The authors would like to thank Dr. George Gittes for advice and expertise throughout this study. SSL was supported by an American Heart Association fellowship (11POST7330002). Further to this SSL and this study was supported by an NIDDK Mentored Research Scientist Development Award (DK096996) and by the Children&#8217;s Hospital of Pittsburgh.

NOTA: The University of Pittsburgh Institutional Animal Care e do Comitê Use aprovado todos os experimentos. 1. Preparação de Instrumentos Ultrasound-microinjeção e embriões <ol><li> Configure palco, montagem, e sonda (Figura 1), bem como os instrumentos cirúrgicos (Figura 2). Local solução salina tamponada com fosfato (PBS) (pH 7,4) em um banho de 37 ° C de aquecimento. Encha agulha de microinjecção inteiramente com óleo mineral, usando seringa de 1 ml ligada a uma segunda agulha G 25 flexível, através da sua base. </li><li> Corrigir agulha na rotação do braço de montagem, ea agulha vazia de solução de óleo mineral. Re-encher com 2,5 ml de solução de TL. Certifique-se que não há bolhas de ar no interior da agulha de injeção. Gire agulha braço em direção à parede, longe do palco. </li><li> Anestesiar a mãe grávida na câmara de anestesia através de infusão contínua de isoflurano. Quando a mãe fica inconsciente, transferir a anestesia para tubo nariz posicionado no caudal lado do palco, e lugar mãe em decúbito dorsal com o focinho no tubo nariz para permitir a continuação de um estado totalmente anestesiado. </li><li> Membros fita em ângulos de 45 °, ou com as mãos e os pés descansados ​​e posicionado overtop ECG / monitor de temperatura guias. É importante que a barragem grávida é continuamente monitorizado para assegurar que a anestesia é suficiente e que a pomada aplicada no para os olhos para reduzir a secura. </li><li> Aplique o produto de remoção de pêlos em toda a parte inferior do abdômen da mãe, limpe suavemente com cotonetes secos, e, em seguida, novamente com um 70% de cotonetes saturado de etanol para remover qualquer excesso de produto e cabelo. Certifique-se de limpar a pele abdominal off de todos os pêlos no local da incisão (Figura 3). </li><li> Realize uma laparotomia na mãe grávida usando uma pinça e tesouras cirúrgicas finas. Tome cuidado para evitar o corte quaisquer vasos grandes ou órgãos viscerais. Faça primeiro, incisão reta de epiderme 1,5-2 cm acima vagina e continuar em direção a cortar costelas para approximatEly 2-3 cm. Expor a membrana subcutânea, localizar a linha alba (&quot;linha branca&quot;) (Figura 3), e cortadas paralelamente à incisão inicial, ao longo do comprimento do mesmo, para expor interna órgãos viscerais e sáculo uterinas. </li></ol> 2. Extracção de Embriões <ol><li> Utilize aplicadores com ponta de algodão de 6 polegadas de manobrar mãe e embriões. Com cuidado, empurre (sem forçar) na pele com aplicador para manipular primeiro embrião de abertura da incisão. Após a extracção do primeiro sáculo embrião, cuidadosa e lentamente puxe o restante do corno uterino, através e para o exterior da matriz. Evite puxar intestino ou outros órgãos através da incisão nesta fase. </li><li> Quantificar embriões e coloque delicadamente corno uterino esquerdo de volta para a mãe. Em seguida, começar a colocar o corno uterino direito de volta para a mãe começando com o mais saccule embrião da vagina no chifre e se movendo para baixo. Continue até apenas dois embriões permanecem expostos (Fifigura 4). Por último, os embriões de posição em uma coluna acima e paralelo à incisão linha, sendo consciente para não cortar a circulação uterina. </li><li> Coloque blocos de argila e posição entre os braços e corpo, bem como pernas e cauda. Certifique-se de que as superfícies de argila são cerca de nível com incisão laparotomia. Molhe a placa de Petri fenestradas com 37 ° C PBS. </li><li> Segure estendem fórceps com a mão direita e fenestrated placa de Petri com a mão esquerda (fenestration paralelo aos embriões) e trazer fechado forceps ~ 5 cm através fenestration, a partir do topo da placa de Petri. Abertas forceps completamente sem rasgar malha fenestration. </li><li> Manobra mãos acima de embriões e foco vista sobre as duas sáculos embrião. Sem (ou levemente) tocando sáculos com entrosamento fenestration ou fórceps, deslize-os através de fenda e definir uma placa de Petri sobre abdômen da mãe. Com uma pinça ainda estendida, manipular malha fenestrado para encaixá-lo em ambos os lados e na base de cada embrião (Figura 5 </strong&gt;) e puxe uma pinça de abertura de fenda. </li><li> Em seguida, coloque borracha azul contendo parede em uma placa de Petri, sem beliscar ou ferir embriões (Figura 6). Certifique-se de blocos de argila estão firmemente equilíbrio placa de Petri, embrião, e da parede contendo