Funding from the Australian Research Council (ARC) and National Health and Medical Research Council (NHMRC) is gratefully acknowledged.

The authors have nothing to disclose.

Die Ratte Mesenteriallymphknoten Kanülierung Modell ermöglicht eine direkte Quantifizierung der Konzentration und Geschwindigkeit des Transports von verschiedenen Zellen und Molekülen (wie Lipide und Drogen) aus dem Darm in die Lymphe und die Änderungen an diesen, die als Reaktion auftreten, um von verschiedenen Substanzen in Frage (Ernährung Antigen, Drogen, Formulierungen etc.) 10,27 und Krankheiten (Krebs, Viren, Colitis, Insulinresistenz, etc.) 5-7. Die in Lymphknoten gesammelt Komponenten können auch weitere in weiteren Experimenten verwendet werden. Zum Beispiel können die Zellen kultiviert werden, 44, Lipoproteine ​​fraktioniert und Lymphe oder dessen Komponenten, wie beispielsweise Lipoproteine ​​oder Zellen, mit Markierungen, einschließlich Medikamenten, radioaktiven Markierungen und fluoreszierenden Sonden geladen. Diese können dann in Empfängertiere reinfundiert werden, um mehr direkt bewerten ihre Funktion, den Stoffwechsel-Clearance und / oder Gewebe Disposition Muster 45-47. Die Ratte Lymphe Kanülierung Modell hat mehrere Vorteile gegenüber dem OTHer in vitro, in situ, in silico und in vivo-Modelle, die in der Einleitung beschrieben wurden. Am wichtigsten ist, Kanülierung die einzige Methode, die den direkten Zugriff auf das gesamte Volumen der Komponenten in Lymphflüssigkeit ermöglicht. Wenn sie in den Händen eines erfahrenen Bedienungsperson durchgeführt das Modell ist robust, reproduzierbar und experimentellen Erfolgsrate von&gt; 80% erreicht werden kann. Jedoch kann die chirurgische Technik im Voraus schwer zu beherrschen, insbesondere in einem Labor, das nicht mit der Technik vertraut sind. Mehrere Schritte sind entscheidend für den Erfolg der Mesenteriallymphknoten Kanülierung Modell. Die erste ist die richtige Auswahl der chirurgischen Instrumente und Kanülentyp und Vorbereitung. Unser Labor verwendet PE Kanülen mit den Abmessungen 0,8 x ID OD 0,5 mm. Aber auch andere Labors Erfolg mit PVC Kanülen der gleichen Dimension 15 erlebt. Abschrägen der Spitze der Kanüle und vorge Einweichen in einem Antikoagulans hilft auch zu verhindern,Okklusion, und die Bildung von Blutgerinnseln innerhalb der Kanüle Zuschießfunktion (Schritt 3.13). Der erste Schritt des chirurgischen Eingriffs, die einige Betreiber besonders kritisch finden kümmert sich um die Schichten der Binde- und Fettgewebe über die Lymphe Kanal (Schritt 3.10) reinigen. Dies hilft, das Einführen der Kanüle zwischen dem Gewebe und Lymphe Kanal statt in die Lymphe Kanal zu vermeiden. Jedoch ist dieser Reinigungsschritt schwierig, da die Lymphe Kanal ist zerbrechlich und leicht zu beschädigen. Für manche sind diese Stufe und die Einführung der Kanüle am erfolgreichsten mit Hilfe eines Operationsmikroskops abgeschlossen obwohl anderen ist ein Mikroskop ist nicht notwendig. Beim Einsetzen der Kanüle in die Leitung die Richtung und die Tiefe der Einführung relativ zu der abgeschrägten Spitze erfordert einige Aufmerksamkeit, um die Kanüle durch die Gefäßwand (Schritt 3.12) okkludiert verhindern. Jeder Operator neigt dazu, ihre eigenen individuellen Vorlieben zu finden. Ebenfalls wichtig ist die Vermeidung der Bildung von Luftblasen innerhalb des cannula beim Einführen als Luftspalte gelten Gegendruck für den freien Fluss der Lymphe (Schritt 3.12). Schließlich sollte die Anwendung von Tier Klebstoff auf die Kanüle zu befestigen unter dem Einführungspunkt in die Leitung als Klebstoff direkt auf die Oberseite des Kanals angeordnet sein, kann der Behälter zu kollabieren und zu verschließen, die Kanülenspitze (Schritt 3.14) verursachen. Der einfachste erste Orientierungshilfe, ob eine Operation erfolgreich ist, ist die Durchflussmenge der Lymphe. Nachdem die Kanüle an Ort Lymphe beginnt üblicherweise in der ersten 30 min langsam zu fließen, und dann erhöht. Typischerweise Flußraten für erfolgreiche Kanülierungen bei Ratten&gt; 250 g sind&gt; 0,1 ml / h in der ersten Stunde und dann auf&gt; 0,4 ml / h in einem stabilen Zustand zu erhöhen, wie in Figur 4 gezeigt ist. Obwohl natürlich je nach dem variieren, . Versuchsbedingung In Bezug auf die Fehlersuche, wenn kein Lymphe durch die Kanüle oder der Durchflussmenge fließt niedrig ist dies, weil sein: <ol typ = &quot;i&quot;&gt; <li> Die Kanüle wurde nicht richtig in den Kanal eingeführt </li><li> die Kanüle in dem Kanal, sondern von der Seite der Behälterwand eingeschlossene </li><li> die Kanüle in dem Kanal, sondern durch einen Klebstoff an der falschen Position eingesetzt okkludiert </li><li> die Kanüle in dem Kanal und eine Luftblase in der Kanüle ist die Verlangsamung der Strömungs </li><li> ein Gerinnsel in der Kanüle gebildet </li></ol> Eine sorgfältige Überprüfung ergeben, in der Regel die zugrunde liegende Faktor. Wenn der Bediener glaubt, dass die Kanüle nicht korrekt in der ersten Stelle platziert (dh, Lymphe wurde nie fließt), dann Wiedereinsetzen notwendig ist. Wenn die Kanüle scheint an der richtigen Stelle ist, dann der erste Faktor, um zu überprüfen, ob eine Luftblase oder ein Gerinnsel vorhanden ist. Luftblasen werden in der Regel durch die Kanüle als Lymphe fließt und vorübergehend langsamen Fluss übergeben. Manchmal ist es möglich, Luftblasen oder Gerinnsel durch Zurückziehen an der Kanüle mit einem 25 G-Nadel befestigt zu entfernen, beispielsweise eine 1-ml-Spritze. Wenn es keine Luftblase oder ein Gerinnsel kann es nützlich sein, zu versuchen Neupositionierens der Ratte und / oder Drehen oder Ziehen der Kanüle geringfügig. Dies kann manchmal die Kanüle auszurichten, so dass sie nicht gegen die Gefäßwand blockiert. Gelegentlich Entfernen der Kleber oder mit geringen Bewegung der Kanüle ermöglicht die Lymphe wieder auch fließen. Wenn alle Stricke reißen die Kanüle muss wieder eingesetzt werden. Nach unserer Erfahrung Experimente sind weniger erfolgreich, wenn die Kanüle nicht korrekt beim ersten Versuch eingesetzt. Jedoch ist chirurgischen Rettungs möglich. Eine weitere Komplikation, die auftreten kann, ist schwierig in der Kanülierung durch anatomische Abweichung zwischen Ratten. Zum Beispiel wird in einem ungünstigen Richtung gelangt die Mesenteriallymphknoten Kanal gelegentlich oder es ist ein Zubehör Lymphe Kanal auf der gegenüberliegenden Seite der Arteria mesenterica superior zum größeren Mesenteriallymphknoten Kanal. In Experimenten, die Sammlung des gesamten Volumens der Lymphe aus dem Dünndarm fließt erfordern (wie es der Fallbei der Beurteilung der Gesamtlipid und Drogentransport aus dem Darm über die Lymphgefäße), muss das Zubehör Lymphe Kanal zu verschließe so