The authors would like to thank Dr. George Gittes for advice and expertise throughout this study. SSL was supported by an American Heart Association fellowship (11POST7330002). Further to this SSL and this study was supported by an NIDDK Mentored Research Scientist Development Award (DK096996) and by the Children&#8217;s Hospital of Pittsburgh.

NOTA: The University of Pittsburgh Institutional Animal Care e do Comitê Use aprovado todos os experimentos. 1. Preparação de Instrumentos Ultrasound-microinjeção e embriões <ol><li> Configure palco, montagem, e sonda (Figura 1), bem como os instrumentos cirúrgicos (Figura 2). Local solução salina tamponada com fosfato (PBS) (pH 7,4) em um banho de 37 ° C de aquecimento. Encha agulha de microinjecção inteiramente com óleo mineral, usando seringa de 1 ml ligada a uma segunda agulha G 25 flexível, através da sua base. </li><li> Corrigir agulha na rotação do braço de montagem, ea agulha vazia de solução de óleo mineral. Re-encher com 2,5 ml de solução de TL. Certifique-se que não há bolhas de ar no interior da agulha de injeção. Gire agulha braço em direção à parede, longe do palco. </li><li> Anestesiar a mãe grávida na câmara de anestesia através de infusão contínua de isoflurano. Quando a mãe fica inconsciente, transferir a anestesia para tubo nariz posicionado no caudal lado do palco, e lugar mãe em decúbito dorsal com o focinho no tubo nariz para permitir a continuação de um estado totalmente anestesiado. </li><li> Membros fita em ângulos de 45 °, ou com as mãos e os pés descansados ​​e posicionado overtop ECG / monitor de temperatura guias. É importante que a barragem grávida é continuamente monitorizado para assegurar que a anestesia é suficiente e que a pomada aplicada no para os olhos para reduzir a secura. </li><li> Aplique o produto de remoção de pêlos em toda a parte inferior do abdômen da mãe, limpe suavemente com cotonetes secos, e, em seguida, novamente com um 70% de cotonetes saturado de etanol para remover qualquer excesso de produto e cabelo. Certifique-se de limpar a pele abdominal off de todos os pêlos no local da incisão (Figura 3). </li><li> Realize uma laparotomia na mãe grávida usando uma pinça e tesouras cirúrgicas finas. Tome cuidado para evitar o corte quaisquer vasos grandes ou órgãos viscerais. Faça primeiro, incisão reta de epiderme 1,5-2 cm acima vagina e continuar em direção a cortar costelas para approximatEly 2-3 cm. Expor a membrana subcutânea, localizar a linha alba (&quot;linha branca&quot;) (Figura 3), e cortadas paralelamente à incisão inicial, ao longo do comprimento do mesmo, para expor interna órgãos viscerais e sáculo uterinas. </li></ol> 2. Extracção de Embriões <ol><li> Utilize aplicadores com ponta de algodão de 6 polegadas de manobrar mãe e embriões. Com cuidado, empurre (sem forçar) na pele com aplicador para manipular primeiro embrião de abertura da incisão. Após a extracção do primeiro sáculo embrião, cuidadosa e lentamente puxe o restante do corno uterino, através e para o exterior da matriz. Evite puxar intestino ou outros órgãos através da incisão nesta fase. </li><li> Quantificar embriões e coloque delicadamente corno uterino esquerdo de volta para a mãe. Em seguida, começar a colocar o corno uterino direito de volta para a mãe começando com o mais saccule embrião da vagina no chifre e se movendo para baixo. Continue até apenas dois embriões permanecem expostos (Fifigura 4). Por último, os embriões de posição em uma coluna acima e paralelo à incisão linha, sendo consciente para não cortar a circulação uterina. </li><li> Coloque blocos de argila e posição entre os braços e corpo, bem como pernas e cauda. Certifique-se de que as superfícies de argila são cerca de nível com incisão laparotomia. Molhe a placa de Petri fenestradas com 37 ° C PBS. </li><li> Segure estendem fórceps com a mão direita e fenestrated placa de Petri com a mão esquerda (fenestration paralelo aos embriões) e trazer fechado forceps ~ 5 cm através fenestration, a partir do topo da placa de Petri. Abertas forceps completamente sem rasgar malha fenestration. </li><li> Manobra mãos acima de embriões e foco vista sobre as duas sáculos embrião. Sem (ou levemente) tocando sáculos com entrosamento fenestration ou fórceps, deslize-os através de fenda e definir uma placa de Petri sobre abdômen da mãe. Com uma pinça ainda estendida, manipular malha fenestrado para encaixá-lo em ambos os lados e na base de cada embrião (Figura 5 </strong&gt;) e puxe uma pinça de abertura de fenda. </li><li> Em seguida, coloque borracha azul contendo parede em uma placa de Petri, sem beliscar ou ferir embriões (Figura 6). Certifique-se de blocos de argila estão firmemente equilíbrio placa de Petri, embrião, e da parede contendo