borracha. Por fim, preencher placa de Petri com 37 ° C PBS até que os embriões são completamente submerso (Figura 6), enquanto que o controle de vazamentos na malha fenestrado. </li></ol> 3. Injeção Procedimento <ol><li> Lower fase de injeção com a mãe e os embriões para baixo, usando botão de ajuste de nível Z (Figura 1) e, em seguida, gire a agulha de injeção e braço montar e alinhar diretamente com sonda de ultra-som, com agulha ½ cm à esquerda e sob a ponta da sonda (Figura 7) . Empurre a agulha do braço (não agulha) 45 ° de distância da sonda. Tenha cuidado para não bater a ponta da agulha com a sonda de prato ou ultra-som. </li><li> Levante fase de injeção de volta à altura original, com ultra-som probe diretamente acima embriões Probe deve ser ligeiramente submersa e dentro de 3-4 mm do tecido embrionário. Use X &amp; Y botões de ajuste de fase (Figura 8) para alterar a posição do embrião / mãe / estágio para localizar sistematicamente a embrionário do coração batendo. </li><li> Diretamente Centro de tela ultra-som observar um marcador alvo centro preto desenhado (*). Localize ventrículo esquerdo (preferível) ou átrio usando os X &amp; Y botões de ajuste de fase (Figura 8) e, em seguida, aumentar ou diminuir o palco, usando o botão giratório no palco para posicionar-alvo injeção precisamente sobre o marcador de centro preto na tela do ultra-som. </li><li> Use X botão de ajuste de fase para mover embrião para a direita, fora da tela do ultra-som. Reposicionar agulha microinjeção e braço de volta no lugar, ½ cm de distância e 90 ° para a sonda de ultra-som (Figura 7). </li><li> Usando montar microinjeção botões de ajuste (Figura 9C-G), agulha de posição com a ponta claramente aligned com o marcador de centro. Ajuste o ângulo de injeção (usando botões na Figura 9C e EG), e X, Y, Z e vetores de micro-agulha para garantir a ponta da agulha está focada no plano correto. Retrair agulha microinjeção usando apenas o botão de &quot;injeção&quot; (Figura 9F), cuidado para não ajustar outras dimensões. </li><li> Mais uma vez, usando apenas o X de ajuste fino movimento botão fase de embrião de volta sob a sonda, com destino exatamente sobre o ponto central na tela do ultra-som. Certifique-se de que o ventrículo esquerdo é agora exactamente no mesmo X, Y, Z e plano. </li><li> Em seguida, com apenas o botão de &quot;injecção&quot; no micro-injecção de montagem, perfurar lentamente embrião com a agulha de microinjecção e gradualmente trazer ponta para o ventrículo esquerdo. Injectar o total de 2,5 ml de solução TL no ventrículo esquerdo ou até que os vazios sinais sonoros de alerta, ao considerar &quot;vazia&quot; e tocando &quot;encher&quot; uma vez (Figuras 2A e B). Neste momentoinjecção de observar uma sombra que emana a partir da ponta da agulha, a qual é o TL entrar para dentro da câmara cardíaca (Figura 10). Em sentido inverso, retrair rapidamente agulha microinjeção girando o botão de &quot;injeção&quot; (Figura 9F) sobre a microinjeção de montagem quando a injeção é completa. </li><li> Continue na próxima embrião e repetir este procedimento para embriões remanescentes após esta série de etapas e, finalmente, colocar os embriões finais de volta para o abdômen da barragem. Alterne anestesia para a caixa de câmara e mover suavemente mãe aqui para 15 min de tempo da última injecção. </li></ol> 4. A colheita Embriões e Análise <ol><li> Sacrifique barragem via luxação cervical. Expandir a incisão laparotomia para remover facilmente cornos uterinos da mãe. Mantenha os embriões dentro sac uterina. Coloque embriões em refrigerados PBS. </li><li> Dissecar embriões de sac uterino (se o tecido coleta necessária para genotipagem) e coloque todo o embrião in 4% de paraformaldeído (PFA) durante a noite, em seguida, em 30% de sacarose durante a noite, congelar no cryostat corte médio. Em seguida, corte o cryosection e colocá-lo em lâminas para análise imuno-histoquímica. Opcionalmente, usar tecidos para todo o monte por desidratação em 100% de metanol, subsequente à fixação, em PFA a 4%. </li><li> Para a análise imuno-histoquímica colocar os criosecções em PBS para remover o OCT. Em seguida, bloquear as secções com 10% de soro de burro normal, durante 30 min. Em seguida, adicionar PECAM anticorpo primário a diluição 1: 100 durante a noite a 4 ° C. No dia seguinte, lavar as lâminas em PBT 3 vezes durante 10 minutos cada e adicionar burro anti-rato secundária 594 e incubar durante 1 h à TA. NOTA: Esta é uma técnica altamente exigente que requer a otimização e coordenação de ultra-som e microinjecção. Há uma curva de aprendizado muito íngreme relacionados a essa técnica e requer de quatro a seis semanas de injeções mentor antes de a pessoa se torna proficiente. </li></ol>

