Funding from the Australian Research Council (ARC) and National Health and Medical Research Council (NHMRC) is gratefully acknowledged.

The authors have nothing to disclose.

O modelo de rato canulação linfático mesentérico permite a quantificação directa da concentração e da taxa de transporte de várias células e moléculas (tais como lipidos e medicamentos) a partir do intestino para a linfa e as modificações dos mesmos que ocorrem em resposta ao desafio de várias substâncias (dieta , antigénios, fármacos, formulações, etc.) e 10,27 doença (cancro, vírus, colite, resistência à insulina, etc) 5-7. Os componentes recolhidas na linfa também pode ser ainda utilizado em experiências suplementares. Por exemplo, as células podem ser cultivadas 44, lipoproteínas fraccionadas e linfa ou seus componentes, tais como as lipoproteínas ou células, carregada com marcadores de drogas, incluindo marcadores radioactivos e sondas fluorescentes. Estes, então, pode ser re-infundido em animais receptores para avaliar mais diretamente a sua função, metabolismo, eliminação e / ou padrões de disposição tecido 45-47. O modelo de canulação de linfa de rato tem várias vantagens sobre o other in vitro, in situ, in silico, e em modelos in vivo que foram descritos na introdução. Mais importante ainda, a canulação é o único método que permite o acesso directo a toda a quantidade de componentes no fluido linfático. Quando realizada nas mãos de um operador experiente o modelo é as taxas de sucesso robustos, reprodutíveis e experimentais de&gt; 80% pode ser alcançado. No entanto, a técnica cirúrgica pode ser difícil de dominar inicialmente, particularmente num laboratório que não esteja familiarizado com a técnica. Vários passos são fundamentais para o sucesso do modelo cannulation linfa mesentérica. O primeiro é a escolha correcta de instrumentos cirúrgicos e tipo cânula e preparação. Nosso laboratório utiliza cânulas PE com dimensões de 0,8 x OD ID de 0,5 mm. No entanto, outros laboratórios tiveram sucesso com cânulas de PVC da mesma dimensão 15. Biselagem da ponta da cânula e pré-imersão em um anti-coagulante, também ajuda a evitarde oclusão, e a formação de coágulos no interior, a cânula pós-inserção (passo 3.13). O primeiro passo do procedimento cirúrgico que alguns operadores encontrar particularmente crítico é tendo o cuidado de limpar as camadas de tecido conjuntivo e gordura acima do ducto linfa (passo 3.10). Isto ajuda a evitar a inserção da cânula entre o duto tecido linfático e, em vez de para dentro da conduta de linfa. No entanto, esta etapa de limpeza é difícil como a conduta de linfa é frágil e fácil de danos. Para alguns, esta etapa e a inserção da cânula são completadas com mais sucesso com o auxílio de um microscópio cirúrgico embora outros encontrar um microscópio não é necessário. Ao inserir a cânula no interior da conduta na direcção e profundidade de inserção em relação à ponta biselada requer alguma consideração, a fim de evitar que a cânula ser ocluída pela parede do vaso (passo 3.12). Cada operador tende a encontrar sua própria preferência individual. Também importante é a prevenção da formação de bolhas de ar no interior da cannula durante a inserção de espaços de ar aplicar a pressão de retorno para o livre fluxo de linfa (passo 3.12). Finalmente, a aplicação de adesivo veterinária para segurar a cânula no lugar deve ser inferior ao ponto de inserção no interior da conduta como adesivo colocadas directamente no topo da conduta pode fazer com que o recipiente para recolher e ocluir a ponta da cânula (passo 3.14). O guia inicial mais fácil quanto ao facto de uma cirurgia é bem sucedida é a taxa de fluxo da linfa. Uma vez que a cânula no lugar linfa é geralmente começa a fluir lentamente nos primeiros 30 minutos e, em seguida, aumenta. Tipicamente, as taxas de fluxo para cânulas sucesso em ratos&gt; 250 g são&gt; 0,1 ml / h durante a primeira hora e, em seguida, aumentar a&gt; 0,4 ml / hr no estado estacionário, como é mostrado na Figura 4. Embora seja óbvio que esta pode variar dependendo da . condição experimental Em termos de resolução de problemas, se não linfa flui através da cânula ou a taxa de fluxo é baixo isso pode ser porque: <ol tipo = &quot;i&quot;&gt; <li> a cânula não foi inserida corretamente dentro do duto </li><li> a cânula é na conduta, mas ocluído por o lado da parede do vaso </li><li> a cânula é na conduta, mas ocluído por um adesivo aplicado na posição incorrecta </li><li> a cânula é na conduta e uma bolha de ar na cânula está a abrandar o fluxo de </li><li> um coágulo de sangue formado no interior da cânula </li></ol> A inspeção cuidadosa revela geralmente o fator subjacente. Se o operador acredita que a cânula não foi colocado corretamente em primeiro lugar (ou seja, nunca foi linfa flui), em seguida, re-inserção é necessário. Se a cânula parece estar no lugar correto, em seguida, o primeiro fator a verificar é se uma bolha de ar ou coágulo está presente. As bolhas de ar geralmente passam através da cânula, como fluxos linfáticos e fluxo temporariamente lento. É possível, por vezes, para remover as bolhas de ar ou formação de coágulos através da elaboração de volta sobre a cânula usando uma agulha de 25 G ligada a, por exemplo, uma seringa de 1 ml. Se não houver nenhuma bolha de ar ou coágulo pode ser útil tentar reposicionar o rato e / ou tornear, puxar a cânula ligeiramente. Isto pode, por vezes, realinhar a cânula de tal modo que ela não é bloqueada contra a parede do vaso. Ocasionalmente remover o adesivo com ou sem pequeno movimento da cânula permite que a linfa flua novamente também. No entanto, se tudo o mais falhar a cânula precisa de ser reinserido. Na nossa experiência as experiências são menos bem-sucedida quando a cânula não foi correctamente inserida na primeira tentativa. No entanto, o resgate cirúrgico é possível. Outra complicação que pode surgir é a dificuldade de punção devido à variação anatômica entre ratos. Por exemplo, a conduta de linfa mesentéricos, ocasionalmente, passa numa direcção estranho ou existe uma conduta de linfa acessório no lado oposto da artéria mesentérica para a conduta de maior linfa mesentérica superior. Em experiências que requerem a recolha de todo o volume do fluxo de linfa do intestino delgado (como é o casoquando se avalia o total de lípido e o transporte da droga a partir do intestino através dos vasos linfáticos), a conduta de linfa acessório tem de ser tapado de modo a que toda a linfa é dirigido para a conduta de linfa superior. Isto é difícil de conseguir, mas pode ser tentada por amarrar uma sutura em torno