Este trabalho foi apoiado por FWO-Vlaanderen, o projeto IOF IOF10 / StarTT / 027 e da Universidade de Ghent Especial Research Grant BOF12 / GOA / 014.

Nota: O seguinte protocolo de transfecção e co-imunoprecipitação é estabelecida para um formato de placa de Petri 9 cm. Outros formatos também são possíveis após a escala do protocolo. 1. Sementeira do rim embrionário humano (HEK) Células 293T <ol><li> Semente da células HEK293T um dia antes da transfecção a 1,2 x 10 6 culas por 9 centímetros de Petri em 12 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de vitela, 2 mM de L-glutamina, 0,4 mM de Na-piruvato, 0,1 aminoácidos não essenciais mM, 100 U / ml de penicilina e 0,1 mg / ml de estreptomicina. </li><li> Crescer as células 16 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Inspeccione visualmente a morfologia e a viabilidade das células com um microscópio de luz invertida antes da transfecção. As células necessitam de ser sub-confluente para a eficiência de transfecção óptima. </li></ol> 2. O cálcio-fosfato de transfecção de células HEK293T Nota: Use 0,5-1 mg de pCAXL-NP ou vazio plasmídeo pCAXL em combinação com 1-3 mg de pCAXL-Mx1 por 9 centímetros prato. Use uma quantidade igual de DNA total plasmídeo em todas as amostras; ajustar com plasmídeo vazio, se necessário. <ol><li> Preparar os seguintes tampões de transfecção: <ol><li> Prepare de Tris-EDTA (TE) com concentrações de 1,0 mM de Tris-HCl, pH 8,0 e EDTA 0,1 mM, pH 8,0. </li><li> Prepare BS / HEPES com concentrações de 25 mM de HEPES (5,96 g / L, 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico), NaCl 274 mM (16 g / l), KCl 10 mM (0,74 g / L), NaHPO 4 1,5 mM · 12H 2 O (0,5 g / L) e 11,1 mM de dextrose (2 g / L). Ajustar o pH a 7,05. </li><li> Prepare CaCl2 / com as concentrações de HEPES 1,25 M CaCl 2 2H 2 O (183,8 g / L) e tampão HEPES 125 mM (29,79 g / L). Ajustar o pH a 7,05 com NaOH. </li></ol></li><li> Aquecer os buffers de transfecção, a 37 ° C antes da utilização. </li><li> Preparar as amostras diluindo o plasmídeo de ADN de plasmídeo em 600 ul de TE.Preparar estas misturas em poços de uma placa de 6 poços. </li><li> Adicionar 150 mL de CaCl2 / HEPES de forma sábia soltar para as amostras de plasmídeos e misture pipetando três vezes para cima e para baixo. </li><li> Preparar a solução de transfecção por adição gota a gota, a solução de plasmídeo (DNA TE + + CaCl 2 / HEPES; 750 ul) a 750 ul de tampão de BS / HEPES fornecidos em uma nova placa de 6 poços. Distribuir a solução de plasmídeo uniformemente sobre o poço de tampão contendo completa BS / HEPES. </li><li> Agitar a solução de transfecção sobre um agitador de placas durante 90 segundos a 1000 RPM. </li><li> Incubar a mistura durante 5 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar a solução de transfecção (1,5 ml) gota a gota às células. Usar uma micropipeta P1000 a escorrer a solução de transfecção nas células. Dispersar a mistura sobre a completa nove centímetros de Petri e agitar a placa muito suavemente. </li><li> Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 6 h. Em seguida, retire o meio por aspiração e substitua imediatamente with 12 ml de meio fresco, pré-aquecido. Adicionar cuidadosamente a meio fresco às células para evitar a separação de células. Para isto, segurar a ponta da pipeta contra o lado do poço e suavemente empurrar para fora do meio. </li><li> Incubar as células durante mais 16 horas adicionais a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol> 3. Co-imunoprecipitação Nota: Execute o co-imunoprecipitação 24 horas após a transfecção. <ol><li> Preparação do tampão de baixo lise sal e tampão de lavagem de alta sal. <ol><li> Prepara-se uma solução estoque de 2 M de N-etilmaleimida (NEM) pesando a quantidade de NEM e dissolvendo-o em etanol absoluto. Preparar a solução estoque NEM fresco antes de usar. CUIDADO: NEM é muito tóxico, preparar e usar esta solução estoque em um exaustor. </li><li> Preparar tampão de lise de sal baixo a concentrações de 