<ol>
	<li>Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+formation+of+microvasculature+in+the+developing+kidney.">Origins and formation of microvasculature in the developing kidney.</a> Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).</li><li>Sims-Lucas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Progenitors+Exist+within+the+Kidney+and+Lung+Mesenchyme.">Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme.</a> PloS one. 8 (6), e65993 (2013).</li><li>Dressler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+early+kidney+specification,+development+and+patterning.">Advances in early kidney specification, development and patterning.</a> Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).</li><li>Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+controls+and+cellular+behaviors+in+branching+morphogenesis+of+the+renal+collecting+system.">Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (5), 693-713 (2012).</li><li>Costantini, F., Kopan , R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+a+complex+organ:+branching+morphogenesis+and+nephron+segmentation+in+kidney+development.">Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development.</a> Dev Cell. 18 (5), 698-712 (2010).</li><li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+crosstalk+regulates+kidney+progenitor+cell+differentiation.">Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation.</a> Nat Cell Biol. 15 (9), 1035-1044 (2013).</li><li>Rymer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+blood+flow+and+oxygenation+drive+nephron+progenitor+differentiation.">Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation.</a> Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).</li><li>Shah, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+mouse+blood+flow+and+oxygen+correlate+with+early+pancreatic+differentiation.">Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation.</a> Developmental biology. 349 (2), 342-349 (2011).</li><li>Andres, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB4+receptor+tyrosine+kinase+transgenic+mice+develop+glomerulopathies+reminiscent+of+aglomerular+vascular+shunts.">EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts.</a> Mech Dev. 120 (4), 511-516 (2003).</li><li>Wagner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+kidney+vascular+corrosion+casts+with+Nano-CT.">High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT.</a> Microsc Microanal. 17 (2), 215-219 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Anestesia Microinjection e prazo Com relação à anestesia da mãe, que é essencial para manter constante o fluxo de ar (2-3 l / min) e em baixo PSI. O fluxo do sedativo deve ser mantida a cerca de 1,75-2 l / min. Ao mesmo tempo, os prazos em que as injeções ocorrem devem ser cuidadosamente monitorizados e controlados para com cada ninhada. Para cada ninhada a técnica de injecção deve ser mantido sob 45 min. A importância deste limite de tempo é fundamental para a experiência, uma ...