borracha. Por fim, preencher placa de Petri com 37 ° C PBS até que os embriões são completamente submerso (Figura 6), enquanto que o controle de vazamentos na malha fenestrado. </li></ol> 3. Injeção Procedimento <ol><li> Lower fase de injeção com a mãe e os embriões para baixo, usando botão de ajuste de nível Z (Figura 1) e, em seguida, gire a agulha de injeção e braço montar e alinhar diretamente com sonda de ultra-som, com agulha ½ cm à esquerda e sob a ponta da sonda (Figura 7) . Empurre a agulha do braço (não agulha) 45 ° de distância da sonda. Tenha cuidado para não bater a ponta da agulha com a sonda de prato ou ultra-som. </li><li> Levante fase de injeção de volta à altura original, com ultra-som probe diretamente acima embriões Probe deve ser ligeiramente submersa e dentro de 3-4 mm do tecido embrionário. Use X &amp; Y botões de ajuste de fase (Figura 8) para alterar a posição do embrião / mãe / estágio para localizar sistematicamente a embrionário do coração batendo. </li><li> Diretamente Centro de tela ultra-som observar um marcador alvo centro preto desenhado (*). Localize ventrículo esquerdo (preferível) ou átrio usando os X &amp; Y botões de ajuste de fase (Figura 8) e, em seguida, aumentar ou diminuir o palco, usando o botão giratório no palco para posicionar-alvo injeção precisamente sobre o marcador de centro preto na tela do ultra-som. </li><li> Use X botão de ajuste de fase para mover embrião para a direita, fora da tela do ultra-som. Reposicionar agulha microinjeção e braço de volta no lugar, ½ cm de distância e 90 ° para a sonda de ultra-som (Figura 7). </li><li> Usando montar microinjeção botões de ajuste (Figura 9C-G), agulha de posição com a ponta claramente aligned com o marcador de centro. Ajuste o ângulo de injeção (usando botões na Figura 9C e EG), e X, Y, Z e vetores de micro-agulha para garantir a ponta da agulha está focada no plano correto. Retrair agulha microinjeção usando apenas o botão de &quot;injeção&quot; (Figura 9F), cuidado para não ajustar outras dimensões. </li><li> Mais uma vez, usando apenas o X de ajuste fino movimento botão fase de embrião de volta sob a sonda, com destino exatamente sobre o ponto central na tela do ultra-som. Certifique-se de que o ventrículo esquerdo é agora exactamente no mesmo X, Y, Z e plano. </li><li> Em seguida, com apenas o botão de &quot;injecção&quot; no micro-injecção de montagem, perfurar lentamente embrião com a agulha de microinjecção e gradualmente trazer ponta para o ventrículo esquerdo. Injectar o total de 2,5 ml de solução TL no ventrículo esquerdo ou até que os vazios sinais sonoros de alerta, ao considerar &quot;vazia&quot; e tocando &quot;encher&quot; uma vez (Figuras 2A e B). Neste momentoinjecção de observar uma sombra que emana a partir da ponta da agulha, a qual é o TL entrar para dentro da câmara cardíaca (Figura 10). Em sentido inverso, retrair rapidamente agulha microinjeção girando o botão de &quot;injeção&quot; (Figura 9F) sobre a microinjeção de montagem quando a injeção é completa. </li><li> Continue na próxima embrião e repetir este procedimento para embriões remanescentes após esta série de etapas e, finalmente, colocar os embriões finais de volta para o abdômen da barragem. Alterne anestesia para a caixa de câmara e mover suavemente mãe aqui para 15 min de tempo da última injecção. </li></ol> 4. A colheita Embriões e Análise <ol><li> Sacrifique barragem via luxação cervical. Expandir a incisão laparotomia para remover facilmente cornos uterinos da mãe. Mantenha os embriões dentro sac uterina. Coloque embriões em refrigerados PBS. </li><li> Dissecar embriões de sac uterino (se o tecido coleta necessária para genotipagem) e coloque todo o embrião in 4% de paraformaldeído (PFA) durante a noite, em seguida, em 30% de sacarose durante a noite, congelar no cryostat corte médio. Em seguida, corte o cryosection e colocá-lo em lâminas para análise imuno-histoquímica. Opcionalmente, usar tecidos para todo o monte por desidratação em 100% de metanol, subsequente à fixação, em PFA a 4%. </li><li> Para a análise imuno-histoquímica colocar os criosecções em PBS para remover o OCT. Em seguida, bloquear as secções com 10% de soro de burro normal, durante 30 min. Em seguida, adicionar PECAM anticorpo primário a diluição 1: 100 durante a noite a 4 ° C. No dia seguinte, lavar as lâminas em PBT 3 vezes durante 10 minutos cada e adicionar burro anti-rato secundária 594 e incubar durante 1 h à TA. NOTA: Esta é uma técnica altamente exigente que requer a otimização e coordenação de ultra-som e microinjecção. Há uma curva de aprendizado muito íngreme relacionados a essa técnica e requer de quatro a seis semanas de injeções mentor antes de a pessoa se torna proficiente. </li></ol>