dass alle Lymphe der überlegenen Lymphe Kanal geleitet werden. Dies ist schwierig zu erreichen, sondern kann durch das Binden eines Nahtmaterials um das Zubehörkanal oder Durchtrennen des Zubehörkanal und verschließt sie mit Tierkleber (Schritt 3.6) versucht werden. Die Anwesenheit eines Zubehör Lymphe Kanal ist einer der Hauptfaktoren, die in der experimentellen Fehler in lymphatischen Arzneimitteltransport Experimenten führt. Wenn das Zubehör Behälter nicht vollständig verschlossen sind Lymphfluss und Lipid- und Wirkstofftransport deutlich niedriger als erwartet. In der hier vorgestellten Protokoll bleibt das Tier während des gesamten Erhebungszeitraum narkotisierten Lymphe. Die narkotisierten Ratten-Modell (statt unten beschrieben bewussten Modellen) erhöht experimentellen Durchsatz als die Chirurgie und Experiment kann über eine nicht mehrere Tage und chirurgischen Erfolg r durchgeführt werdenaß größer als es einfacher ist, Kanüle, die Durchgängigkeit bei immobilisierten Tieren aufrechtzuerhalten. Anästhesie kann theoretisch verringern Magenentleerung, Darmlipid Verarbeitung und Lymphfluss und Transport. Nach unserer Erfahrung jedoch lymphatischen Lipid- und Wirkstofftransport sind ähnlich in narkotisierten Ratten verabreicht das Medikament direkt in den Zwölffingerdarm (auf Bypass Magenentleerung) innerhalb vorverdaut und vordispergiert Fahrzeuge (zB Fettsäure und Monoglycerid micellaren Systemen mit Tensiden verteilt ) im Vergleich zu Ratten bei Bewußtsein in äquivalenter Triglycerid 21,23,27 verabreicht das Arzneimittel über eine orale Sonde in den Magen. In der Tat haben die meisten Darm lymphatischen Arzneimitteltransport Experimente in unserem Labor in den letzten 10 Jahren in der narkotisierten Modell aufgrund des höheren Durchsatzes, die erreicht werden kann, durchgeführt. In diesen Experimenten haben wir häufig in Formulierungen mit Fettsäure (beispielsweise Ölsäure) und Tensid 43 verabreichten Medikamenten.Fettsäuren in Triglyceriden, bevor sie in Darm Lymphe Lipoproteine ​​Einarbeitung synthetisiert und dies erfordert die Quelle der Komponenten, um die Glyceringerüst von Triglycerid (dh 2-Monoglycerid oder Glycerin-3-phosphat) zu bilden. Dies legt nahe, dass die Verabreichung von Fettsäuren in Abwesenheit eines Glycerinquelle kann mit reduzierter Lymphtransports führen. Verabreichung von Fettsäure, jedoch ermöglicht die direkte Berechnung des Beitrags der exogenen verabreicht Fettsäure und endogenen Lipide lymphatische Lipid- und Arzneistofftransport 43. Außerdem ist 2-Monoglycerid teuer und im allgemeinen instabil, da es leicht isomerisiert 1-Monoglycerid, das Glycerin in das Darmlumen verdaut. In den Studien, die hier berichtet wir zeigen ferner, dass lymphatische Lipid- und Arzneistofftransport entspricht nach der Verabreichung des Modellarzneimittels Halofantrin mit einer Fettsäure (beispielsweise Ölsäure) und Tensid (Gallensäurensalz) Formulierung entweder in dem prEsence oder Abwesenheit des Glycerinquelle 2-Monoolein (Tabelle 1). Endogenen Quellen von Glycerin somit ausreichend erscheinen, um äquivalente Lymphströmung und Lipid- und Arzneistofftransport nach der Verabreichung dieser Modellwirkstoff mit Fettsäuren (beispielsweise Oleinsäure) in Abwesenheit eines Glycerinquelle unterstützt. Das schafft Vertrauen, dass Vertreter Lymphtransports Daten kann mit einfachen Fettsäure Formulierungen erhältlich. Die narkotisierten Modell leicht zu einer bewussten Modell erweitert, wenn erforderlich. In den bewussten Modelle können Formulierungen direkt in den Magen eine Sonde oder in den Zwölffingerdarm oder intravenös infundiert werden können direkte Vergleiche zu pharmakokinetischen Studien bei nicht-Lymphe kanülierten wachen Tieren und die Ergebnisse durchgeführt, können mehrere physiologisch relevant angesehen werden kann. Die längeren Zeitraum in wachen Tieren erlaubt hat auch den Vorteil, dass die Sammlung von voll pharmakokinetischen Profile für drug-Konzentrationen im Blut, während bei narkotisierten Versuchs sind Blutprofilen oft unvollständig, vor allem für lange Halbwertszeit Drogen. Wie oben beschrieben, jedoch ist die Erfolgsquote für bewusste Lymphe kanülierten Studien unteren und Experimente nehmen mehr Zeit in Anspruch. Es gibt zwei Arten der bewussten Lymphe Kanülierung Modelle in der Literatur beschrieben. In bewußt zurückhalt Modelle 15, im Anschluss an die Lymphe Kanülierung Operation wird das Tier einfach an seinem vorderen gedreht und in einer geeigneten Rückhalteeinrichtung für den Rest des Experiments mit der Lymphe Kanüle lagert und in ein Sammelrohr eingesetzt platziert. Das Tier wird dann wieder zu Bewusstsein und erholen sich von der Operation O / N. Die Erfolgsrate mit diesem Modell ist sehr gut in der Hand von erfahrenem Personal, aber es schwierig, Ethik Freiheit zu erhalten, um Tiere für den längeren Zeitraum für die Lymphe Einzug erforderlichen zurückhalten kann. Ein alternatives Modell ist, wo die Lymphe gesammeltvon bewussten und sich frei bewegenden Ratten. Dieses Modell wurde bisher 25 beschrieben worden. In diesem Modell langen Kanülen in den Mesenteriallymphknoten Kanal, Zwölffingerdarm und Halsschlagader eingesetzt. Die Kanülen werden dann unter der Haut getunnelt, an der Rückseite des Nackens nach außen geführt und durch ein Schwenksystem angeordnet. Die Ratte wird in einem Kabelbaum zur Schwenk befestigt und erlaubt das Bewusstsein wiedererlangen und von der chirurgischen Prozedur O / N erholen platziert. Das Tier hat Freizügigkeit in einem metabolischen Käfig und Lymphe und Blutproben aus den Kanülen außerhalb des Käfigs externalisiert gesammelt werden. Mesenteriallymphknoten Kanülierung vor das einzige Werkzeug, das die direkte Auswertung der Lymphe Komponenten in ihrer Entstehungszustand ermöglicht. Lymph Kanülen wird am häufigsten bei Ratten beschrieben, wie die Operation ist weniger komplex als kleinere und große Tiere, das Modell kostengünstiger als große Tiere und Ergebnisse maßen vergleichbar über Artgrenzen 27 angezeigt. Die Ratte-Modusl kann geändert werden, je nach Bedarf und der experimentellen Erfolgsquote ist hoch in den Händen von erfahrenem Personal. Das Modell kann auch in Verbindung mit anderen in vitro oder in vivo Studien gekoppelt werden, um zu untersuchen, im Detail, den Metabolismus oder die Funktion der Darm Lymphe Komponenten. Einmal etabliert die Mesenteriallymphknoten kanülierte Ratten-Modell ist daher ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Konzentration, den Transport, die Funktion und Metabolismus von verschiedenen Parametern, die direkt aus dem Darm passieren, um dem lymphatischen System (und in vielen Fällen fließt schließlich in den systemischen Kreislauf) zu bewerten.