do acessório de conduta ou cortando o ducto acessório e ocluir com adesivo veterinária (passo 3.6). A presença de uma conduta de linfa acessório é um dos principais factores que resulta em falha experimental nas experiências de transporte de fármacos linfáticos. Se o navio acessório não está completamente obstruído, o fluxo de linfa e lipídico e transporte de drogas são significativamente mais baixos do que o esperado. No protocolo apresentado aqui o animal permanece anestesiado durante todo o período de coleta de linfa. O modelo de rato anestesiado (em vez de modelos conscientes a seguir descritos) aumenta o rendimento experimental como a cirurgia e experiência pode ser conduzida ao longo de um em vez de vários dias e o sucesso cirúrgico rComeram é maior, uma vez que é mais fácil de manter cânula patência em animais imobilizados. A anestesia pode, teoricamente, reduzir o esvaziamento gástrico, processamento lipídico intestinal e fluxo da linfa e dos transportes. Em nossa experiência, no entanto, lipídico linfática e transporte de drogas são semelhantes em ratos anestesiados administrou a droga diretamente para o duodeno (a cirurgia de esvaziamento do estômago) dentro de veículos pré-digeridas e pré-dispersos (sistemas, por exemplo, ácidos gordos e monoglyceride micelares dispersos com surfactantes ) quando comparado com ratos conscientes administrados a droga através de sonda oral no estômago num 21,23,27 triglicéridos equivalente. De facto, a maioria das experiências de transporte de fármacos linfáticos intestinais no nosso laboratório nos últimos 10 anos foram realizados no modelo anestesiado devido ao maior rendimento que pode ser alcançado. Nestas experiências, foram administrados mais frequentemente drogas em formulações que contêm ácido gordo (por exemplo, ácido oleico) e surfactante 43.Os ácidos gordos são sintetizados em triglicéridos antes da incorporação nas lipoproteínas linfáticos intestinais e este requer a fonte de componentes para formar a espinha dorsal de glicerol dos triglicéridos (isto é, 2-monoglicérido ou glicerol-3-fosfato). Isto sugere que a administração de ácidos graxos, na ausência de uma fonte de glicerol pode levar à redução transporte linfático. A administração de ácido gordo, no entanto, permite o cálculo directo da contribuição do ácido gordo exógena administrada e lípidos endógenos para lípido linfática e o transporte da droga 43. Adicionalmente, 2-monoglicérido é caro e geralmente instável, uma vez que facilmente isomerises 1-monoglicérido o qual é digerido com glicerol no lúmen intestinal. Nos estudos aqui relatados demonstram ainda que nós lipídico linfática e o transporte da droga é equivalente após a administração do fármaco modelo halofantrina com um ácido gordo (por exemplo, ácido oleico) e tensioactivo (sal biliar) formulação quer na presence ou ausência da fonte de glicerol 2-mono-oleína (Tabela 1). Fontes endógenas de glicerol, assim, parece ser suficiente para suportar o fluxo de linfa equivalente e lípido e o transporte da droga após a administração deste fármaco modelo com ácidos gordos (por exemplo, ácido oleico), na ausência de uma fonte de glicerol. Isso proporciona a confiança de que os dados de transporte linfático representativos podem ser obtidos com as formulações de ácidos gordos simples. O modelo anestesiado é facilmente estendido para um modelo consciente, quando necessário. Nos modelos conscientes formulações podem ser tratadas por gavage directamente para o estômago ou infundida no duodeno, ou por via intravenosa, as comparações directas podem ser feitas para estudos farmacocinéticos realizados em não-linfáticos canulada animais conscientes e os resultados podem ser considerados mais fisiologicamente relevante. O período de tempo permitido em animais conscientes também tem a vantagem de permitir a recolha de perfis farmacocinéticos mais completas para drconcentrações ug no sangue, enquanto que em experimentos anestesiados, perfis sanguíneos são muitas vezes incompletos, especialmente para longas semi fármacos de vida. Como descrito acima, no entanto, a taxa de sucesso para estudos linfáticos canulada conscientes é inferior e experiências levam mais tempo para completar. Existem dois tipos de modelos de canulação linfa conscientes descritos na literatura. Em modelos contido conscientes 15, após a cirurgia canulação linfa, o animal é simplesmente colocado em decúbito frontal e colocados em um limite adequado para o restante da experiência, com a cânula exteriorizada linfa e inserido um tubo de recolha. O animal é então deixado a recuperar a consciência e se recuperar do procedimento cirúrgico O / N. A taxa de sucesso com este modelo é muito bom nas mãos de operadores experientes, mas pode ser difícil de obter a aprovação ética para conter os animais para o período prolongado de tempo necessário para a coleta de linfa. Um modelo alternativo é o lugar onde a linfa é recolhidaa partir de ratos conscientes e em movimento livre. Este modelo foi detalhado anteriormente 25. Neste modelo cânulas longas são inseridos na conduta de linfa, duodeno e artéria carótida mesentérica. As cânulas são então tunnelled abaixo da pele, exteriorizado na parte de trás do pescoço e colocada através de um sistema articulado. O rato é colocado num arnês unido ao giro e deixou-se recuperar a consciência e para recuperar do procedimento cirúrgico S / N. O animal tem livre circulação dentro de uma gaiola metabólica e amostras linfáticos e sanguíneos podem ser coletadas a partir das cânulas externalizados fora da gaiola. Cannulation linfa mesentérica continua a ser a única ferramenta que permite a avaliação direta dos componentes linfáticos em seu estado nascente. A linfa cannulation é mais frequentemente descrito em ratos como a cirurgia é menos complexo do que os animais mais pequenos e grandes, o modelo mais barato do que animais de grande porte e os resultados parecem razoavelmente comparáveis ​​entre espécies 27. O modo de ratol pode ser modificado de acordo com a necessidade experimental ea taxa de sucesso é elevada nas mãos de operadores experientes. O modelo pode também ser acoplada a outra in vitro ou em estudos in vivo para examinar, em detalhe, o metabolismo ou função de componentes linfáticos intestinais. Uma vez estabelecido o modelo de rato canulada linfático mesentérico é assim uma ferramenta poderosa para avaliar a concentração, o transporte, a função e o metabolismo de vários parâmetros que passam directamente a partir do intestino para o sistema linfático (e em muitos casos de fluxo, eventualmente, para a circulação sistémica).