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	<li>Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+formation+of+microvasculature+in+the+developing+kidney.">Origins and formation of microvasculature in the developing kidney.</a> Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).</li><li>Sims-Lucas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Progenitors+Exist+within+the+Kidney+and+Lung+Mesenchyme.">Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme.</a> PloS one. 8 (6), e65993 (2013).</li><li>Dressler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+early+kidney+specification,+development+and+patterning.">Advances in early kidney specification, development and patterning.</a> Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).</li><li>Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+controls+and+cellular+behaviors+in+branching+morphogenesis+of+the+renal+collecting+system.">Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (5), 693-713 (2012).</li><li>Costantini, F., Kopan , R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+a+complex+organ:+branching+morphogenesis+and+nephron+segmentation+in+kidney+development.">Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development.</a> Dev Cell. 18 (5), 698-712 (2010).</li><li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+crosstalk+regulates+kidney+progenitor+cell+differentiation.">Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation.</a> Nat Cell Biol. 15 (9), 1035-1044 (2013).</li><li>Rymer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+blood+flow+and+oxygenation+drive+nephron+progenitor+differentiation.">Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation.</a> Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).</li><li>Shah, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+mouse+blood+flow+and+oxygen+correlate+with+early+pancreatic+differentiation.">Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation.</a> Developmental biology. 349 (2), 342-349 (2011).</li><li>Andres, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB4+receptor+tyrosine+kinase+transgenic+mice+develop+glomerulopathies+reminiscent+of+aglomerular+vascular+shunts.">EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts.</a> Mech Dev. 120 (4), 511-516 (2003).</li><li>Wagner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+kidney+vascular+corrosion+casts+with+Nano-CT.">High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT.</a> Microsc Microanal. 17 (2), 215-219 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Anestesia Microinjection e prazo Com relação à anestesia da mãe, que é essencial para manter constante o fluxo de ar (2-3 l / min) e em baixo PSI. O fluxo do sedativo deve ser mantida a cerca de 1,75-2 l / min. Ao mesmo tempo, os prazos em que as injeções ocorrem devem ser cuidadosamente monitorizados e controlados para com cada ninhada. Para cada ninhada a técnica de injecção deve ser mantido sob 45 min. A importância deste limite de tempo é fundamental para a experiência, uma ...

