highly pathogenic strains5, dispersal can also partly be attributed to wild birds6, 7. However, the actual reservoir of all AIV strains is wild birds.
In reaction to this and in face of severe commercial losses in the poultry industry, large surveillance programs have been implemented globally to collect information on the ecology of AIVs, and to install early warning systems to detect certain highly pathogenic strains8-12. Traditional virological methods require viruses to be intact and cultivated before analysis. This necessitates strict cold chains with deep freezers and heavy biosafety procedures to be in place during transport. Long-term surveillance is therefore usually restricted to a few field stations close to well equipped laboratories. Remote areas cannot be sampled unless logistically cumbersome procedures are implemented. These problems have been recognised13, 14 and the use of alternative storage and transport strategies investigated (alcohols or guanidine)15-17. Recently, Kraus et al.18 introduced a method to collect, store and transport AIV samples, based on a special filter paper. FTA cards19 preserve RNA on a dry storage basis20 and render pathogens inactive upon contact21. This study showed that FTA cards can be used to detect AIV RNA in reverse-transcription PCR and that the resulting cDNA could be sequenced and virus genes and determined.
In the study of Kraus et al.18 a laboratory isolate of AIV was used, and samples were handled individually. In the extension presented here, faecal samples from wild birds from the duck trap at the Ottenby Bird Observatory (SE Sweden) were tested directly to illustrate the usefulness of the methods under field conditions. Catching of ducks and sample collection by cloacal swabs is demonstrated. The current protocol includes up-scaling of the work flow from single tube handling to a 96-well design. Although less sensitive than the traditional methods, the method of FTA cards provides an excellent supplement to large surveillance schemes. It allows collection and analysis of samples from anywhere in the world, without the need to maintaining a cool chain or safety regulations with respect to shipping of hazardous reagents, such as alcohol or guanidine.

A method to preserve, detect and sequence RNA from Avian Influenza Viruses was validated and extended using natural faecal samples from birds. This technique removes the necessity of maintaining a cool chain and handling of infectious viruses and can be applied in a 96-well high-throughput setup.

Vigilância da gripe aviária com FTA Cards: Métodos de campo, de Biossegurança, e questões de transporte Resolvido

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Isolamento de Células endoteliais da veia umbilical humana e sua utilização no estudo de transmigração de Neutrófilos sob condições de fluxo

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Mimicking and exploiting virus properties and physicochemical and physical characteristics holds promise to provide solutions to some of the world's most pressing challenges. The sheer range and types of viruses coupled with their intriguing properties potentially give endless opportunities for applications in virus-based technologies. Viruses have the ability to self- assemble into particles with discrete shape and size, specificity of symmetry, polyvalence, and stable properties under a wide range of temperature and pH conditions. Not surprisingly, with such a remarkable range of properties, viruses are proposed for use in biomaterials 9, vaccines 14, 15, electronic materials, chemical tools, and molecular electronic containers4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
In order to utilize viruses in nanotechnology, they must be modified from their natural forms to impart new functions. This challenging process can be performed through several mechanisms including genetic modification of the viral genome and chemically attaching foreign or desired molecules to the virus particle reactive groups 8. The ability to modify a virus primarily depends upon the physiochemical and physical properties of the virus. In addition, the genetic or physiochemical modifications need to be performed without adversely affecting the virus native structure and virus function. Maize rayado fino virus (MRFV) coat proteins self-assemble in Escherichia coli producing stable and empty VLPs that are stabilized by protein-protein interactions and that can be used in virus-based technologies applications 8. VLPs produced in tobacco plants were examined as a scaffold on which a variety of peptides can be covalently displayed 13. Here, we describe the steps to 1) determine which of the solvent-accessible cysteines in a virus capsid are available for modification, and 2) bioconjugate peptides to the modified capsids. By using native or mutationally-inserted amino acid residues and standard coupling technologies, a wide variety of materials have been displayed on the surface of plant viruses such as, Brome mosaic virus 3, Carnation mottle virus 12, Cowpea chlorotic mottle virus 6, Tobacco mosaic virus 17, Turnip yellow mosaic virus 1, and MRFV 13.

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

A method to analyze the solvent accessibility of the thiol group of cysteine residues of Maize rayado fino virus (MRFV)-virus-like particles (VLPs) followed by a peptide cross-linking reaction is described. The method takes advantage of the availability of several chemical groups on the surface of the VLPs that can be targets for specific reactions.