Durante o desenvolvimento embrionário, dois processos vasculares discretos, ainda simultâneas ter lugar: a angiogénese, o processo pelo qual um recipiente cresce a partir de um grande vaso, e vasculogénese pré-existente, que é a formação de novo de vasos de células progenitoras endoteliais residenciais 1,2. Respectivamente, o primeiro é sinónimo de fluxo sanguíneo, enquanto que o último é pensado para ter lugar em grande parte na ausência da mesma. Simultaneamente à formação de vasos sanguíneos, um processo cíclico e dinâmico da síntese renal de progenitor de células, proliferação, diferenciação e começa a desdobrar no dia embrionário 9,5 (E9.5). Neste ponto, o broto ureteral (UB) invade dorsal em torno mesenchyme metanephric (MM), e continua até o nascimento 3. Repetido de ramificação da UB em rápida condensação mesênquima metanéfrico tampa começa a formação das unidades funcionais do rim, do nefrónio. Com cada nova geração de UB e nephron, as gerações mais velhas são deslocadas em regiões corticais e medular interno, onde, em seguida, submetidos a uma maturação e diferenciação dentro de ambientes principalmente vascular-densas. Como evidenciado por Dressler et al. 3, este processo embrionário é precipitado pela sinalização indutiva, tais como a diafonia entre UB e MM, e uma miríade de factores extracelulares 3-6. Dois fatores extracelulares recentemente investigado dentro do pâncreas e rins incluem o desenvolvimento de tensão de oxigênio e fluxo sanguíneo 7,8. Este último irá ser discutido em mais detalhe a seguir com relação ao desenvolvimento do rim. A fim de expor o papel indutor que o fluxo de sangue potencialmente desempenha no nefrónio diferenciação das células progenitoras, bem como em outros processos organogénese métodos precisos e exactos de embrionário mapeamento do fluxo é imperativo. Métodos alternativos de aferir o fluxo de sangue incluem a prescrição de ulimagiologia trasound e resina molda 9,10. Conclusivamente, estes modos demonstraram ser inerentemente falta na sua capacidade para desvendar contemporaneamente justaposições temporais e espaciais entre o fluxo de sangue e a diferenciação das células estaminais. Moldes de resina, por exemplo, fornecer um modelo válido de padronização navio dentro de tecidos adultos, no entanto, em vasos imaturos, como com momentos embrionárias, os navios são grosseiramente subdesenvolvido e gotejante. Portanto, resina lança deixar de manter dentro dos minúsculos, muitas vezes poroso, vasos. Para esses obstáculos aparentes, entre outros, optou-se por incorporar in vivo intra-cardíacas embrionárias lectina de tomate (TL) microinjeções em nossas investigações do desenvolvimento renal guiada por ultra-som. Neste procedimento, utilizamos uma sonda de ultra-sons para guiar de forma síncrona uma agulha montada micropipeta cheia com 2,5 ml de solução de LT no ventrículo esquerdo de embriões de ratinho nos pontos de E11.5, E13.5, E15.5, E17.5 e tempo. E170,5 é a última idade de desenvolvimento como as agulhas não são fortes o suficiente para penetrar o embrião mais desenvolvido. As vantagens deste método de microinjecção são abundantes. Microinjeção guiada por ultra-som permite um posicionamento preciso de uma agulha de injeção dentro do ventrículo esquerdo embrionário, expulsão passiva e controlada de solução para o coração pulsante do animal, o mínimo de danos ao coração e tecidos circundantes, e evitar a insuficiência cardíaca súbita e morte do embrião antes da perfusão de corpo inteiro. Com o uso de uma LT com FITC, qualquer vasculatura perfundido irá manter o marcador ao longo da sua membrana apical endotelial. Em combinação com imuno-histoquímica, utilizando PECAM (CD31, plaquetas molécula de adesão das células endoteliais) e vários outros marcadores vasculares, somos capazes de distinguir claramente entre vasos perfundidos e un-perfusão, bem como caracterizar qualquer coloração anormal de tecidos circundantes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="981">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:292px;">Company</td>
			<td style="width:164px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:225px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>022M4004V</td>
			<td>concentration 1:5000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pecam</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553370</td>
			<td>concentration 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FITC-Tomato Lectin</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>FL-1321</td>
			<td>concentration 2.5&#181;L / embryo</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat )</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>712-585-150</td>
			<td>concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjection Needle</td>
			<td>Origio Mid Atlantic Devices</td>
			<td>C060609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mineral Oil</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">BP26291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mL syringe</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">03-377-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Clay Blocks</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">HR4-326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical Tape</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">18-999-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">NC9763655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hair Removal Product</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">NC0132811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">11064-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Surgical Marking Pen</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">18000-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Right angle forceps (for hysterectomy)</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">11151-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in utero intra-cardiac tomato-lectin injections on mouse embryos to gauge renal blood flow