A linfa flui a partir do intestino delgado através de um processo unidireccional que se origina no lacteals únicos que estão contidos dentro de cada pequena vilosidades intestinais 1. Lacteals são relativamente permeáveis ​​a fluidos, macromoléculas e as células e, assim, a formação de linfa começa com a entrada destes factores em lacteals. A linfa inicial nos lacteals flui posteriormente a partir do intestino através de uma rede de microvasos linfáticos, coletando (aferentes) vasos linfáticos, uma série de linfonodos mesentéricos e, finalmente, os vasos linfáticos pós-nodal (eferente). Dentro dos nodos, linfa passa através de uma série de cavidades medulares onde a troca ocorre com as células imunitárias residentes nó assim como o material que entram no nó do sangue. Todos linfa flui do intestino delgado, eventualmente, converge para o ducto eferente linfa mesentérica superior e, posteriormente, a cisterna do quilo. A cisterna do quilo também recolhe drenagem linfática os tecidos periféricos caudais, intestinal, regiões hepáticas e lombar e junta-se o duto linfático torácico, juntamente com a linfa do mediastino e partes do crânio do corpo. O ducto linfático torácico esvazia linfa diretamente no sistema venoso na junção das veias jugular interna e subclávia esquerda. O protocolo aqui descrito, o que permite a recolha de linfa directamente a partir da conduta de linfa mesentérica superior, facilitando, assim, a análise de vários factores que transitam directamente a partir do intestino para a circulação sistémica (geral) através do sistema linfático intestinal. As principais funções fisiológicas atribuídos ao sistema linfático intestinal são para manter o equilíbrio de fluidos, para facilitar a absorção de lípidos e molécula lipofílica, e para permitir que as respostas imunes adequadas 1. As células tumorais e vírus também se propagar através dos vasos linfáticos intestinais 2-4 e principais mudanças ocorrem dentro dos vasos linfáticos em várias patologias inflamatórias e metabólicas 5-7. Latanulation do ducto linfático mesentérico para recolher linfa dentro do mesentério permite uma análise de fluxo de fluido a granel através dos vasos linfáticos intestinais, bem como a quantificação da taxa de concentração e transporte de várias células e moléculas. Alterações na concentração ou o trânsito desses fatores na resposta a vários desafios (por exemplo: dietas, antígenos, drogas) e em modelos de doenças (por exemplo, colite, HIV, diabetes) podem também ser avaliadas. Embora seja impossível para descrever exaustivamente cada componente de linfa, que podem ser analisados ​​e comparados aqui, linfa mesentéricos simplista consiste aquosa, de lípidos e fases celulares. Os componentes de interesse na fase aquosa incluem péptidos e proteínas tais como antigénios ou tolerogénios 8, mensageiros imunes, tais como citocinas e mediadores de mastócitos, e mediadores 9 metabólicas tais como as incretinas 10. A fração celular da linfa mesentérica pós-nodal é composto quase inteiramente (mais de 99%) de lymphocytes 11. Várias células imunológicas (células dendríticas, mastócitos, etc.) penetram nos vasos linfáticos mesentéricos pré-nodais, mas permanecem dentro do nó 12. Se as células dentro da linfa aferente são de interesse, é possível recolher essas células por meio de remoção dos gânglios linfáticos mesentéricos de vários dias antes da canulação da conduta de linfa mesentéricos 12. Desta forma, as condutas linfáticos aferentes e eferentes são directamente ligados e as células linfáticas em linfa aferente passar directamente para o tubo linfático mesentérico. O trânsito e fenótipo de várias células do sistema imunológico que passam através dos vasos linfáticos intestinais podem, assim, ser examinado. Talvez a razão mais comum citada para a coleta de linfa mesentérica, até à data, no entanto, é estudar o processamento intestinal, absorção e transporte de lipídios na dieta e moléculas lipofílicas 10. Após a ingestão, os lípidos da dieta são digeridos (por exemplo, a partir de triglicéridos de ácidos gordos e de monoglicérido, phospholipid de ácidos gordos e de lisofosfolípido, e éster de colesterol de ácido gordo e de colesterol, etc.) e dispersos no lúmen intestinal em pequena das micelas e vesículas através da adição de compostos anfifílicos de bílis (fosfolípidos, colesterol e sais biliares) e a acção de enzimas pancreáticas 10,13. De lá eles são absorvidos enterócitos. A proporção dos componentes absorvidos são re-esterificados para formar triglicéridos, fosfolípidos e ésteres de colesterol no interior das células de absorção (enterócitos). Estes lípidos re-esterificados são montados a partir de uma combinação de componentes lipídicos exogenamente ingerida e componentes lipídicos endógenos da bílis segregada, piscinas ou lípidos da mucosa intestinal o fornecimento de sangue 13. A partir daqui os lípidos estéril içados são armazenados dentro de enterócitos ou montados em lipoproteínas intestinais (quilomicrons, lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL)) em conjunto com várias outras apoproteínas e moléculas lipofílicas ( <em&gt;, por exemplo, vitaminas) 10,13. Depois de sair enterócitos, lipoproteínas são especificamente transportados a partir do intestino para a circulação sistémica através do sistema linfático mesentérico como lacteals intestinais são mais permeáveis ​​a sua entrada do que os capilares sanguíneos intestinais. A proporção de componentes lipídicos são também absorvidos transportados a partir do intestino para o sistema circulatório através dos capilares sanguíneos e veia porta como, não só lipoproteína associados, 14 moléculas. Em geral, no entanto, a via de transporte da veia portal é apenas um actor importante na absorção de lípidos de comprimento de cadeia curto e médio prazo. A recolha de linfa mesentéricos permite assim a avaliação do transporte de lipoproteínas e os componentes associados (lípidos, moléculas lipofílicas, apo-proteínas) a partir do intestino. As lipoproteínas podem ser quantificados e caracterizado com a vantagem de que as lipoproteínas linfáticos mesentéricos, em geral, estão em uma nascenestado t, uma vez que não foram extensivamente modificado por enzimas sistêmicas tais como lipoproteína lipase 15. Embora o modelo de rato canulada linfático mesentérico foi talvez historicamente sido mais extensivamente descrito para a análise de transporte de lípido / lipoproteína a partir do intestino, uma área de expansão interesse é o papel de vasos linfáticos no transporte de fármacos lipofílicos, pró-drogas e outros xenobióticos 13,16 que é o foco do modelo descrito aqui. Fármacos lipofílicos (geralmente aqueles com log P&gt; 5 e solubilidade em cadeia longa triglicéridos&gt; 50 mg / g, embora exceções são aparentes) 17,18, pró-drogas 19 e outros xenobióticos 13,16 pode ter acesso aos vasos linfáticos intestinais passivamente ou por integrar activamente em lipoproteínas intestinal vias de transporte 19. O rato linfa mesentérica técnica de punção, portanto, tem muitas aplicações. Bollman et al. Descreveu pela primeira vez um technique para canular a conduta de linfa mesentéricos de ratos em 1948 20. Desde então um certo número de variantes do modelo foram descritos. Por exemplo, a coleta pode ocorrer quando o rato é anestesiados com vários anestésicos 21,22, ou no estado consciente enquanto conteve 15 ou mover livremente 23,24. Os ratos podem ser administrados diferentes soluções de reidratação e outras substâncias, tais como lípidos e de formulações de drogas em taxas diferentes no estômago, intestino ou parentérica (tipicamente 0-5 ml / h) 25. Em alguns estudos, o ducto torácico linfático em vez de ducto linfático mesentérico é canulada para estimar o transporte a partir do intestino através dos vasos linfáticos, embora isto possa subestimar o trânsito do intestino delgado, dependendo o factor de interesse, como a conduta de linfócito torácico recebe também a partir de linfa outra regiões 22,26. Modelos de canulação linfáticos também foram descritos em várias outras espécies, incluindo ratos 15,27, mini-pigs 12, 28,29 ovelhas, porcos e cães 30 31. No entanto, o modelo de rato é o mais amplamente e de forma consistente citados. Protocolos detalhados para canulação do ducto linfático mesentérica seguido da coleta de linfa no consciente 25 ou anestesiados 22 ratos e camundongos 15,27 foram publicados anteriormente e o leitor interessado é direcionado para estes protocolos. Este protocolo é o primeiro a demonstrar a técnica em um formato visualizado. O modelo de rato linfa cânula tem vantagens sobre animais de grande porte em termos de despesa, a facilidade da cirurgia e considerações éticas. Quando comparado com o modelo do rato, mesentérica linfa cirurgia cannulation também