Lymph fließt aus dem Dünndarm über eine unidirektionale Prozess, die zu einem Einzel Lacteals die innerhalb jeder Dünndarmzotten 1 enthalten sind, stammt. Lacteals sind relativ durchlässig für Flüssigkeit, Makromoleküle und Zellen und Lymphbildung damit beginnt mit der Eingabe von diesen Faktoren Lacteals. Der anfängliche Lymphe in den Chylusgefässe fließt anschließend aus dem Darm über ein Netz von lymphatischen Mikrogefäße, Sammeln (afferenten) Lymphgefäße, eine Reihe von Mesenteriallymphknoten und letztlich den postKnoten (efferenten) Lymphgefäße. Innerhalb der Knoten geht Lymphe durch eine Reihe von Markhöhlen, wo Austausch mit Knoten resident Immunzellen sowie Material in die Knoten aus dem Blut stattfindet. Alle Lymphe aus dem Dünndarm fließt schließlich konvergiert in den ableitenden überlegen Mesenteriallymphknoten Kanal und anschließend die Cisterna chyli. Die Cisterna chyli speichert auch Lymphdrainage die Schwanz peripheren Geweben, intestinal, Leber- und Lendenwirbelsäule und schließt sich dem Brust Lymphe Kanal zusammen mit Lymphe aus dem Mediastinum und Schädel Teile des Körpers. Der thorakale Lymphe Kanal mündet Lymphknoten direkt in das venöse System an der Verbindungsstelle der linken Vena jugularis und subclavia. Das hier beschriebene Protokoll, das die Sammlung von Lymphe aus der überlegenen Mesenteriallymphknoten Kanal ermöglicht direkt, erleichtert so die Analyse der verschiedenen Faktoren im Transit direkt aus dem Darm in die systemische (allgemein) Kreislauf über die Darm Lymphsystem. Die wichtigsten physiologischen Funktionen der Darm lymphatische System zugeordnet sind, um eine Fluidgleichgewicht aufrechtzuerhalten, um Lipid und lipophilen Molekülabsorption zu erleichtern und die entsprechende Immunantworten 1 zu ermöglichen. Tumorzellen und Viren über die Darm Lymphgefäße 2-4 und wichtigsten Änderungen in den Lymphgefäßen treten in mehreren Entzündungs- und Stoffwechselerkrankungen 5-7 propagieren auch. Könnennulation der Mesenteriallymphknoten Kanal zu sammeln Lymphe in das Mesenterium ermöglicht eine Analyse der Hauptfluidströmung über die Darm Lymphgefäße sowie die Quantifizierung der Konzentration und der Transportgeschwindigkeit von verschiedenen Zellen und Moleküle. Änderungen in der Konzentration oder Transit dieser Faktoren in Reaktion auf verschiedene Herausforderungen (zB Diäten, Antigene, Medikamente) und in Krankheitsmodellen (zB Colitis, HIV, Diabetes) beurteilt werden kann. Während es unmöglich, jede lymph Komponente, die analysiert und verglichen werden können, hier ausführlich beschrieben ist, Mesenteriallymphknoten vereinfachend aus wässrigen, Lipid- und zellulären Phasen. Interessierenden Komponenten in der wässrigen Phase umfassen Peptide und Proteine, wie Antigene oder Tolerogene 8, Immunbotenstoffen wie Zytokinen und Mastzellmediatoren 9 und metabolische Mediatoren wie Inkretine 10. Die Zellfraktion des post-Knoten Mesenteriallymphknoten besteht fast vollständig (über 99%) der lymphocytes 11. Verschiedene Immunzellen (dendritische Zellen, Mastzellen, etc.) geben Sie die Vor-Knoten mesenterialen Lymphgefäße, bleiben aber innerhalb des Knotens 12. Wenn die Zellen in afferenten Lymphknoten von Interesse sind, ist es möglich, diese Zellen durch Entfernen des Mesenteriallymphknoten sammeln Knoten einige Tage vor der Kanülierung der Mesenteriallymphknoten Kanal 12. Auf diese Weise wird die zu- und abführenden Lymphbahnen direkt verbunden sind und die Lymphzellen in afferenten Lymphe passieren direkt in den Mesenteriallymphknoten Kanal. Die Transit-und Phänotyp der verschiedenen Immunzellen, die durch die Darm Lymphgefäße können so überprüft werden. Vielleicht die häufigste Ursache für das Sammeln Mesenteriallymphknoten bisher zitierten, jedoch ist die Darmverarbeitung, Absorption und den Transport von Nahrungslipiden und lipophile Moleküle 10 zu studieren. Nach Einnahme werden die Nahrungslipiden verdaut (beispielsweise aus Triglyceriden zu Fettsäuren und Monoglyceride, phospholipid Fettsäuren und Lysophospholipid und Cholesterinester zu Fettsäure und Cholesterin, etc.) und aus dem Darmlumen in kleine Mizellen und vesikuläre Strukturen durch die Zugabe von Amphiphilen von Gallen dispergiert (Phospholipide, Cholesterin und Gallensalze) und die Wirkung von Pankreasenzyme 10,13. Von hier aus werden sie in Enterozyten absorbiert. Ein Teil der absorbierten Komponenten werden erneut veresterte Triglyceride, Phospholipide und Cholesterinester in der absorptionsfähigen Zellen (Enterozyten) zu bilden. Diese Wieder verestert Lipide werden aus einer Kombination von exogen aufgenommen Lipidkomponenten und endogene Lipidkomponenten aus dem sezernierten Gallen, Schleimhautlipidpools oder intestinalen Blutversorgung 13 zusammengesetzt. Von hier werden die veresterten Lipide entweder innerhalb Enterozyten gespeichert oder in Darm Lipoproteine ​​(Chylomikronen, Lipoproteinen sehr niedriger Dichte (VLDL)), zusammen mit verschiedenen Apoproteine ​​und andere lipophile Moleküle (gebaut <em&gt; zB Vitamine) 10,13. Nach dem Austritt aus Enterozyten Lipoproteine ​​sind spezifisch aus dem Darm in den systemischen Kreislauf über den mesenterischen Lymphsystem transportiert, da die Darm Lacteals durchlässiger sind, ihre Eingabe über das Darm Blutkapillaren. Ein Anteil der absorbierten Lipidkomponenten sind ebenfalls aus dem Darm in die Blutkreislauf über die Blutkapillaren und Pfortader als einzelne, nicht-Lipoprotein-assoziierten transportiert Moleküle 14. Im Allgemeinen ist jedoch die Pfortader Transportweg nur ein wichtiger Akteur bei der Aufnahme von kurz- und mittelfristigen Kettenlänge Lipiden. Die Sammlung von Mesenteriallymphknoten ermöglicht somit die Bewertung der Transport von Lipoproteinen und zugehörige Komponenten (Lipide, lipophile Moleküle, apo-Proteine) aus dem Darm. Die Lipoproteine ​​können quantifiziert werden und dadurch mit dem Vorteil, dass Mesenteriallymphknoten Lipoproteine, sind im allgemeinen in einer nascenT-Zustand, da sie nicht ausführlich durch systemische Enzyme, wie Lipoproteinlipase 15 modifiziert. Während die Mesenteriallymphknoten kanülierte Ratten-Modell hat vielleicht historisch am besten unter zur Analyse von Lipid / Lipoprotein-Transport aus dem Darm beschrieben, ist ein Bereich der expandierenden Interesse die Rolle von Lymphgefäßen in den Transport von lipophilen Arzneimitteln, Prodrugs und andere Xenobiotika 13,16 das ist der Schwerpunkt des hier beschriebenen Modells. Lipophile Medikamente (im allgemeinen solche mit log P&gt; 5 und Löslichkeit in langkettigen Triglycerid&gt; 50 mg / g, obwohl Ausnahmen offensichtlich sind) 17,18, Prodrugs 19 und anderen Fremdstoffen 13,16 kann der Zugriff auf die Darm Lymphgefäße entweder passiv oder gewinnen aktiv die Integration in Darm-Lipoprotein Transportwege 19. Die Ratte Mesenteriallymphknoten Kanülierung Technik hat somit viele Anwendungen. Bollmann et al. Beschriebenen ersten einen technique die Mesenteriallymphknoten Kanal in Ratten 1948 20 kanülieren. Seitdem wurde eine Vielzahl von Variationen des Modells beschrieben. So kann beispielsweise auftreten, wenn die Sammlung Ratte ist mit verschiedenen Anästhetika 21,22 betäubt oder im bewussten Zustand zurückgehalten, während 15 oder frei beweglichen 23,24. (- 5 ml / h in der Regel 0) 25 Ratten unterschiedliche Rehydratationslösungen und andere Substanzen, wie Lipide und Arzneimittelformulierungen mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten in den Magen, Darm oder parenteral verabreicht werden. In einigen Studien wurde die thorakale Lymphe Kanal anstatt Mesenteriallymphknoten Kanal Kanüle eingeführt, um den Transport vom Darm über die Lymphbahnen zu schätzen, obwohl dies Transit aus dem Dünndarm überschätzen, in Abhängigkeit von der Faktor von Interesse, da die Brust Lymphe Kanal empfängt auch Lymphe anderer Regionen 22,26. Lymph Kanülierung Modelle wurden auch in einigen anderen Spezies einschließlich Mäusen 15,27, Mini pi beschriebengs 12, Schafe 28,29, Schweine und Hunde 30 31. Allerdings ist der Rattenmodell der am weitesten und konsistent zitiert. Detaillierte Protokolle für die Kanülierung der Mesenteriallymphknoten Kanal gefolgt von Sammlung von Lymphe in bewusster 25 oder 22 narkotisierten Ratten und Mäusen 15,27 vorher veröffentlicht worden und der interessierte Leser wird auf diese Protokolle gerichtet. Dieses Protokoll ist die erste, die Technik in eine visualisierte Format zeigen. Die Lymphe kanülierten Ratten-Modell hat Vorteile gegenüber größeren Tiermodellen in Bezug auf die Kosten, die Leichtigkeit der Operation und ethische Erwägungen. Im Vergleich zum Maus-Modell, ist Mesenteriallymphknoten Kanülierung Chirurgie auch einfacher in der Ratte, obwohl die Maus-Modell ermöglicht