50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM de NaCl, 5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 1% de NP40 e um cocktail de inibidores de protease (1 dissolver mesat em 50 ml de tampão de lise). Adicionar NEM até uma concentração final de 25 mM (isto é, diluir 1:80). Mantenha no gelo após a adição dos inibidores da protease e NEM. Nota: Sempre adicionar os inibidores da protease e NEM imediatamente antes da utilização. </li><li> Preparar um tampão de lavagem de alto teor salino a concentrações de 50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 500 mM, EDTA 5 mM e 1% de NP40. Note-se que o tampão de lavagem de alto teor salino não contém NEM. </li></ol></li><li> Preparação de lisados ​​celulares. <ol><li> Remover o meio e lava-se as células com 2 ml de fosfato de gelo frio tamponado salino (PBS). Adicionar muito suavemente o tampão de lavagem, como células HEK293T desprendem facilmente. </li><li> Retire o PBS e adicionar 600 mL de tampão de lise sal baixo gelada por 9 centímetros de Petri. </li><li> Incubar as placas durante 20 min em gelo. Certifique-se de que as placas são mantidas horizontal, para assegurar a cobertura completa da superfície da placa com tampão de lise. Agitar suavemente as placas a cada 5 minutos. </li><li> Recolhe-se o lisado celular numa microcentrífuga de 1,5 mltubo e centrifuga-se durante 3 min a 4 ° C e 16.000 xg para sedimentar a fracção insolúvel. </li><li> Transferir a fracção solúvel, isto é, o lisado de células para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e manter em gelo. Imediatamente continuar com o protocolo de co-imunoprecipitação, para evitar a dissociação das proteínas que interagem. Executar todas as etapas seguintes, tanto quanto possível em gelo ou a 4 ° C para limitar a actividade proteolítica nos lisados. </li></ol></li><li> Geração de complexos imunes. Nota: Neste passo, a proteína de interesse está ligado pelo anticorpo apropriado. Para estudar a interacção NP-Mx1, utilizar um anticorpo monoclonal anti-NP do rato. <ol><li> Para cada amostra, misturar 135 ul de lisado com 2 ul de anticorpo monoclonal anti-NP e 113 ul de tampão de lise de sal baixo (volume total de 250 uL). Armazenar o lisado remanescente à temperatura de -20 ° C para posterior análise, tais como Western blotting, para documentar os níveis de expressão da intera supôsparceiros ction nas células transfectadas. Nota: Em alternativa, medir a concentração de proteína do ligado (por exemplo, com o reagente de Bradford) e utilizar uma quantidade fixa de proteína total, por exemplo, 400 ug, para cada lisado. </li><li> Incubar a mistura de anticorpo-lisado durante 3 horas numa roda giratória a 4 ° C. Este passo pode ser estendido para uma incubação de um dia para o outro. </li></ol></li><li> Preparação dos grânulos de proteína G. Nota: As esferas de proteína G são transportados e armazenados em etanol a 20% para a preservação. O grânulo-lama é normalmente constituída por 50% de partículas e estes grânulos têm de ser lavadas antes de serem usadas para imunoprecipitar os complexos imunes. <ol><li> Utilizar 50 ul de pérolas, isto é, 100 ul de talão-lama, para cada amostra. Lava-se a quantidade de esferas necessárias para todas as amostras do ensaio de co-imunoprecipitação de um tubo. Corte a ponta de uma ponta de pipeta de 1 ml para facilitar a pipetagem do grânulo-lama. </li><li> Centrifugar a proteína G talão-lama em 8.000 xg e 4 ° C durante 30 seg. Remover a solução de etanol e adicionar um volume igual de tampão de lise de baixa sal. Centrifugar a proteína G do grânulo-suspensão a 8000 xg e 4 ° C durante 30 seg e o sobrenadante remover suavemente. Repita este passo de lavagem 3 vezes. Nota: O tampão de lise de baixa sal usado para lavar as pérolas não necessitam de conter inibidores da protease ou NEM. </li><li> Estimar o volume de proteína G pérolas e adicione um volume igual de tampão baixo lise sal para fazer um novo 50% grânulo-lama em tampão baixo lise sal. </li><li> Para cada amostra, transferir 100 ul de talão-suspensão