Análise da acessibilidade de solvente de resíduos de cisteína em<em&gt; Milho rayado fino vírus</em&gt; Partículas semelhantes a vírus produzidas em<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Plantas e cross-linking de peptídeos para VLP

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor treatment options exist. The hallmarks of these laboratories are: custom-designed airtight doors, dedicated supply and exhaust airflow systems, a negative-pressure environment, and mandatory use of positive-pressure (&#8220;space&#8221;) suits. The risk for laboratory specialists working with highly pathogenic agents is minimized through rigorous training and adherence to stringent safety protocols and standard operating procedures. Researchers perform the majority of their work in BSL-2 laboratories and switch to BSL-4 suit laboratories when work with a high-consequence pathogen is required. Collaborators and scientists considering BSL-4 projects should be aware of the challenges associated with BSL-4 research both in terms of experimental technical limitations in BSL-4 laboratory space and the increased duration of such experiments. Tasks such as entering and exiting the BSL-4 suit laboratories are considerably more complex and time-consuming compared to BSL-2 and BSL-3 laboratories. The focus of this particular article is to address basic biosafety concerns and describe the entrance and exit procedures for the BSL-4 laboratory at the NIH/NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Such procedures include checking external systems that support the BSL-4 laboratory, and inspecting and donning positive-pressure suits, entering the laboratory, moving through air pressure-resistant doors, and connecting to air-supply hoses. We will also discuss moving within and exiting the BSL-4 suit laboratories, including using the chemical shower and removing and storing positive-pressure suits.

Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Although researchers are generally knowledgeable about procedures and safety precautions required for biosafety level 1 or 2 (BSL-1/2) experiments, they may not be familiar with experimental procedures in BSL-4 suit laboratories. This article provides a detailed visual demonstration of BSL-4 suit laboratory systems check, laboratory entry, movement, and exit procedures.

Precauções de segurança e Procedimentos Operacionais em um (A) BSL-4 laboratoriais: 1. Nível de Biossegurança 4 Suit Laboratório Suíte entrada e saída Procedimentos

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In Vitro e In Vivo modelo para estudar a adesão bacteriana para o Vaso de parede em condições de escoamento

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-imunoprecipitação da proteína do rato Mx1 com a nucleoproteína do vírus da gripe A

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Análise de Linfócitos extravasamento Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo do Sangue-Cérebro humano Barreira

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase reporter, using a simple transfection procedure of the widely available HEK-293T cell line. Once formed and released from producer cells, these pseudovirions incorporate a luciferase reporter gene. Since they only contain the heterologous coronavirus spike protein on their surface, the particles behave like their native coronavirus counterparts for entry steps. As such, they are the excellent surrogates of native virions for studying viral entry into host cells. Upon successful entry and infection into target cells, the luciferase reporter gets integrated into the host cell genome and is expressed. Using a simple luciferase assay, transduced cells can be easily quantified. An important advantage of the procedure is that it can be performed in biosafety level 2 (BSL-2) facilities instead of BSL-3 facilities required for work with highly pathogenic coronaviruses such as Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV). Another benefit comes from its versatility as it can be applied to envelope proteins belonging to all three classes of viral fusion proteins, such as the class I influenza hemagglutinin (HA) and Ebola virus glycoprotein (GP), the class II Semliki forest virus E1 protein, or the class III vesicular stomatitis virus G glycoprotein. A limitation of the methodology is that it can only recapitulate virus entry steps mediated by the envelope protein being investigated. For studying other viral life cycle steps, other methods are required. Examples of the many applications these pseudotype particles can be used in include investigation of host cell susceptibility and tropism and testing the effects of virus entry inhibitors to dissect viral entry pathways used.

Here, we present a protocol to generate pseudotyped particles in a BSL-2 setting incorporating the spike protein of the highly pathogenic viruses Middle East respiratory syndrome and severe acute respiratory syndrome coronaviruses. These pseudotyped particles contain a luciferase reporter gene allowing quantification of virus entry into target host cells.

Produção de partículas Pseudotyped para estudar a alta patogenicidade coronavírus em uma configuração de nível 2 de biossegurança

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

Aplicação de consistente massagem-como perturbações em bezerros do mouse e monitoramento das mudanças de pressão intramuscular resultante

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

Teste in vitro ELISA para avaliar a potência da vacina antirrábica

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...