genauere Untersuchungen in transgenen Tieren 27. Dennoch gibt es einige Einschränkungen des Rattenmodells, insbesondere mit Unterschieden in der Physiologie assoziiert werden können und die extrapolatIon zu anderen präklinischen und klinischen Situationen. Zum Beispiel bei der Ratte Gallenfluss konstant und unabhängig von der Nahrungsaufnahme während in höheren Arten Essen ist oder Lipide zu stimulieren Gallenfluss 32. Dies schafft Herausforderungen für den Erhalt Vertreter vor und nach dem Essen-Umgebungen in der Ratte, das, was in größeren Arten und Menschen gesehen zu reflektieren. Für den Wirkstofftransport Studien, können die größeren Arten auch bei der Beurteilung Lymphtransports nach der Verabreichung von realistischen menschlichen Dosis bildet 25 vorzuziehen. In einer aktuellen Studie wurden Lipidtransport im Mesenteriallymphknoten gefunden über Artgrenzen (Maus, Ratte, Hund) nach Verabreichung einer äquivalenten Masse und Art der Lipid, das ein gewisses Vertrauen in die Extrapolation Lipidtransport von Daten über Arten 27 liefert vergleichbar sein. Doch der Transport eines Modells lipophiles Arzneimittel, Halofantrin, in der Reihenfolge der Tiergröße (dh Hund&gt; Ratte&gt; Maus) eingestuft. Ein Skalierungsfaktor kann somit ex erforderlichtrapolate lymphatischen Medikamententransportdaten von der Ratte auf andere Arten. Eine Beschränkung der Lymphe Kanülierung Modelle im Allgemeinen ist, dass passive Lymphe Sammlung direkt von einer lymphatischen Kanal kann Lymphfluss und Transport ändern, da Lymphgefäße arbeiten gegen ein Druckgefälle, die geändert wird, wenn das Schiff eine Kanüle 33. Die Lymphe Kanülierung Modell kann auch schwierig sein, in Laboratorien, die nicht vertraut mit der Technik sind zu etablieren. Alternative Modelle wurden somit beschrieben worden. Zum Beispiel kann die Durchfuhr von Faktoren über den Darm lymphatischen Systems, wie Lipoproteine ​​und lipophile Moleküle, wurde indirekt über die Sammlung von Blut untersucht. Ein solches Modell beinhaltet den Vergleich Blutkonzentrationen von Lipiden und / oder Drogen nach oraler Verabreichung in der Anwesenheit und Abwesenheit von Inhibitoren (zB Colchicin, Pluronic L81, Cycloheximid) von Darm Lipoprotein-Produktion, die Lymphtransports 34 zu blockieren. Ein Vorteilvon Modellen, die Lymphtransports quantifizieren indirekt über Entnahme von Blutproben ist, dass es ermöglicht eine Bewertung der Lymphtransports beim Menschen als invasive Chirurgie ist nicht erforderlich 35. Inhibitoren der Lymphtransports sind jedoch nicht spezifisch, und Faktoren, die durch die Lymphgefäße transportiert werden verdünnt und in den systemischen Kreislauf, die eine solche Beurteilung erschwert modifiziert. In vitro-Alternativen sind ebenfalls beschrieben worden. Beispielsweise wurden Caco-2-Zellkulturen oder isolierte Enterozyten verwendet worden, um genauer zu untersuchen die intestinale Sekretion von Molekülen, die Lymphgefäße 36-38 einzugeben. Eine fortschrittliche In-vitro-Modell, das eher dem menschlichen Darm-Mikroumgebung ist auch kürzlich beschrieben 39. In diesem Modell wird eine lymphatische endotheliale Zellschicht co-kultiviert mit Caco-2-Zellen, die eine detaillierte Analyse der Übergang von Stoffen aus dem Darm in das Lymphsystem zu können. Jedoch in vitro Zellsystemen fehlt Wechselstrom und übertragen also die Zusammenschaltung mit einem Darmlumen und die zugrunde liegenden Blut-und lymphatischen Gefäßversorgung. In einem alternativen Ansatz Kassis et al. Wurde ein Dual-Channel (High-Speed-Hellfeld-Video und Fluoreszenz) in situ-Bildgebungssystem, das quantitative Vergleiche zwischen Gefäßkontraktion, den Lymphfluss und fluoreszierende Lipidkonzentrationen in mesenterialen Lymphgefäße 33 ermöglicht. Ein Vorteil dieses Modells gegenüber dem oben erwähnten in-vitro-Systemen ist, dass es ermöglicht, eine genaue Überwachung des Durchgangs von Immunzellen durch die Lymphgefäße. Absolute Messung von Massen Lipid (oder Drogen) Transport sind jedoch noch nicht mit bildgebenden Verfahren fest In vitro. Und in silico Ansätze speziell vorherzusagen das Ausmaß der lipophilen Wirkstofftransport über die Darm Lymphgefäße wurden ebenfalls veröffentlicht 40-42. Zum Beispiel kann die ex vivo-Affinität von mehreren compounds für Plasma Chylomikronen erwies sich recht gut mit ihren lymphatischen Transport in vivo 41 korrelieren. Anschließend etablierte eine dieselbe Gruppe in silico-Modell der Drogenaffinität für Chylomikronen basierend auf mehreren physikalisch-chemischen Eigenschaften 40 vorherzusagen. Holm et al. Darüber hinaus ein in silico-Modell relativ komplex komplett zu prognostizieren lymphatischen Transport lipophiler Verbindungen auf der Basis der molekularen Deskriptoren 42. Diese Modelle können einen sinnvollen Ansatz, um das Ausmaß des lymphatischen Transport von unbekannten Drogen vorherzusagen ist. Validierung der Modelle mit einer breiten Palette von Medikamenten und in verschiedenen Labors werden jedoch aufgefordert werden, ihre Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zu bestätigen. Kanülierung der Mesenteriallymphknoten Kanal bleibt somit das einzige Mittel, um den Inhalt der Lymphdrainage des Dünndarms und der Transitgeschwindigkeit des komplexen Reihe von Faktoren (Zellen, Proteine ​​direkt zu untersuchen,Peptide, Lipide, Arzneimittel) in der Lymphe bei einer in vivo-Situation. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Kanülierung der Mesenteriallymphknoten Kanal und Halsschlagader, die die Sammlung von Mesenteriallymphknoten und systemischen Blut von narkotisierten Ratten ermöglicht. Repräsentative Daten zeigen, wie das Modell verwendet, um Lipid- und Arzneistofftransport aus dem Darm über die mesenterischen Lymphsystem zu untersuchen. Dies wird durch eine Erörterung der Schwierigkeiten, die bei der Festlegung des Modells sowie Informationen zur Fehlerbehebung auftreten können, gefolgt. Einmal etabliert das Modell ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Darm-lymphatischen Transport zu untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >Sterile saline</td>
			<td>Baxter healthcare</td>
			<td>AHB 1307</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is Baxter 100 ml saline bags, box of 50</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70 % ethanol in water</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chlorhexidine gluconate solution (Microshield 4)</td>
			<td>Livingstone International</td>
			<td>JJ60243L</td>
			<td>Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&#38;CAT=6&#38;search 
			=JJ60243L</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Betadine solution</td>
			<td>Livingstone International</td>
			<td>BU0510</td>
			<td>Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&#38;CAT=6&#38;search 
			=BU0510</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ilium Ketamil (Ketamine 100 mg/ml)</td>
			<td >PROVET VICTORIA&#160;</td>
			<td >KETA I 1</td>
			<td>http://www.provet.com.au/</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ilium Xylazil (Xylazine 100 mg/ml)</td>
			<td >PROVET VICTORIA&#160;</td>
			<td >TRO-3828</td>
			<td>http://www.provet.com.au/</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ACP 10 Injection (Acepromazine 10 mg/ml)</td>
			<td >PROVET VICTORIA&#160;</td>
			<td >VTG-DACP010020</td>
			<td>http://www.provet.com.au/</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium pentobarbitone</td>
			<td>PROVET VICTORIA&#160;</td>
			<td>24529</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is Lethabarb&#174; 325 mg/ml sodium pentobarbitone, Virbac Animal Health. http://www.provet.com.au</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heparin (35000I.U. in 35 mL)</td>
			<td>Sigma Pharmaceuticals</td>
			<td>337220</td>
			<td>http://sigmaco.com.au/</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >E1644</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is disodium salt of EDTA from Sigma.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.96 mm x i.d. 0.58 mm</td>
			<td>Microtube extensions</td>
			<td>PE8050</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.8x0.5 mm, 30 m</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.8 mm x i.d. 0.5 mm</td>
			<td>Microtube extensions</td>
			<td>PE9658</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.96x0.58 mm, 30 m</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ruler</td>
			<td>Any</td>
			<td ></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Markers</td>
			<td>Any</td>
			<td ></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cigarette lighter</td>
			<td>Any</td>
			<td ></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cyanoacrylate glue</td>