Durante o desenvolvimento embrionário, dois processos vasculares discretos, ainda simultâneas ter lugar: a angiogénese, o processo pelo qual um recipiente cresce a partir de um grande vaso, e vasculogénese pré-existente, que é a formação de novo de vasos de células progenitoras endoteliais residenciais 1,2. Respectivamente, o primeiro é sinónimo de fluxo sanguíneo, enquanto que o último é pensado para ter lugar em grande parte na ausência da mesma. Simultaneamente à formação de vasos sanguíneos, um processo cíclico e dinâmico da síntese renal de progenitor de células, proliferação, diferenciação e começa a desdobrar no dia embrionário 9,5 (E9.5). Neste ponto, o broto ureteral (UB) invade dorsal em torno mesenchyme metanephric (MM), e continua até o nascimento 3. Repetido de ramificação da UB em rápida condensação mesênquima metanéfrico tampa começa a formação das unidades funcionais do rim, do nefrónio. Com cada nova geração de UB e nephron, as gerações mais velhas são deslocadas em regiões corticais e medular interno, onde, em seguida, submetidos a uma maturação e diferenciação dentro de ambientes principalmente vascular-densas. Como evidenciado por Dressler et al. 3, este processo embrionário é precipitado pela sinalização indutiva, tais como a diafonia entre UB e MM, e uma miríade de factores extracelulares 3-6. Dois fatores extracelulares recentemente investigado dentro do pâncreas e rins incluem o desenvolvimento de tensão de oxigênio e fluxo sanguíneo 7,8. Este último irá ser discutido em mais detalhe a seguir com relação ao desenvolvimento do rim. A fim de expor o papel indutor que o fluxo de sangue potencialmente desempenha no nefrónio diferenciação das células progenitoras, bem como em outros processos organogénese métodos precisos e exactos de embrionário mapeamento do fluxo é imperativo. Métodos alternativos de aferir o fluxo de sangue incluem a prescrição de ulimagiologia trasound e resina molda 9,10. Conclusivamente, estes modos demonstraram ser inerentemente falta na sua capacidade para desvendar contemporaneamente justaposições temporais e espaciais entre o fluxo de sangue e a diferenciação das células estaminais. Moldes de resina, por exemplo, fornecer um modelo válido de padronização navio dentro de tecidos adultos, no entanto, em vasos imaturos, como com momentos embrionárias, os navios são grosseiramente subdesenvolvido e gotejante. Portanto, resina lança deixar de manter dentro dos minúsculos, muitas vezes poroso, vasos. Para esses obstáculos aparentes, entre outros, optou-se por incorporar in vivo intra-cardíacas embrionárias lectina de tomate (TL) microinjeções em nossas investigações do desenvolvimento renal guiada por ultra-som. Neste procedimento, utilizamos uma sonda de ultra-sons para guiar de forma síncrona uma agulha montada micropipeta cheia com 2,5 ml de solução de LT no ventrículo esquerdo de embriões de ratinho nos pontos de E11.5, E13.5, E15.5, E17.5 e tempo. E170,5 é a última idade de desenvolvimento como as agulhas não são fortes o suficiente para penetrar o embrião mais desenvolvido. As vantagens deste método de microinjecção são abundantes. Microinjeção guiada por ultra-som permite um posicionamento preciso de uma agulha de injeção dentro do ventrículo esquerdo embrionário, expulsão passiva e controlada de solução para o coração pulsante do animal, o mínimo de danos ao coração e tecidos circundantes, e evitar a insuficiência cardíaca súbita e morte do embrião antes da perfusão de corpo inteiro. Com o uso de uma LT com FITC, qualquer vasculatura perfundido irá manter o marcador ao longo da sua membrana apical endotelial. Em combinação com imuno-histoquímica, utilizando PECAM (CD31, plaquetas molécula de adesão das células endoteliais) e vários outros marcadores vasculares, somos capazes de distinguir claramente entre vasos perfundidos e un-perfusão, bem como caracterizar qualquer coloração anormal de tecidos circundantes.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>022M4004V</td><td>concentration 1:5,000</td></tr><tr><td>Pecam</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>concentration 1:100</td></tr><tr><td>FITC-Tomato Lectin</td><td>Vector Laboratories</td><td>FL-1321</td><td>concentration 2.5 &amp;micro;l / embryo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>712-585-150</td><td>concentration 1:200</td></tr><tr><td>Microinjection Needle</td><td>Origio Mid Atlantic Devices</td><td>C060609</td><td></td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26291</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-377-20</td><td></td></tr><tr><td>Clay Blocks</td><td>Fisher Scientific</td><td>HR4-326</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Tape</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-999-380</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9763655</td><td></td></tr><tr><td>Hair Removal Product</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0132811</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>Fine Science tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11064-07</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Marking Pen</td><td>Fine Science tools</td><td>18000-30</td><td></td></tr><tr><td>Right angle forceps (for hysterectomy)</td><td>Fine Science tools</td><td>11151-10</td><td></td></tr></tbody></table>