em um tubo de 1,5 ml fresco microcentrífuga e armazenar em gelo até à utilização. Ter cuidado para voltar a suspender o grânulo-lama antes de se dividir, como estas pérolas sedimentam rapidamente para o fundo do tubo. </li></ol></li><li> Immunoprecipitation dos complexos imunes pela proteína G pérolas e sua eluição. <ol><li> Antes de utilizar as esferas de proteína G para a imunoprecipitação, todos os tubos de centrifugação de 30 segundos a 8000 xg e 4 ° C everificar, por inspecção visual de que existe uma quantidade igual de pérolas presente em todas as amostras. Se for necessário ajustar a quantidade de grânulos em algumas das amostras e centrifugar novamente. Descartar o sobrenadante. Tenha cuidado para não perturbar as proteínas G perla peletizadas. </li><li> Resumidamente, centrifugar os complexos imunes (isto é., Os lisados ​​com anticorpo, 250 ul) durante 30 segundos a 8000 xg e 4 ° C para recolher a amostra completa, na parte inferior do tubo. Transferir os complexos imunes para as esferas de proteína G (50 uL). </li><li> Incubar 60 min sobre uma roda giratória a 4 ° C. Não incubar estes complexos imunitários mais do que 75 minutos com os grânulos para reduzir a ligação não específica de proteínas para as esferas de proteína G. </li><li> Centrifuga-se as esferas de proteína G (com complexos imunes ligados) durante 30 segundos a 8000 xg e 4 ° C e remove-se os sobrenadantes. Tenha cuidado para não perturbar as proteínas G perla peletizadas. Opcional: armazenar estes sobrenadantes a 4 ° C ou -20 ° C para posterior análise,por exemplo, para estimar a quantidade de proteína não ligada. </li><li> Lavam-se as esferas de proteína G para aproximadamente 5 min com 900 ul de tampão de lise de sal elevado. Certifique-se de que as pérolas são completamente ressuspenso no tampão de lavagem para a lavagem óptima. Centrifuga-se as esferas de proteína G durante 30 segundos a 8000 xg e 4 ° C e desprezar o sobrenadante. Repita este passo de lavagem 4 vezes. Tenha cuidado para não perturbar as esferas de proteína G peletizadas para evitar a perda de material imunoprecipitado. </li><li> Após o último passo de lavagem, adicionar 50 ul de tampão de amostra Laemmli 2x para os grânulos e aquecer a suspensão durante 10 min a 95 ° C para eluir as (co) proteínas imunoprecipitadas. <ol><li> Preparar 10 ml de tampão de Laemmli 6x com 1 g de dodecil sulfato de sódio, 3,5 ml de glicerol, 3,5 ml de 1 M de Tris-HCl a pH 6,8 e 420 ul de β-mercaptoetanol. Ajustar para um volume total de 10 ml por adição de água destilada. Dilui-se 3 vezes em água destilada para obter tampão Laemmli 2x. CUIDADO: &amp;# 946; mercaptoetanol é tóxico, preparar e usar tampão Laemmli em um exaustor. </li></ol></li><li> Após o aquecimento, centrifugar os grânulos de proteína G durante 30 segundos a 8000 xg e armazenar as amostras a 4 ° C (a curto prazo) ou -20 ° C (a longo prazo). </li></ol></li></ol> 4. Analisar o (co-) imunoprecipitou Proteínas <ol><li> Visualizar as proteínas presentes no ligado celular e o eluato de co-imunoprecipitação por SDS-PAGE e western blotting 20 21,22. Tipicamente carregar metade do eluato em gel de Laemmli. Tenha cuidado para não perturbar as esferas proteína G peletizadas quando recolha de amostras para carregamento de gel. Mx1 e expressão NP foram revelados com um anti-Mx1 e anticorpo anti-NP, respectivamente 14. As bandas foram detectadas com base quimioluminescência-HRP e um programador de película de raios-X. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O estudo da interacção entre proteínas antivirais e seus alvos virais é muito importante para compreender os detalhes do mecanismo antiviral destas proteínas. Isso pode dar novos insights sobre como os vírus e seus hospedeiros co-evoluído e ser a base para o desenvolvimento de novas estratégias antivirais. O protocolo de co-imunoprecipitação optimizado descrito aqui permite o estudo da interacção entre a proteína de rato e a sua Mx1 alvo viral, a proteína NP da gripe. O aspecto mais importante deste protoc...