			<td>Any</td>
			<td ></td>
			<td>Any brand can be used</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >23 gauge needles</td>
			<td>Livingstone International</td>
			<td>DN23GX0.75LV</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 23GX0.75inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&#38;CAT= 
			6&#38;search=DN23GX0.75LV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >25 gauge needles</td>
			<td>Livingstone International</td>
			<td>DN25GX1.0LV</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 25GX1.0inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&#38;CAT=6&#38;search= 
			DN25GX1.0LV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 ml syringe</td>
			<td>Livingstone International</td>
			<td>T3SS01TA</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 1 ml Slip Tuberculin 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&#38;CAT=6&#38;search 
			=T3SS01TA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 ml syringe</td>
			<td>Livingstone International</td>
			<td>T3SS10SA</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 10 ml Slip 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&#38;CAT=6&#38;search 
			=T3SS10SA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gauze swabs</td>
			<td>Livingstone International</td>
			<td>GSC075</td>
			<td>Any brand can be used and cut to required size. Example here is gauze swabs cotton filled 7.5x7.5 cm, 8 ply. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&#38;CAT=6&#38;search 
			=GSC075</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cotton buds</td>
			<td>Livingstone International</td>
			<td>CTAST075DP</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is Livingstone cotton applicator plastic double tipped. 75MM. 100/PK. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&#38;CAT=6&#38;search 
			=CTAST075DP</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating pad</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>WT1</td>
			<td>Any brand that keeps temperature at 37C can be used. Example here is Ratek warming tray.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Surgical light</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-0215 with 72-0267</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is Harvard apparatus V-Lux 1000 Cold Light Source with Bifurcated Gooseneck Light Guide, Black, 4.7 mm fiber diameter (each arm). http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_ 
			-1_HAI_ProductDetail and&#160; http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_35487_ 
			-1_HAI_ProductDetail___</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Surgical microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>495005-0014-000</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000-C with Stand S Double Spot and KL 300 LED. https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&#38;p=us&#38;f=e&#38;i=10143</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silk suture</td>
			<td>Livingstone International</td>
			<td>DTSK163019F4</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is *&#160; 
			Email this item to my friend 
			3/8 Circle Reverse Cut Silk Suture 3/0 Thread 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&#38;CAT=6&#38;search 
			=DTSK163019F4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scalpel blades</td>
			<td >Fine Science Tools (FST)</td>
			<td >10020-00</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Blade #20. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scalpel handle</td>
			<td >Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>10004-13</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Handle #4. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&#38;CategoryId=51</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 x Small surgical scissors</td>
			<td >Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is FST Fine Scissors, 9 cm with 21 mm cutting edge, sharp, straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&#38;CategoryId=17</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 x Forceps with serrated curved tip</td>
			<td >Fine Science Tools (FST)</td>
			<td >11001-13</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is FST 13 cm standard pattern forceps with curved 2.8x1.4 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&#38;CategoryId=32</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 x Iridectomy scissors</td>
			<td >Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is FST Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge, Straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=17&#38;CategoryId=16&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 x Forceps with straight serated tip</td>
			<td >Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11650-10</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is FST Graefe 10 cm straight with serrated 1 x 0.99 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=390&#38;CategoryId=32</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 x Forceps with smooth sharp straight fine tip</td>
			<td >Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is FST Dumont #5 forceps straight 11cm with 0.08 x 0.04mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=335&#38;CategoryId=29</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 x Forceps with smooth fine curved forceps</td>
			<td >Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11063-07</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is FST Delicate Forceps 9 cm with smooth 0.4 x 0.3mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=360</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 x Hemostats</td>
			<td >Fine Science Tools (FST)</td>
			<td >13010-12</td>
			<td>Any brand can be used. Not all operators use the hemostats. Example here is FST 12 cm Micro-Mosquito Hemostats with 20 mm length x 1.3 mm width serrated, straight tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&#38;CategoryId=33</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 x Suture needle holder</td>
			<td >Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>12001-13</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is FST 13cm Hasley Needle Holder with 16 mm length x 1.9 mm width tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&#38;CategoryId=70</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 x Artery clamp</td>
			<td >Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>18050-28</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is FST Bulldog Serrefines straight, 28 mm long, 9x1.6 mm jaw dimension with medium clamp press. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=270&#38;CategoryId=82</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oleic acid</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >O1008</td>
			<td>When required, any brand can be used. Example here is 99% pure oleic acid. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/o1008?lang=en&#38;region=AU</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >14C-oleic acid</td>
			<td >Perkin&#160;</td>
			<td>NEC317050UC&#160;</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is Oleic Acid, [1-14C]-, 50&#181;Ci (1.85MBq). http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/NEC317050UC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium taurocholate</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >T4009</td>
			<td>Any brand can be used. Example here is taurocholic acid sodium salt hydrate &#8805;95% (TLC) . http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4009?lang=en&#38;region=AU</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Halofantrine</td>
			<td >Glaxo Smith Kline</td>
			<td ></td>
			<td>Halofantrine was kindly provided as a gift from Glaxo Smith Kline</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium phosphate monobasic</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >71507</td>
			<td >Any brand can be used. Example here is sodium phosphate monobasic monohydrate, BioXtra, for molecular biology, &#62;99.5%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71643?lang=en&#38;region=AU</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium phosphate dibasic</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >71643</td>
			<td >Any brand can be used. Example here is sodium phosphate dibasic dihydrate, BioUltra, for molecular biology, &#62;99%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71507?lang=en&#38;region=AU</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mesenteric lymph duct cannulated rat model: application to the assessment of intestinal lymphatic drug transport