in utero intra-cardiac tomato-lectin injections on mouse embryos to gauge renal blood flow

A formação e perfusão de desenvolver vasos sanguíneos renais (além de glomérulos) são muito escassos. Como vasculatura desenvolve através de angiogênese (que é o ramificando-se dos grandes vasos) e vasculogenesis (formação de novo navio), técnicas de mapeamento de perfusão, tais como moldes de resina, in vivo de imagens de ultra-som, e micro-dissecção foram limitadas em demonstrar as relações íntimas entre esses dois processos e desenvolvimento de estruturas renais dentro do embrião. Aqui, descrevemos o procedimento de In Utero intra-cardíacas guiada por ultrassom FITC identificados microinjeções lectina de tomate em embriões de camundongos para avaliar a ontogenia da perfusão renal. Lectina de tomate (TL) foi perfundido todo o embrião e os rins colhida. Os tecidos foram co-coradas para várias estruturas renais, incluindo: progenitores néfrons, as estruturas de néfrons, ureteral epitélio e na vasculatura. A partir de vasos de grande calibre E13.5 foram perfundidos, no entanto periféricavasos permaneceram não perfundidada. Por E15.5 e E17.5, vasos periféricos pequenas, bem como glomérulos começou a se tornar perfusão. Esta técnica experimental é fundamental para o estudo do papel da vasculatura e do fluxo sanguíneo durante o desenvolvimento embrionário.

Formação vascular precede fluxo no desenvolvimento do rim A maioria do tecido embrionário (incluindo o rim) contem uma vasculatura densa (ambos não perfundidada e perfundidos), mesmo em pontos de tempo iniciais embrionárias. Para melhor calibre e analisar o fluxo de sangue dentro do rim desenvolvimento utilizamos um método de In Utero microinjeções intracardíacos embrionárias. Com o uso de um ultra-som de alta-resolução para identificar o coração embrionário E11.5 E17.5 atrav?...

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In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

Em Injeções Utero Intra-cardíaco Tomate-lectina em embriões de camundongos para calibre fluxo sangüíneo renal

The formation and perfusion of developing renal blood vessels (apart from glomeruli) are greatly understudied. As vasculature develops via angiogenesis ...

in-utero-intra-cardiac-tomato-lectin-injections-on-mouse-embryos-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

9.7K visualizações.  Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC. This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

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A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Um modelo do rato de No Utero Transplante

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Medicina

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or &#945;v&#946;3) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

Here, we present a protocol to inject ultrasound microbubble contrast agents into living, isolated late-gestation stage murine embryos. This method enables the study of perfusion parameters and of vascular molecular markers within the embryo using contrast-enhanced high-frequency ultrasound imaging.