é mais fácil no rato, embora o modelo de rato permite estudos mais detalhados em animais transgênicos 27. No entanto, existem algumas limitações do modelo de rato, particularmente aqueles associados com diferenças na fisiologia, esse limite extrapolatião positivo para outras situações pré-clínicos e clínicos. Por exemplo, o fluxo de bílis no rato é constante e independente da ingestão de alimentos enquanto que na maior comida lipídios espécies ou estimular o fluxo de bílis 32. Isso cria desafios para a obtenção de ambientes de pré e pós-prandial representativos no rato que refletem o que é visto em espécies e seres humanos maiores. Para os estudos de distribuição de drogas, espécies maiores também podem ser preferidos na avaliação dos transportes linfática após a administração da dose humana realista forma 25. Em um estudo recente, as taxas de transporte de lipídios na linfa mesentérica foram encontrados para ser comparáveis ​​entre espécies (rato, cão) após a administração de uma massa equivalente e tipo de lipídio que fornece alguma confiança na extrapolação de dados de transporte de lipídios entre espécies 27. No entanto, o transporte de um modelo lipofílico de drogas, halofantrina, classificados em ordem de tamanho do animal (ou seja, cão&gt; rat&gt; mouse). Um fator de escala pode, assim, ser obrigado a extrapolate dados de transporte de drogas linfáticos de rato a outras espécies. Uma limitação dos modelos de canulação de linfa, em geral, é que a recolha de linfa passiva directamente a partir de uma conduta linfático pode modificar o fluxo linfático e de transporte uma vez que os vasos linfáticos trabalhar contra um gradiente de pressão que é alterada uma vez que o recipiente 33 é canulada. O modelo cannulation linfático também pode ser difícil de estabelecer, em laboratórios que não estão familiarizados com a técnica. Modelos alternativos têm sido assim descrito. Por exemplo, o transporte de factores através do sistema linfático intestinal, tais como lipoproteínas e moléculas lipofílicas, foi estudado indirectamente através de recolha do sangue. Um desses modelos envolve a comparação de concentrações de lípidos no sangue e / ou drogas, após a administração oral, na presença e na ausência de inibidores (por exemplo, colchicina, Pluronic L81, ciclo-heximida) produção de lipoproteína intestinal que bloqueie o transporte linfático 34. Uma vantagemde modelos que quantificam transporte linfático indiretamente por meio da coleta de amostras de sangue é que ele permite alguma avaliação do transporte linfático em humanos como cirurgia invasiva não é necessária 35. No entanto, os inibidores de transporte linfático não são específicas e factores que são transportados através dos vasos linfáticos são diluídos e modificado na circulação sistémica que complica estas avaliações. In vitro alternativas também têm sido descritos. Por exemplo, Caco-2 celulares ou isolado enterócitos culturas têm sido utilizados para estudar mais detalhadamente a secreção intestinal de moléculas que entram nos vasos linfáticos 36-38. Um modelo avançado in vitro que é mais representativo do microambiente intestinal humana também foi descrita recentemente 39. Neste modelo, uma camada de células endoteliais linfáticas é co-cultivadas com células Caco-2, que permite uma análise mais detalhada da transferência de substâncias a partir do intestino para o sistema linfático. No entanto, em vitro sistemas de células não possuem fluxo cambial e transferir ou seja, a interligação com um lúmen intestinal e sangue subjacente e suprimento vascular linfático. Em uma abordagem alternativa, Kassis et al. Estabeleceram um dual-channel (alta velocidade vídeo de campo brilhante e fluorescência), em sistema de imagem situ que permite comparações quantitativas entre contração dos vasos, o fluxo de linfa e concentrações de lipídios fluorescentes em vasos linfáticos mesentéricos 33. Uma vantagem deste modelo sobre o acima mencionado em sistemas in vitro é que ele permite a localização precisa da passagem de células do sistema imunológico através dos vasos linfáticos. Medições absolutas de massa de lípidos (ou medicamento) de transporte são, no entanto, ainda não está estabelecida utilizando métodos de imagem. Estudos in vitro e in silico abordagens especificamente para prever o grau de transporte da droga lipófila através dos vasos linfáticos intestinais foram também publicados 40-42. Por exemplo, a afinidade ex vivo de vários compounds para chylomicrons plasma correlacionou-se razoavelmente bem com o seu transporte linfático in vivo 41. Posteriormente, o mesmo grupo estabeleceu um modelo em silico para prever a afinidade da droga para chylomicrons com base em múltiplos de 40 propriedades físico-químicas. Holm et al., Também estabelecida uma relativamente complexo no modelo para prever silico imediato transporte linfático de compostos lipofílicos em função dos descritores moleculares 42. Estes modelos podem proporcionar uma abordagem útil para prever a extensão de transporte linfático de drogas desconhecidas. A validação dos modelos com uma grande variedade de drogas e em diferentes laboratórios, no entanto, ser necessário para confirmar a sua precisão e reprodutibilidade. A canulação do canal linfático mesentérico permanece, assim, os únicos meios para examinar directamente o conteúdo de drenagem linfática do intestino delgado e a velocidade de trânsito do complexo conjunto de factores (células, proteínas,peptídeos, lipídios, medicamentos) a linfa em uma situação in vivo. Aqui nós descrevemos um protocolo para a canulação do ducto linfático e carótida artéria mesentérica, que permite a coleta de linfa mesentérica e arterial sistêmica de ratos anestesiados. Os dados representativos demonstram como o modelo pode ser usado para examinar o transporte de lípidos e de drogas a partir do intestino, através do sistema linfático mesentérico. Isto é seguido por uma discussão das dificuldades que podem ser encontradas no estabelecimento do modelo e um guia de resolução de problemas. Uma vez estabelecido o modelo é uma ferramenta poderosa para investigar transporte linfático intestinal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >Sterile saline</td>
			<td>Baxter healthcare</td>
			<td>AHB 1307</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is Baxter 100 ml saline bags, box of 50</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70 % ethanol in water</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chlorhexidine gluconate solution (Microshield 4)</td>
			<td>Livingstone International</td>
			<td>JJ60243L</td>
			<td>Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&#38;CAT=6&#38;search 
			=JJ60243L</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Betadine solution</td>
			<td>Livingstone International</td>
			<td>BU0510</td>
			<td>Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&#38;CAT=6&#38;search 
			=BU0510</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ilium Ketamil (Ketamine 100 mg/ml)</td>
			<td >PROVET VICTORIA&#160;</td>
			<td >KETA I 1</td>
			<td>http://www.provet.com.au/</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ilium Xylazil (Xylazine 100 mg/ml)</td>
			<td >PROVET VICTORIA&#160;</td>
			<td >TRO-3828</td>
			<td>http://www.provet.com.au/</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ACP 10 Injection (Acepromazine 10 mg/ml)</td>
			<td >PROVET VICTORIA&#160;</td>
			<td >VTG-DACP010020</td>
			<td>http://www.provet.com.au/</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium pentobarbitone</td>
			<td>PROVET VICTORIA&#160;</td>
			<td>24529</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is Lethabarb&#174; 325 mg/ml sodium pentobarbitone, Virbac Animal Health. http://www.provet.com.au</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heparin (35000I.U. in 35 mL)</td>
			<td>Sigma Pharmaceuticals</td>
			<td>337220</td>
			<td>http://sigmaco.com.au/</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >E1644</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is disodium salt of EDTA from Sigma.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.96 mm x i.d. 0.58 mm</td>
			<td>Microtube extensions</td>
			<td>PE8050</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.8x0.5 mm, 30 m</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.8 mm x i.d. 0.5 mm</td>
			<td>Microtube extensions</td>
			<td>PE9658</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.96x0.58 mm, 30 m</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ruler</td>
			<td>Any</td>
			<td ></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Markers</td>
			<td>Any</td>
			<td ></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cigarette lighter</td>
			<td>Any</td>