Die Darm Lymphsystem spielt eine Schlüsselrolle in den Flüssigkeitstransport, Lipidabsorption und Immunfunktion. Lymph fließt direkt aus dem Dünndarm über eine Reihe von Lymphgefäßen und Knoten, die an der oberen Mesenteriallymphknoten Kanal konvergieren. Kanülierung der Mesenteriallymphknoten Kanal ermöglicht somit die Sammlung von Mesenteriallymphknoten aus dem Darm fließt. Mesenteriallymphknoten aus einer Zellfraktion von Immunzellen (99% Lymphozyten), wässrige Fraktion (Flüssigkeit, Peptide und Proteine, wie Zytokinen und Darmhormone) und Lipoproteinfraktion (Lipide, lipophile Moleküle und apo-Proteine). Die Mesenteriallymphknoten Kanal Kanülierung Modell kann daher verwendet, um die Konzentration und die Geschwindigkeit der Beförderung einer Reihe von Faktoren aus dem Darm über das lymphatische System zu messen. Änderungen dieser Faktoren in Reaktion auf verschiedene Herausforderungen (zB Diäten, Antigene, Medikamente) und bei Krankheiten (zB entzündliche Darmerkrankung, HIV, Diabetes) kann auch be bestimmt. Ein Bereich des expandierenden Interesse ist die Rolle des lymphatischen Transport bei der Absorption von oral verabreichtem lipophile Arzneimittel und Prodrugs, die mit Darmlipidaufnahmewege zuzuordnen. Hier beschreiben wir im Detail eine Mesenteriallymphknoten Kanal kanülierten Ratten-Modell, die Bewertung der Geschwindigkeit und Ausmaß der Lipid- und Wirkstofftransport über das lymphatische System ermöglicht mehrere Stunden nach einer Darm Lieferung. Das Verfahren ist leicht an die Messung von anderen Parametern in der Lymphe. Wir bieten ausführliche Beschreibungen der Schwierigkeiten, die bei der Festlegung dieser komplexen chirurgischen Verfahren auftreten können, sowie repräsentative Daten aus fehlgeschlagenen und erfolgreichen Experimenten Anleitung zur experimentellen Erfolg zu bestätigen und die erhaltenen Daten zu interpretieren ist.