A formação e perfusão de desenvolver vasos sanguíneos renais (além de glomérulos) são muito escassos. Como vasculatura desenvolve através de angiogênese (que é o ramificando-se dos grandes vasos) e vasculogenesis (formação de novo navio), técnicas de mapeamento de perfusão, tais como moldes de resina, in vivo de imagens de ultra-som, e micro-dissecção foram limitadas em demonstrar as relações íntimas entre esses dois processos e desenvolvimento de estruturas renais dentro do embrião. Aqui, descrevemos o procedimento de In Utero intra-cardíacas guiada por ultrassom FITC identificados microinjeções lectina de tomate em embriões de camundongos para avaliar a ontogenia da perfusão renal. Lectina de tomate (TL) foi perfundido todo o embrião e os rins colhida. Os tecidos foram co-coradas para várias estruturas renais, incluindo: progenitores néfrons, as estruturas de néfrons, ureteral epitélio e na vasculatura. A partir de vasos de grande calibre E13.5 foram perfundidos, no entanto periféricavasos permaneceram não perfundidada. Por E15.5 e E17.5, vasos periféricos pequenas, bem como glomérulos começou a se tornar perfusão. Esta técnica experimental é fundamental para o estudo do papel da vasculatura e do fluxo sanguíneo durante o desenvolvimento embrionário.

Formação vascular precede fluxo no desenvolvimento do rim A maioria do tecido embrionário (incluindo o rim) contem uma vasculatura densa (ambos não perfundidada e perfundidos), mesmo em pontos de tempo iniciais embrionárias. Para melhor calibre e analisar o fluxo de sangue dentro do rim desenvolvimento utilizamos um método de In Utero microinjeções intracardíacos embrionárias. Com o uso de um ultra-som de alta-resolução para identificar o coração embrionário E11.5 E17.5 atrav?...

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In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

Em Injeções Utero Intra-cardíaco Tomate-lectina em embriões de camundongos para calibre fluxo sangüíneo renal

The formation and perfusion of developing renal blood vessels (apart from glomeruli) are greatly understudied. As vasculature develops via angiogenesis ...

in-utero-intra-cardiac-tomato-lectin-injections-on-mouse-embryos-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

9.6K visualizações.  Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC. This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

Vídeo: In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or &#945;v&#946;3) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

Here, we present a protocol to inject ultrasound microbubble contrast agents into living, isolated late-gestation stage murine embryos. This method enables the study of perfusion parameters and of vascular molecular markers within the embryo using contrast-enhanced high-frequency ultrasound imaging.

Imagem Contraste em embriões de camundongos Usando de alta freqüência ultra-som

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Biologia do Desenvolvimento

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Ex Utero Eletroporação e Organotípicas Cultura Slice of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

Análise quantitativa da expressão da proteína para estudar Especificação Lineage no mouse Preimplantation Embriões

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Deficitária e Abordagem de ganho de função para Investigar celular precoce Destino Determinantes na pré-implantação embriões de camundongos

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of the cell and often consist of multiple functional domains, which can be influenced by posttranslational modifications. The depletion of the entire protein in conditional or constitutive knock-out (KO) mice does not take into account this functional diversity and regulation. An mESC line and a derived mouse model, in which a docking site for FLPe recombination-mediated cassette exchange (RMCE) was inserted within the ROSA26 (R26) locus, was previously reported. Here, we report on a structure-function approach that allows for molecular dissection of the different functionalities of a multidomain protein. To this end, RMCE-compatible mice must be crossed with KO mice and then RMCE-compatible KO mESCs must be isolated. Next, a panel of putative rescue constructs can be introduced into the R26 locus via RMCE targeting. The candidate rescue cDNAs can be easily inserted between RMCE sites of the targeting vector using recombination cloning. Next, KO mESCs are transfected with the targeting vector in combination with an FLPe recombinase expression plasmid. RMCE reactivates the promoter-less neomycin-resistance gene in the ROSA26 docking sites and allows for the selection of the correct targeting event. In this way, high targeting efficiencies close to 100% are obtained, allowing for insertion of multiple putative rescue constructs in a semi-high throughput manner. Finally, a multitude of R26-driven rescue constructs can be tested for their ability to rescue the phenotype that was observed in parental KO mESCs. We present a proof-of-principle structure-function study in p120 catenin (p120ctn) KO mESCs using endoderm differentiation in embryoid bodies (EBs) as the phenotypic readout. This approach enables the identification of important domains, putative downstream pathways, and disease-relevant point mutations that underlie KO phenotypes for a given protein.