Imagem Contraste em embriões de camundongos Usando de alta freqüência ultra-som

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Biologia do Desenvolvimento

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

Uma nova abordagem cirúrgica para administração intratraqueal de agentes bioativos em um modelo de camundongo Fetal

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Murine Fetal Echocardiography

Transgenic mice displaying abnormalities in cardiac development and function represent a powerful tool for the understanding the molecular mechanisms underlying both normal cardiovascular function and the pathophysiological basis of human cardiovascular disease. Fetal and perinatal death is a common feature when studying genetic alterations affecting cardiac development 1-3. In order to study the role of genetic or pharmacologic alterations in the early development of cardiac function, ultrasound imaging of the live fetus has become an important tool for early recognition of abnormalities and longitudinal follow-up. Noninvasive ultrasound imaging is an ideal method for detecting and studying congenital malformations and the impact on cardiac function prior to death 4. It allows early recognition of abnormalities in the living fetus and the progression of disease can be followed in utero with longitudinal studies 5,6. Until recently, imaging of fetal mouse hearts frequently involved invasive methods. The fetus had to be sacrificed to perform magnetic resonance microscopy and electron microscopy or surgically delivered for transillumination microscopy. An application of high-frequency probes with conventional 2-D and pulsed-wave Doppler imaging has been shown to provide measurements of cardiac contraction and heart rates during embryonic development with databases of normal developmental changes now available 6-10. M-mode imaging further provides important functional data, although, the proper imaging planes are often difficult to obtain. High-frequency ultrasound imaging of the fetus has improved 2-D resolution and can provide excellent information on the early development of cardiac structures 11.

Fetal and perinatal death is a common feature when studying genetic alterations affecting cardiac development. High-frequency ultrasound imaging has improved 2-D resolution and can provide excellent information on early cardiac development and is an ideal method to detect the impact on cardiac structure and function prior to death.

Ecocardiografia Fetal murino

Transgenic mice displaying abnormalities in  cardiac development and function represent a powerful tool for the understanding  the molecular mechanisms ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease and injury regional estimates, World Health Organization, 2004). Surgeries that often compromise the quality of life are required to correct heart defects, reminding us of the importance of finding the causes of CHD. Mutant mouse models and live imaging technology have become essential tools to study the etiology of this disease. Although advanced methods allow live imaging of abnormal hearts in embryos, the physiological and hemodynamic states of the latter are often compromised due to surgical and/or lengthy procedures. Noninvasive ultrasound imaging, however, can be used without surgically exposing the embryos, thereby maintaining their physiology. Herein, we use simple M-mode ultrasound to assess heart rates of embryos at E18.5 in utero. The detection of abnormal heart rates is indeed a good indicator of dysfunction of the heart and thus constitutes a first step in the identification of developmental defects that may lead to heart failure.

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Ultra-high frequency ultrasound is a powerful live imaging tool to examine cardiac abnormalities in small animals. Its noninvasiveness allows maintaining the physiologic state of embryos. Herein, we show the use of M-mode ultrasound to measure the heart rates of embryos at E18.5 in utero.