Resistência myxovirus (Mx) proteínas são uma parte importante da defesa imune inata contra patógenos virais. Estas proteínas são grandes GTPases dinamina-like que são induzidos por tipo I e tipo III interferons. Os genes Mx correspondentes estão presentes em quase todos os vertebrados em uma ou várias cópias e dos seus produtos de genes inibir uma vasta variedade de vírus, incluindo Orthomyxoviridae (por exemplo., O vírus da gripe), Rhabdoviridae (por exemplo., O vírus da estomatite vesicular), Bunyaviridae (por exemplo. , La Crosse vírus) e Retroviridae (por exemplo, vírus da imunodeficiência humana-1) 1-4. Não está claro como estas proteínas reconhecer uma ampla gama de vírus tais, sem qualquer sequência primária compartilhada aparente motivos na estes vírus. Analisando a interação de proteínas Mx com seus alvos virais, potencialmente envolvendo complexos de ordem superior com outros fatores de célula hospedeira, irá ajudar a compreender os mecanismos moleculares tchapéu evoluíram na corrida armamentista entre os vírus e seus hospedeiros. A interação entre as proteínas de mamíferos e Mx alvos virais tem sido estudado mais extensivamente para MxA humano. MxA humano pode inibir a replicação de muitos vírus, incluindo o vírus influenza A orthomyxovirus e vírus Thogoto. MxA liga os complexos de ribonucleoproteína vírus Thogoto (vRNPs), impedindo assim a sua entrada nuclear, o que resulta no bloqueio da infecção 5. Esta interacção entre MXA e Thogoto vRNPs vírus tem sido demonstrado com a co-sedimentação e de co-imunoprecipitação experiências 6-9. Como proteínas Mx dificultar vírus da gripe A é menos clara. Um problema principal é que não é fácil de demonstrar uma interacção entre uma proteína Mx e um produto de gene da influenza. Um relatório demonstrou uma interação entre MxA humana e da proteína NP em influenza A células infectadas pelo vírus 10. Essa interação só poderia ser demonstrado por co-immunoprecipitation se as células terem sido tratadas com as de reticulação reagentes ditiobis (propionato de succinimidilo), antes de lise, sugerindo que a interacção é transitória e / ou fraco. Estudos mais recentes têm mostrado que a sensibilidade diferencial Mx de estirpes diferentes de influenza A é determinado pela origem da proteína NP 11,12. Em linha com esta, os vírus da gripe A pode escapar do controle, em parte, Mx por mutação resíduos específicos na proteína NP 13. Isto sugere que o principal alvo dos vírus influenza para acolhimento Mx é a proteína NP, provavelmente NP montados em complexos vRNP. No entanto, nenhum desses estudos mais recentes demonstraram uma interacção entre a gripe NP ou vRNP e MxA quer humano ou de ratinho Mx1. Recentemente, demonstrou, pela primeira vez, uma interacção entre o NP de influenza e da proteína Mx1 rato com um protocolo de co-imunoprecipitação optimizado 14, a qual é descrita aqui em detalhe. Em geral, a co-immunoprecipitation é uma das abordagens bioquímicas mais freqüentemente utilizados para investigar as interações proteína-proteína. Esta técnica é muitas vezes preferido ao longo técnicas alternativas, por exemplo, de leveduras duplamente híbrido, uma vez que permite investigar interacções proteína-proteína no seu ambiente natural. Co-imunoprecipitação pode ser levada a cabo em proteínas expressas endogenamente, se os anticorpos contra as proteínas de interesse estão disponíveis. Alternativamente, as proteínas de interesse podem ser expressos na célula através de transfecção ou infecção e um tag de afinidade pode ser usado. Além das vantagens acima mencionadas, o protocolo de co-imunoprecipitação descrita permite a detecção de interacções proteína fracos e / ou transientes. O principal componente neste protocolo optimizado é a adição de N-etilmaleimida (NEM) em tampão de lise celular. NEM é um reagente de alquilação, que reage com grupos tiol livres tais como presentes em cisteínas, a um pH de 6,5-7,5, para formar uma tio-éster estável(Figura 1). A pH mais elevado, a NEM também pode reagir com grupos amino ou sofrer hidrólise 15. NEM é normalmente utilizado para bloquear os grupos tiol livres, a fim de evitar a formação de ligações dissulfureto ou inibir a actividade enzimática. Por exemplo, a NEM é muitas vezes usado para bloquear enzimas desumoylating, que são proteases de cisteína. No protocolo de co-imunoprecipitação descrita, NEM foi inicialmente incluído no tampão de lise, porque tinha sido relatado que o sumoilação de proteínas de influenza podem influenciar a interacção entre as proteínas virais 16. Inesperadamente, a adição de NEM provou ser a chave para documentar a interacção entre NP de influenza e rato Mx1 por co-imunoprecipitação. Não está claro porque a adição de NEM é crucial para detectar a interacção NP-Mx1. Possivelmente, a interacção é muito transiente e / ou fraco. NEM poderia estabilizar a interacção, por exemplo, ao preservar uma conformação específica de Mx1, uma proteína viral, ou ainda um terceiro compo desconhecidonente. Tal efeito estabilizante de NEM foi observada antes, por exemplo, para a interacção entre a ribonucleótido-redutase M1 e o seu inibidor gemcitabina (F2dC) 17. Mx1 e NP ambos contêm múltiplos resíduos de cisteína que poderiam ser modificados por NEM. Por exemplo, um estudo recente da Rennie et al. Demonstraram que uma stalkless MxA variante contém três resíduos de cisteína expostos solventes que podem ser modificados por iodoacetamide. Mutação destes resíduos para serines não influenciou a atividade enzimática da MxA, mas impediu a agregação mediada por dissulfeto 18. À medida que estas cisteínas são conservadas em Mx1, isto sugere que os análogos em cisteínas Mx1 pode ser modificada por NEM e, como tal influência sua conformação ou solubilidade. Além disso, a NEM também pode afectar a actividade de GTPase de Mx1, que é essencial para a actividade anti-gripe de Mx1, e assim estabilizar a interacção entre Mx1 e NP. No entanto, um efeito directo de NEM na GTPase actividade de Mx1 é improvável, como NEM também é necessária para detectar a interação entre a gripe NP e GTPase mutantes inativos da proteína Mx1 14. Claramente, é necessária mais investigação para desvendar o efeito de NEM na interação NP-Mx1. Em resumo, o protocolo de co-imunoprecipitação descrita permite estudar a interacção entre a proteína antiviral Mx1 e seu alvo viral, a proteína NP da gripe. Este protocolo poderia também ser utilizada para estudar outras interacções fracas ou transientes que dependem da estabilização de conformações de proteínas específicas. Interacção proteína-proteína que dependem conformações específicos têm sido descritos antes, por exemplo, para as proteínas de ligação ao cálcio, tais como a calmodulina 19. Finalmente, o papel benéfico de NEM também pode ser usado noutros métodos que detectam interacções proteína-proteína, tais como ensaios de co-sedimentação.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52100-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-3876</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-30212</td>
			<td>also known as NP40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 873 580 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NP monoclonal antibody</td>
			<td>NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository</td>
			<td>NR-4282</td>
			<td>ascites blend of clones A1 and A3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-RNP polyclonal serum</td>
			<td>NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository</td>
			<td>NR-3133</td>
			<td>directed against A/Scotland/840/74 (H3N2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose 4FF</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0618-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperfilm ECL 18 x 24 cm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9068-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>32106</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-immunoprecipitation of the mouse mx1 protein with the influenza a virus nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