			<td ></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cyanoacrylate glue</td>
			<td>Any</td>
			<td ></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >23 gauge needles</td>
			<td>Livingstone International</td>
			<td>DN23GX0.75LV</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 23GX0.75inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&#38;CAT= 
			6&#38;search=DN23GX0.75LV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >25 gauge needles</td>
			<td>Livingstone International</td>
			<td>DN25GX1.0LV</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 25GX1.0inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&#38;CAT=6&#38;search= 
			DN25GX1.0LV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 ml syringe</td>
			<td>Livingstone International</td>
			<td>T3SS01TA</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 1 ml Slip Tuberculin 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&#38;CAT=6&#38;search 
			=T3SS01TA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 ml syringe</td>
			<td>Livingstone International</td>
			<td>T3SS10SA</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 10 ml Slip 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&#38;CAT=6&#38;search 
			=T3SS10SA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gauze swabs</td>
			<td>Livingstone International</td>
			<td>GSC075</td>
			<td>Any brand can be used and cut to required size. Example here is gauze swabs cotton filled 7.5x7.5 cm, 8 ply. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&#38;CAT=6&#38;search 
			=GSC075</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cotton buds</td>
			<td>Livingstone International</td>
			<td>CTAST075DP</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is Livingstone cotton applicator plastic double tipped. 75MM. 100/PK. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&#38;CAT=6&#38;search 
			=CTAST075DP</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating pad</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>WT1</td>
			<td>Any brand that keeps temperature at 37C can be used. Example here is Ratek warming tray.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Surgical light</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-0215 with 72-0267</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is Harvard apparatus V-Lux 1000 Cold Light Source with Bifurcated Gooseneck Light Guide, Black, 4.7 mm fiber diameter (each arm). http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_ 
			-1_HAI_ProductDetail and&#160; http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_35487_ 
			-1_HAI_ProductDetail___</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Surgical microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>495005-0014-000</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000-C with Stand S Double Spot and KL 300 LED. https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&#38;p=us&#38;f=e&#38;i=10143</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silk suture</td>
			<td>Livingstone International</td>
			<td>DTSK163019F4</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is *&#160; 
			Email this item to my friend 
			3/8 Circle Reverse Cut Silk Suture 3/0 Thread 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&#38;CAT=6&#38;search 
			=DTSK163019F4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scalpel blades</td>
			<td >Fine Science Tools (FST)</td>
			<td >10020-00</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Blade #20. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scalpel handle</td>
			<td >Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>10004-13</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Handle #4. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&#38;CategoryId=51</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 x Small surgical scissors</td>
			<td >Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is FST Fine Scissors, 9 cm with 21 mm cutting edge, sharp, straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&#38;CategoryId=17</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 x Forceps with serrated curved tip</td>
			<td >Fine Science Tools (FST)</td>
			<td >11001-13</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is FST 13 cm standard pattern forceps with curved 2.8x1.4 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&#38;CategoryId=32</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 x Iridectomy scissors</td>
			<td >Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is FST Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge, Straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=17&#38;CategoryId=16&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 x Forceps with straight serated tip</td>
			<td >Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11650-10</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is FST Graefe 10 cm straight with serrated 1 x 0.99 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=390&#38;CategoryId=32</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 x Forceps with smooth sharp straight fine tip</td>
			<td >Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is FST Dumont #5 forceps straight 11cm with 0.08 x 0.04mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=335&#38;CategoryId=29</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 x Forceps with smooth fine curved forceps</td>
			<td >Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11063-07</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is FST Delicate Forceps 9 cm with smooth 0.4 x 0.3mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=360</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 x Hemostats</td>
			<td >Fine Science Tools (FST)</td>
			<td >13010-12</td>
			<td>Any brand can be used. Not all operators use the hemostats. Example here is FST 12 cm Micro-Mosquito Hemostats with 20 mm length x 1.3 mm width serrated, straight tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&#38;CategoryId=33</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 x Suture needle holder</td>
			<td >Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>12001-13</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is FST 13cm Hasley Needle Holder with 16 mm length x 1.9 mm width tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&#38;CategoryId=70</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 x Artery clamp</td>
			<td >Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>18050-28</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is FST Bulldog Serrefines straight, 28 mm long, 9x1.6 mm jaw dimension with medium clamp press. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=270&#38;CategoryId=82</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oleic acid</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >O1008</td>
			<td>When required, any brand can be used. Example here is 99% pure oleic acid. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/o1008?lang=en&#38;region=AU</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >14C-oleic acid</td>
			<td >Perkin&#160;</td>
			<td>NEC317050UC&#160;</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is Oleic Acid, [1-14C]-, 50&#181;Ci (1.85MBq). http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/NEC317050UC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium taurocholate</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >T4009</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is taurocholic acid sodium salt hydrate &#8805;95% (TLC) . http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4009?lang=en&#38;region=AU</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Halofantrine</td>
			<td >Glaxo Smith Kline</td>
			<td ></td>
			<td>Halofantrine was kindly provided as a gift from Glaxo Smith Kline</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium phosphate monobasic</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >71507</td>
			<td >Any brand can be used. Example here is sodium phosphate monobasic monohydrate, BioXtra, for molecular biology, &#62;99.5%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71643?lang=en&#38;region=AU</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium phosphate dibasic</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >71643</td>
			<td >Any brand can be used. Example here is sodium phosphate dibasic dihydrate, BioUltra, for molecular biology, &#62;99%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71507?lang=en&#38;region=AU</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mesenteric lymph duct cannulated rat model: application to the assessment of intestinal lymphatic drug transport