Na medição utero da frequência cardíaca em rato por não invasiva em modo M Ecocardiografia

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances early in the gestation. The rationale behind IUT for therapeutic purposes is based on the small size of the fetus, the fetal immunologic immaturity, the accessibility and proliferative nature of the fetal stem or progenitor cells, and the potential to treat a disease or the onset of symptoms prior to birth. Taking advantage of these normal developmental properties of the fetus, the delivery of hematopoietic stem cells (HSC) via an IUT has the potential to treat congenital hematologic disorders such as sickle cell disease, without the required myeloablative or immunosuppressive conditioning required for postnatal HSC transplants. Similarly, the accessibility of progenitor cells in multiple organs during development potentially allows for a more efficient targeting of stem/progenitor cells following an IUT of viral vectors for gene therapy or genome editing. Additionally, IUT can be used to study normal developmental processes including, but not limited to, the development of immunologic tolerance. The murine model provides a valuable and affordable means to understanding the potential and limitations of IUT prior to pre-clinical large animal studies and an eventual clinical application. Here, we describe a protocol for performing an IUT in the murine fetus through intravenous and intra-amniotic routes. This protocol has been used successfully to elucidate the necessary conditions and mechanisms behind in utero hematopoietic stem cell transplantation, tolerance induction, and in utero gene therapy.

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

We describe a protocol for performing an in utero transplantation (IUT) through intravenous and intra-amniotic routes of injection in the murine model. This protocol can be used to introduce cells, viral vectors, and other substances into the unique immune-tolerant fetal environment.

Intravenosa e Intra-amniótica no Utero transplante no modelo murino

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ultrastructural parameters in unambiguously identified topographical structures, affected by a protein of interest that is introduced into the organism via viral transfer. This combined approach allows for a smooth transition from macrostructural to ultrastructural identification by following topographical navigation maps in a tissue atlas. High-resolution electron microscopy of the in-utero-transduced tissue reveals the fine ultrastructure of the neuropil and its plasticity parameters, such as cross-sectioned synaptic bouton areas, the number of synaptic vesicles and mitochondria within a bouton profile, the length of synaptic contacts, cross-sectioned axonal areas, the thickness of myelin sheaths, the number of myelin lamellae, and cross-sectioned areas of mitochondria profiles. The analysis of these parameters reveals essential insights into changes of ultrastructural plasticity in the areas of the nervous system that are affected by the viral transfer of the genetic construct. This combined method can not only be used for studying the direct effect of genetically engineered biomolecules and/or drugs on neuronal plasticity but also opens the possibility to study the in utero rescue of neuronal plasticity (e.g., in the context of neurodegenerative diseases).

The combination of transmission electron microscopy and in utero transduction is a powerful approach for studying morphological changes in the fine ultrastructure of the nervous system during development. This combined method allows deep insights into changes in structural details underlying neuroplasticity with respect to their topographical representation.

Avaliação dos parâmetros de neuroplasticidade ultraestrutural depois no Utero transdução da medula espinhal e cérebro de rato em desenvolvimento

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

Análise do desenvolvimento de câmara cardíaca durante a embriogênese de rato usando toda montagem de epifluorescência

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of &#946;-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of aortic disease exist, in vivo imaging of the vasculature has been limited. In recent years, micro-computerized tomography (micro-CT) has emerged as a preferred modality for imaging both large and small vessels both in vivo and ex vivo. In conjunction with a method of vascular casting, we have successfully used micro-CT to characterize the frequency and distribution of aortic pathology in &#946;-aminopropionitrile-treated C57/Bl6 mice. Technical limitations of this method include variations in the quality of the perfusion introduced by poor animal preparation, the application of proper methodologies for vessel size quantification, and the non-survivability of this procedure. This article details a methodology for the intravascular perfusion of a lead-based radiopaque silicone rubber for the quantitative characterization of aortopathy in a mouse model of aneurysm and dissection. In addition to visualizing aortic pathology, this method may be used for examining other vascular beds in vivo or vascular beds removed post-mortem.

This article describes a detailed methodology of using a radiopaque lead-based silicone rubber to perfuse the murine vasculature for aortic diameter quantification in a mouse model of aortic aneurysm and dissection.

Análise quantitativa de Micro-CT de Aortopathy em um modelo do rato de β-aminopropionitrile-induzida de aneurisma da aorta e dissecação

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

Rotulagem celular e injeção em Desenvolvimento embrionárias corações do rato

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...