Proteins often contain multiple domains that can exert different cellular functions. Gene knock-outs (KO) do not consider this functional diversity. Here, we report a recombination-mediated cassette exchange (RMCE)-based structure-function approach in KO embryonic stem cells that allows for the molecular dissection of various functional domains or variants of a protein.

Estudos de estrutura e função em células-tronco embrionárias de camundongos usando troca de cassete mediada por recombinase

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Visualizando o nó e placa Notochordal em Gastrulating embriões de rato usando microscopia eletrônica e imunofluorescência de montagem inteira

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

Um método In Vivo para estudar a integridade de barreira de sangue-testículo de rato

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). This is a critical process that occurs throughout the lifespan of organisms, and disruption of the molecular pathways involved during embryogenesis can have catastrophic long-term consequences. For a multitude of reasons, zebrafish (Danio rerio) has become a model organism to study hematopoiesis. Zebrafish embryos develop externally, and by 7 days postfertilization (dpf) have produced most of the subtypes of definitive blood cells that will persist for their lifetime. Assays to assess the number of hematopoietic cells have been developed, mainly utilizing specific histological stains, in situ hybridization techniques, and microscopy of transgenic animals that utilize blood cell-specific promoters driving the expression of fluorescent proteins. However, most staining assays and in situ hybridization techniques do not accurately quantitate the number of blood cells present; only large differences in cell numbers are easily visualized. Utilizing transgenic animals and analyzing individuals with fluorescent or confocal microscopy can be performed, but the quantitation of these assays relies on either counting manually or utilizing expensive imaging software, both of which can make errors. Development of additional methods to assess blood cell numbers would be economical, faster, and could even be automated to quickly assess the effect of CRISPR-mediated genetic modification, morpholino-mediated transcript reduction, and the effect of drug compounds that affect hematopoiesis on a large scale. This novel assay to quantitate blood cells is performed by dissociating whole zebrafish embryos and analyzing the amount of fluorescently labelled blood cells present. These assays should allow elucidation of molecular pathways responsible for blood cell generation, expansion, and regulation during embryogenesis, which will allow researchers to further discover novel factors altered during blood diseases, as well as pathways essential during the evolution of vertebrate hematopoiesis.

This assay is a simple method to quantitate hematopoietic cells in developing embryonic zebrafish. Blood cells from dissociated zebrafish are subjected to flow cytometry analysis. This allows the detection of blood defects in mutant animals and after genetic modification.

Usando citometria de fluxo para detectar e quantificar a formação sanguínea alterada no zebrafish em desenvolvimento

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

Fundição Vascular de Pulmões de Camundongos Adultos e Precoces para Imagem Micro-CT

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. Platforms have been recently developed for highly robust and prolonged ex utero culture of mouse embryos from egg-cylinder stages until advanced organogenesis. These platforms enable appropriate and faithful development of pregastrulating embryos (E5.5) until the hind limb formation stage (E11). Late gastrulating embryos (E7.5) are grown in rotating bottles in these settings, while extended culture from pregastrulation stages (E5.5 or E6.5) requires a combination of static and rotating bottle cultures. In addition, sensitive regulation of O2 and CO2 concentration, gas pressure, glucose levels, and the use of a specific ex utero culture medium are critical for proper embryo development. Here, a detailed step-by-step protocol for extended ex utero mouse embryo culture is provided. The ability to grow normal mouse embryos ex utero from gastrulation to organogenesis represents a valuable tool for characterizing the effect of different experimental perturbations during embryonic development.

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

An enhanced platform for whole-embryo culture allows continuous and robust ex utero development of postimplantation mouse embryos for up to six days, from pregastrulation stages until advanced organogenesis. In this protocol, we detail the standard procedure for successful embryo culture using static plates and rotating bottle systems.