N-etilmaleimida é um composto orgânico que pode ser utilizado para modificar irreversivelmente grupos tiol livres, por exemplo, para inibir as proteases de cisteína (Figura 1). A proteína antiviral Mx1 inibe a replicação do vírus da gripe A, interagindo com a nucleoproteína virai. O protocolo de co-imunoprecipitação otimizado aqui descrito permite estudar essa interação NP-Mx1. Células HEK293T foram transfectadas com vectores de expressão para a prote?...

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Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-imunoprecipitação da proteína do rato Mx1 com a nucleoproteína do vírus da gripe A

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.6K visualizações.  VIB. This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Geração de recombinante do vírus Influenza de DNA plasmidial

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Imunologia e Infecção

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Usando imagens Bioluminescent para Investigar sinergismo entre Streptococcus pneumoniae E Vírus da Influenza A em Ratos infantil

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Purificação por afinidade de Complexos de Influenza Virus ribonucleoproteína da cromatina de células infectadas

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Propagação do vírus Influenza em ovos de galinha embrionados

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Nasal Wipes para Influenza A detecção de vírus e Isolamento de suínos

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

A Miniaturized Glycan Microarray Ensaio para a Avaliação de avidez e especificidade do Hemaglutininas vírus da gripe A

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro A desmontagem do vírus influenza A capsï¿½eos por centrifugação em gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

-Fluorescência baseado Neuraminidase Ensaio de Inibição Para avaliar a susceptibilidade do vírus influenza A de neuraminidase Inibidor de Classe Antivirais

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.