O sistema linfático intestinal desempenha um papel-chave no transporte de fluidos, a absorção de lipídios e função imunológica. A linfa flui directamente a partir do intestino delgado através de uma série de vasos linfáticos e dos nodos que convergem na conduta de linfa mesentérica superior. A canulação do canal linfático mesentérico permite assim a obtenção de linfa mesentéricos que flui a partir do intestino. Linfático mesentérico consiste de uma fracção celular de células imunitárias (99% de linfócitos), fracção aquosa (fluido, péptidos e proteínas, tais como as citoquinas e as hormonas do intestino) e fracção de lipoproteína (lípidos, moléculas lipofílicas e apo-proteínas). O modelo de canulação ducto linfático mesentérico pode, portanto, ser usadas para medir a concentração e velocidade de transporte de uma variedade de factores a partir do intestino, através do sistema linfático. Alterações a estes factores em resposta a desafios diferentes (por exemplo, dietas, antigénios, medicamentos) e na doença (por exemplo, doença inflamatória do intestino, HIV, diabetes) pode também be determinada. Uma área de interesse é expandir o papel do transporte linfático na absorção de drogas e pró-drogas lipofílicas administrados por via oral que se associam com as vias de absorção intestinal de lipídios. Descrevemos aqui, em detalhe, um modelo de rato canulado ducto linfático mesentérico, que permite a avaliação da taxa e extensão de lípido e o transporte da droga através do sistema linfático, durante várias horas, após a libertação intestinal. O método é facilmente adaptável para a medição de outros parâmetros de linfa. Nós fornecer descrições detalhadas das dificuldades que podem ser encontradas ao estabelecer esse método cirúrgico complexo, bem como dados representativos de experiências fracassadas e bem sucedidas para fornecer instruções sobre como confirmar o sucesso experimental e interpretar os dados obtidos.