Die Ergebnisse eines repräsentativen Experiments, das kumulierte Ausmaß und Geschwindigkeit der Lipid- und Arzneistofftransport über das Lymphsystem folgenden Intestinallieferung Verwendung der Mesenteriallymphknoten Kanülierung Modell zur Quantifizierung sind in Abbildung 4 und 5 gezeigt. In diesem Experiment wurden 200 ug des Modells lipophilen und 7,1 mg 2-Monoolein in 5,6 ml 5 mM Natriumtaurocholat in Phosphat-gepufferte verteilt - Drogen Halofantrin wurde in den Zwölffingerdarm von Ratten über 2 h in einer Formulierung, die 40 mg Ölsäure (5 &amp; mgr; Ci 14 C-Ölsäure 2 Jahre) verabreicht Kochsalzlösung pH 6,9. Folgende Formulierung Verabreichung wurden die Ratten mit einer Rate von 2,8 ml / h bei normaler Kochsalzlösung in den Zwölffingerdarm infundiert rehydratisiert. Lymphe wurde kontinuierlich in Röhrchen für 10 h geändert wurde jede Stunde gesammelt. Die Formulierung wurde hergestellt, und das Experiment durchgeführt wird, gemäß einem vorher für eine Formulierung, die alle die gleiche compon beschriebenen ProtokollEltern, außer es nicht sind 2-Monoolein 43. Wie in Figur 4 gezeigt ist, in diesen experimentellen Bedingungen die mittlere Lymph- Flussrate für erfolgreich kanülierte Ratten lag zwischen 0,4 bis 1,3 ml / hr. In einigen Ratten war der Lymphfluss Rate in der ersten 1 etwas niedriger - 3 Stunden nach Kanülierung und dann erhöht. Dies wird allgemein folgende Lymphe Kanülierung gesehen. Auch in Abbildung 4 dargestellt ist der Lymphfluss Rate für eine nicht erfolgreiche Versuch. In diesem Fall bleibt die Strömungsgeschwindigkeit wesentlich niedriger als die in den erfolgreichen Experimente ganzen Erfassungszeitraum gesehen. In ähnlicher Weise wird der kumulierte lymphatischen Transport von Triglycerid und Halofantrin war in dem erfolglosen Versuch (5A und B) wesentlich geringer. Die mittlere kumulative Halofantrin Transport in der erfolgreichen Gruppe betrug 15,1% der Dosis betrug die kumulative Triglycerid-Transport 61 mg über 10 h und der Anteil der verabreichten radiolabelled exogenen Lipiddosis in Lymphe transportiert 54% (5C). Diese Werte sind nicht signifikant unterschiedlich zu der vorher für eine ähnliche Formulierung, die die gleichen Komponenten mit Ausnahme der Abwesenheit von 2-Monoolein 43 (Tabelle 1) enthalten angesehen. Dies deutet darauf hin, daß Formulierungen, die Fettsäuren in der Abwesenheit von einer Quelle von Monoglycerid ähnliche Lipid- und Wirkstofftransport in die Lymphe solche, die Monoglycerid auch unterstützen. Dieses Ergebnis wird bei der Erläuterung beschrieben. 5D zeigt repräsentative Daten für die Geschwindigkeit der Halofantrin und Triglycerid-Transport in der Lymphe im Laufe der Zeit nach der Verabreichung. Die Transportgeschwindigkeit sowohl Triglycerid und Drogen in Lymphe Gipfel ein paar Stunden nach der Lipid and Drug Administration und dann auf das Ausgangsniveau zurück. Wie es typisch in intestinalen lymphatischen Lipid- und Wirkstofftransportexperimente, die Geschwindigkeit der Arzneimittel transport in der Lymphe während jeder Zeitperiode, die für die Spiegel Triglycerid Transport als Arzneimittel gesehen in der Lymphe in Assoziation mit den Triglycerid-reichen Lipoproteinen transportiert. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52389/52389fig1highres.jpg" /> Abbildung 1 Schematische Darstellung der Form der abgeschrägten Spitze einer Arteria carotis oder Lymphe Kanüle, und der J-förmigen abgeschrägten Spitze eines Duodenalkanüle. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52389/52389fig2highres.jpg" /> Figur 2 Fotografien von (A) das Abdomen in Vorbereitung rasiert, um die Lymphe Kanal kanülieren, (B) die Bauchmuskelwand geöffnet mit einem 4 cm lange Inzision, die sich von der Mittellinie auf der rechten Seite auf die Lymphe Kanal zuzugreifen, und (C ) die überlegene Mesenteriallymphknoten Kanal (in gelber Kreis)<html> senkrecht zur rechten Niere. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52389/52389fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52389/52389fig3highres.jpg" /> Abbildung 3. Fotografien von (A) der Halsschlagader mit zwei Seidenfäden mit der am nächsten an den Betreiber abgebunden, (B) der Halsschlagader getrennt und die Durchblutung mit einem Paar gerader feine Spitze Pinzette unter der Arterie verschlossen isoliert, und (C) eine Halsschlagader mit Kanüle an Ort und Stelle und die Durchgängigkeit durch Zurückziehen eine kleine Menge Blut überprüft. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52389/52389fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> 4 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52.389 / 52389fig4highres.jpg &quot;/&gt; Abbildung 4. Repräsentative Daten für Mesenteriallymphknoten Flussrate (&amp; mgr; l / h) über die Zeit. Die Ratten wurden eine Formulierung, die 200 ug Halofantrin, 40 mg Ölsäure (mit 2 &amp; mgr; Ci 14 C-Ölsäure) und 7,1 mg 2-Monoolein in 5.6 verabreicht ml 5 mM Natriumtaurocholat in phosphatgepufferter Salzlösung (pH 6,9) 0-2 Stunden. Die gezeigten Daten sind der Mittelwert ± SEM für n = 3 erfolgreiche Experimente (geschlossene Kreise, ●) und n = 1 losen Ausgang (offene Dreiecke, Δ). <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52389/52389fig5highres.jpg" /> Abbildung 5. Repräsentative Daten für die Lipid-und Drogentransport in Mesenteriallymphknoten. Kumulative Transport von (A) der Modellarznei Halofantrin (Hf% Dosis), (B) Triglycerid (TG, mg) und (C) exogener Fettsäure (% dose) und die Transportrate (D) TG (mg / h) und Hf (% Dosis / h) in Mesenteriallymphknoten über die Zeit nach der Verabreichung einer Formulierung, die 200 ug Halofantrin, 40 mg Ölsäure (mit 2 &amp; mgr; Ci 14 C-Ölsäure) und 7,1 mg 2-Monoolein in 5,6 ml 5 mM Natriumtaurocholat in phosphatgepufferter Salzlösung (pH 6,9) 0-2 Stunden. Die gezeigten Daten sind der Mittelwert ± SEM für n = 4 erfolgreiche Experimente (geschlossene Kreise, ●) und n = 1 losen Ausgang (offene Dreiecke, Δ). Exogene Fettsäuretransport wurde in der erfolglosen Experiment gemessen, sondern ist in der Regel in der fehlgeschlagenen Experimenten gering. Daten für das erfolglose Versuch von Teil D der Übersichtlichkeit halber weggelassen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52389/52389fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td colspan="2"> Ohne monoolein </td><td colspan="2"> Mit 2-monolein </td></tr><tr><td></td><td> Bedeuten </td><td> SEM </td><td> Bedeuten </td><td> SEM </td></tr><tr><td> Halofantrin (% Dosis) </td><td> 15.1 </td><td> 0.8 </td><td> 15 </td><td> 1.6 </td></tr><tr><td> Triglyceride (mg) </td><td> 67 </td><td> 4 </td><td> 61 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> Gesamt-Fettsäure (umol) </td><td> 261 </td><td> 16 </td><td> 248 </td><td> 23 </td></tr><tr><td> Exogene Ölsäure (umol) </td><td> 82 </td><td> 5 </td><td> 65 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> Endogene Fettsäure (umol) </td><td> 180 </td><td> 17 </td><td> 183 </td><td> 28 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Vergleich der kumulativen lymphatischen Transportdaten über 10 Stunden nach der Verabreichung von 200 ug Halofantrin zur Lymphe Kanal kanülierten Ratten in Formulierungen mit 40 mg Ölsäure mesenterialen (mit deg 1 &amp; mgr; Ci 14 C-Ölsäure) in 5 mM Natriumtaurocholat ohne und mit 7,1 mg 2-Monoolein. Daten, emulgiert in phosphatgepufferter Salzlösung (pH 6,9) repräsentieren den Mittelwert ± SEM für n = 4 Ratten. Keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den 2 Gruppen gesehen. a aus der Gruppe mit 2-Monoolein ist dies nicht ein genaues Maß der endogenen Fettsäure Verkehr als Ölsäure, um die 2-Monoolein Gerüst gebunden ist nicht in der gemessenen exogene Oleinsäure Transport in Lymphe entfielen dosiert. b Die Daten für Halofantrin und Gesamtfettsäuretransport in der Gruppe dosiert ohne 2-Monoolein wurde zuvor in Figur 5 der Referenz 43 veröffentlicht und wird hier in Tabellenform wiedergegeben.