Os resultados de uma experiência representativa para quantificar a extensão cumulativa e taxa de lípido e o transporte da droga através do sistema linfático intestinal após o parto utilizando o modelo de canulação da linfa mesentéricos são mostrados na Figura 4 e na Figura 5. Nesta experiência, 200 ug do modelo lipofílico halofantrina fármaco foi administrado dentro do duodeno de ratos ao longo de 2 horas, em uma formulação contendo 40 mg de ácido oleico (incluindo 2-5 uCi de 14 C-ácido oleico) e 7,1 mg de 2-mono-oleína disperso em 5,6 ml de 5 mM de taurocolato de sódio em tampão fosfato pH 6,9 solução salina. Após a administração de formulação os ratos foram re-hidratadas, a uma taxa de 2,8 ml / h com uma solução salina normal infundida no duodeno. A linfa foi recolhido continuamente em tubos trocadas a cada hora, durante 10 horas. A formulação foi preparada, e a experiência realizada, de acordo com um protocolo descrito anteriormente para uma formulação contendo todos os mesmos CompOnentos, exceto que não incluem 2-monooleina 43. Como mostrado na Figura 4, nestas condições experimentais a taxa de fluxo de linfa significativo para ratos canulados com sucesso foi entre 0,4-1,3 ml / h. Em alguns ratos, a taxa de fluxo de linfa foi ligeiramente inferior no primeiro 1-3 hr seguinte cannulation e depois aumentou. Isto é comumente visto seguinte cannulation linfa. Também mostrado na Figura 4 é a taxa de fluxo da linfa para uma experiência sem êxito. Neste caso, a taxa de fluxo manteve-se substancialmente menor do que a observada nas experiências com sucesso em todo o período de recolha. Do mesmo modo, o transporte linfático cumulativa de triglicéridos e halofantrina era substancialmente inferior na experiência sem êxito (Figura 5A e B). O transporte halofantrine cumulativa média no grupo de sucesso foi de 15,1% da dose, o transporte de triglicerídeos acumulada foi de 61 mg mais de 10 horas e a proporção da r administradosadiolabelled dose de lípido transportado exógeno na linfa foi de 54% (Figura 5C). Estes valores não são significativamente diferentes ao observado previamente para a formulação semelhante que continha os mesmos componentes, excepto para a ausência de mono-oleína 2-43 (Tabela 1). Isto sugere que as formulações que contêm os ácidos gordos na ausência de uma fonte de monoglicérido lípido semelhante pode suportar o transporte da droga e na linfa para aqueles que contêm monoglicérido. Este resultado é descrito adiante na seção de discussão. A Figura 5D mostra os dados representativos para a taxa de transporte de triglicéridos e halofantrina na linfa ao longo do tempo após a administração. A taxa de transporte de ambos de triglicérides e de drogas para a linfa picos um par de horas após lipídico e administração de drogas e, em seguida, retorna aos níveis basais. Como é típico em lipídios e de transporte de drogas experimentos linfáticos intestinais, a taxa de transpor drogat na linfa durante cada tempo espelhos de época que vi para o transporte de triglicérides como droga é transportada para a linfa em associação com as lipoproteínas ricas em triglicérides. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52389/52389fig1highres.jpg" /> Figura 1. Representação esquemática da forma da ponta chanfrada de uma cânula na artéria carótida ou linfa, e a ponta chanfrada em forma de J de uma cânula duodenal. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52389/52389fig2highres.jpg" /> Figura 2. fotografias de (A) do abdômen raspada em preparação para canulação do ducto linfático, (B), a parede muscular abdominal aberto com uma reta incisão de 4 cm que se estende desde a linha média para o flanco direito para acessar o ducto linfático, e (c ) o duto de linfa mesentérica superior (em círculo amarelo)<html> perpendicular ao rim direito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52389/52389fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52389/52389fig3highres.jpg" /> Figura 3. Fotografias de (A), a artéria carótida isolado com duas suturas de seda com um a mais próxima do operador amarrado, (B), a artéria carótida e isolado o fluxo sanguíneo obstruído com uma pinça de ponta fina rectas se encontram por baixo da artéria, e (C) a artéria carótida com a cânula no lugar e a desobstrução sendo verificado, chamando de volta uma pequena quantidade de sangue. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52389/52389fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 4 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52389 / 52389fig4highres.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Os dados representativos para a taxa de fluxo linfático mesentérico (l / h) ao longo do tempo. Os ratos foram administrados uma formulação contendo 200 ug halofantrina, 40 mg de ácido oleico (ácido com 2 uCi de 14 C-oleico) e 7,1 mg de 2-monooleina 5,6 ml de 5 mM de taurocolato de sódio em tampão fosfato salino (pH 6,9) 0-2 h. Os dados apresentados são a média ± D.P. para n = 3 experiências bem sucedidas (círculos fechados, ●) e n = um resultado sem sucesso (triângulos abertos), Δ. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52389/52389fig5highres.jpg" /> Figura 5. Os dados representativos para lipídico e transporte da droga para a linfa mesentérica. Transporte cumulativo de (A) a halofantrine modelo de drogas (HF,% dose), (B) de triglicerídeos (TG, mg) e (C) de ácidos graxos exógena (% dose), e a taxa de transporte de (D) TG (mg / h) e Hf (% dose / h) em linfático mesentérico ao longo do tempo após administração de uma formulação contendo 200 ug halofantrina, 40 mg de ácido oleico (com 2 uCi 14 ácido C-oleico) e 7,1 mg de 2-mono-oleína em 5,6 ml de taurocolato de sódio 5 mM em tampão fosfato salino (pH 6,9) 0-2 h. Os dados apresentados são a média ± D.P. para n = 4 experiências bem sucedidas (círculos fechados, ●) e n = um resultado sem sucesso (triângulos abertos), Δ. Transporte de ácidos gordos exógena não foi medida na experiência sem êxito, mas é tipicamente baixa em experiências falhadas. Os dados para o experimento malsucedido é omitido do Painel D para maior clareza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52389/52389fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td colspan="2"> Sem monoolein </td><td colspan="2"> Com 2-monoleína </td></tr><tr><td></td><td> Significar </td><td> SEM </td><td> Significar </td><td> SEM </td></tr><tr><td> Halofantrina (% dose) </td><td> 15.1 </td><td> 0,8 </td><td> 15 </td><td> 1.6 </td></tr><tr><td> Triglicéridos (mg) </td><td> 67 </td><td> 4 </td><td> 61 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> Ácido gordo total (pmol) </td><td> 261 </td><td> 16 </td><td> 248 </td><td> 23 </td></tr><tr><td> Ácido oleico exógena (imol) </td><td> 82 </td><td> 5 </td><td> 65 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> Ácido gordo endógeno (imol) </td><td> 180 </td><td> 17 </td><td> 183 </td><td> 28 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Comparação de dados de transporte linfático cumulativos ao longo de 10 horas após a administração de 200 mg halofantrine para mesentérica duto linfático ratos com cânulas em formulações contendo 40 mg de ácido oleico (containin1 g de ácido 14 ^ Ci-C oleico) emulsionado em taurocolato de sódio a 5 mM em tampão fosfato salino (pH 6,9) com ou sem 7,1 mg de 2-mono-oleína. Os dados representam a média ± D.P. para n = 4 ratos. Não houve diferenças estatisticamente significativas são vistos entre os dois grupos. a No grupo doseado com 2-monooleina esta não é uma medida precisa do transporte do ácido graxo endógena como o ácido oleico ligadas à coluna vertebral 2 monooleina não é contabilizada no transporte de ácido oleico medida exógena para a linfa. b Os dados para halofantrine e total do transporte de ácidos graxos no grupo dosado sem 2-monooleina foi publicado anteriormente na Figura 5 de referência 43 e é reproduzido aqui em formato de tabela.