Watch this Scientific Journal Video about The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport at JoVE.com

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

Here we describe a technique to cannulate the mesenteric lymph duct in rats which enables quantification of lipid and drug transport via the lymphatic system following intestinal delivery. The technique can be adapted to assess mesenteric lymph concentrations and/or transport of fluid, immune cells, peptides, proteins and lipophilic molecules.

Die Mesenteriallymphknoten Duct Cannulated Rattenmodell: Anwendung auf die Bewertung der Darm Lymphatische Drug Transport

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

the-mesenteric-lymph-duct-cannulated-rat-model-application-to

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

28.3K Aufrufe.  Monash University (Parkville Campus). Here we describe a technique to cannulate the mesenteric lymph duct in rats which enables quantification of lipid and drug transport via the lymphatic system following intestinal delivery. The technique can be adapted to assess mesenteric lymph concentrations and/or transport of fluid, immune cells, peptides, proteins and lipophilic molecules.

Serie: The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Intravitalmikroskopie der Leistenbruch Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

Verstärkung und Quantifizierung von HIV-1 RNA in HIV-infizierten Personen mit Viruslast unter der Nachweisgrenze von Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Bildgebung des dem Maus-Kniekehlen-Lymphknoten

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

Nicht-invasive optische Abbildung des lymphatischen Gefäßsystem eines Maus

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

Generierung von Lymphknoten-Fett-Pad Chimären für die Studie der Lymphknoten Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode larvae of the genus Trichinella. The most important sources of human infections worldwide are game meat and pork or pork products. In many countries, the prevention of human trichinellosis is based on the identification of infected animals by means of the artificial digestion of muscle samples from susceptible animal carcasses.
There are several methods based on the digestion of meat but the magnetic stirrer method is considered the gold standard. This method allows the detection of Trichinella larvae by microscopy after the enzymatic digestion of muscle samples and subsequent filtration and sedimentation steps. Although this method does not require special and expensive equipment, internal controls cannot be used. Therefore, stringent quality management should be applied throughout the test. The aim of the present work is to provide detailed handling instructions and critical control points of the method to analysts, based on the experience of the European Union Reference Laboratory for Parasites and the National Reference Laboratory of Germany for Trichinella.

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

The prevention of human trichinellosis in many countries worldwide is based on the laboratory examination of muscle samples from susceptible animals by methods of digestion, of which the magnetic stirrer method is considered the gold standard.

Magnetrührers Verfahren zum Nachweis von<em&gt; Trichinella</em&gt; Larvae in Muskelproben

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Überexpression und Reinigung des Menschen<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Ein neuartiges Feeder-freie System für die Massenproduktion von murinen Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory bowel disease, asthma and arthritis. Thus, understanding the mechanisms underlying microbiota-immune system crosstalk is of crucial importance. Antibiotic administration, while aiding pathogen clearance, also induces drastic changes in the size and composition of intestinal bacterial communities which can have an impact on human health. Antibiotic treatment in mice recapitulates the impact and long-term changes in human microbiota from antibiotic treated patients, and enables investigation of the mechanistic links between changes in microbial communities and immune cell function. While several methods for antibiotic treatment of mice have been described, some of them induce severe dehydration and weight-loss complicating the interpretation of the data. Here, we provide two protocols for oral antibiotic administration which can be used for long-term treatment of mice without inducing major weight-loss. These protocols make use of a combination of antibiotics that target both Gram-positive and Gram-negative bacteria and can be provided either ad libitum in the drinking water or by oral gavage. Moreover, we describe a method for the quantification of microbial density in fecal samples by qPCR which can be used to validate the efficacy of the antibiotic treatment. The combination of these approaches provides a reliable methodology for the manipulation of the intestinal microbiota and the study of the effects of antibiotic treatment in mice.

Here we provide detailed protocols for the oral administration of antibiotics to mice, collection of fecal samples, DNA extraction and quantification of fecal bacteria by qPCR.

Quantitative Polymerase Kettenreaktion-basierte Analysen der murinen intestinale Mikrobiota nach Behandlung mit oralen Antibiotika

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and dysregulated repair. In inflammatory bowel disease (IBD), fibrosis leads to recurrent stricture formations for which there is no effective therapy other than surgical resection. Due to its late onset, the processes that drive fibrosis is less studied and largely unknown. Therefore, fibrotic complications represent a major challenge in IBD. In this protocol, a robust in vivo model of intestinal fibrosis is described where streptomycin pre-treatment of C57Bl/6 mice followed by oral gavage with vaccine grade Salmonella Typhimurium &#916;AroA mutant leads to persistent pathogen colonization and fibrosis of the cecum. Methodologies for preparing S. Typhimurium &#916;AroA for inoculation, quantifying pathogen loads in the cecum and spleen, and evaluating collagen deposition in intestinal tissues are explained. This experimental disease model is useful for examining host factors that either enhance or exacerbate CD-like intestinal fibrosis.

This protocol describes a mouse model of Salmonella driven intestinal fibrosis that resembles key pathological hallmarks of Crohn&#8217;s disease including transmural inflammation and fibrosis. This method can be used to evaluate host factors that alter fibrotic outcomes using mutant mice maintained on a C57Bl/6 genetic background.

Chronische Salmonelleninfektion induzierte Darmfibrose

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and ...