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The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

Here we describe a technique to cannulate the mesenteric lymph duct in rats which enables quantification of lipid and drug transport via the lymphatic system following intestinal delivery. The technique can be adapted to assess mesenteric lymph concentrations and/or transport of fluid, immune cells, peptides, proteins and lipophilic molecules.

A linfa mesentérica Duct canulada Rat Modelo: Aplicação para a Avaliação de Intestinal Linfática transporte da droga

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

the-mesenteric-lymph-duct-cannulated-rat-model-application-to

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

28.3K visualizações.  Monash University (Parkville Campus). Here we describe a technique to cannulate the mesenteric lymph duct in rats which enables quantification of lipid and drug transport via the lymphatic system following intestinal delivery. The technique can be adapted to assess mesenteric lymph concentrations and/or transport of fluid, immune cells, peptides, proteins and lipophilic molecules.

Vídeo: The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Microscopia intravital do linfonodo inguinal

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Imunologia e Infecção

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

Amplificar e Quantificação do HIV-1 RNA no indivíduos infectados pelo HIV com carga viral abaixo do limite de detecção pela Standard Ensaios Clínicos

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Imagem intravital do Linfonodo Popliteal Rato

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

Não-invasiva de Imagem Óptico da vasculatura linfática de um rato

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode larvae of the genus Trichinella. The most important sources of human infections worldwide are game meat and pork or pork products. In many countries, the prevention of human trichinellosis is based on the identification of infected animals by means of the artificial digestion of muscle samples from susceptible animal carcasses.
There are several methods based on the digestion of meat but the magnetic stirrer method is considered the gold standard. This method allows the detection of Trichinella larvae by microscopy after the enzymatic digestion of muscle samples and subsequent filtration and sedimentation steps. Although this method does not require special and expensive equipment, internal controls cannot be used. Therefore, stringent quality management should be applied throughout the test. The aim of the present work is to provide detailed handling instructions and critical control points of the method to analysts, based on the experience of the European Union Reference Laboratory for Parasites and the National Reference Laboratory of Germany for Trichinella.

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

The prevention of human trichinellosis in many countries worldwide is based on the laboratory examination of muscle samples from susceptible animals by methods of digestion, of which the magnetic stirrer method is considered the gold standard.

Método agitador magnético para Detecção de<em&gt; Trichinella</em&gt; As larvas em amostras de músculo

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Sobreexpressão e purificação do ser humano<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferase em<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Um novo sistema alimentador-livre para produção em massa de murino Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory bowel disease, asthma and arthritis. Thus, understanding the mechanisms underlying microbiota-immune system crosstalk is of crucial importance. Antibiotic administration, while aiding pathogen clearance, also induces drastic changes in the size and composition of intestinal bacterial communities which can have an impact on human health. Antibiotic treatment in mice recapitulates the impact and long-term changes in human microbiota from antibiotic treated patients, and enables investigation of the mechanistic links between changes in microbial communities and immune cell function. While several methods for antibiotic treatment of mice have been described, some of them induce severe dehydration and weight-loss complicating the interpretation of the data. Here, we provide two protocols for oral antibiotic administration which can be used for long-term treatment of mice without inducing major weight-loss. These protocols make use of a combination of antibiotics that target both Gram-positive and Gram-negative bacteria and can be provided either ad libitum in the drinking water or by oral gavage. Moreover, we describe a method for the quantification of microbial density in fecal samples by qPCR which can be used to validate the efficacy of the antibiotic treatment. The combination of these approaches provides a reliable methodology for the manipulation of the intestinal microbiota and the study of the effects of antibiotic treatment in mice.

Here we provide detailed protocols for the oral administration of antibiotics to mice, collection of fecal samples, DNA extraction and quantification of fecal bacteria by qPCR.

Polimerase quantitativos baseados na reação em cadeia análises de murino Microbiota Intestinal após o tratamento antibiótico Oral

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and dysregulated repair. In inflammatory bowel disease (IBD), fibrosis leads to recurrent stricture formations for which there is no effective therapy other than surgical resection. Due to its late onset, the processes that drive fibrosis is less studied and largely unknown. Therefore, fibrotic complications represent a major challenge in IBD. In this protocol, a robust in vivo model of intestinal fibrosis is described where streptomycin pre-treatment of C57Bl/6 mice followed by oral gavage with vaccine grade Salmonella Typhimurium &#916;AroA mutant leads to persistent pathogen colonization and fibrosis of the cecum. Methodologies for preparing S. Typhimurium &#916;AroA for inoculation, quantifying pathogen loads in the cecum and spleen, and evaluating collagen deposition in intestinal tissues are explained. This experimental disease model is useful for examining host factors that either enhance or exacerbate CD-like intestinal fibrosis.

This protocol describes a mouse model of Salmonella driven intestinal fibrosis that resembles key pathological hallmarks of Crohn&#8217;s disease including transmural inflammation and fibrosis. This method can be used to evaluate host factors that alter fibrotic outcomes using mutant mice maintained on a C57Bl/6 genetic background.

Infecção crônica por Salmonella induzida por fibrose intestinal

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and ...