Os autores agradecem o Leducq Foundation (mitral) ea Agence Nationale pour la Recherche (ANR conceder Specistem) para o financiamento desta pesquisa.

1. Preparação Procedimentos com animais Obter a aprovação de um comitê de ética animal e seguir as orientações institucionais para o trabalho com o vírus, HuESC e / ou iPSC (quando aplicável), bem como a movimentação do mouse, a obtenção de embriões de camundongos, e realizar a cirurgia mouse. Para acasalamentos programados, o dia do plugue é considerado dia embrionário (E) 0,5 / 0,5 dias pós-coitum. <ol><li> Agulhas microinjeção: Para ex utero microinjeção, puxe pipetas de vidro (1,2 milímetros de diâmetro tubos de borosilicato capilares externos) utilizando um extrator pipeta / beveller para obter uma mM diâmetro da ponta interna 1 ou 10 e uma forma cônica e ponta afiada para injetar DNA ou células, respectivamente. Para injeções mediada por ultra-som, o uso personalizado agulhas estéreis, que têm um diâmetro externo / interno (OD / ID) de 1,14 mm/0.53 mm, com uma ponta de 50/35 mM OD / ID. </li><li> Placas de Petri de silicone-cheia: Prepare de silício como descrito no manual. Preencherum copo limpo 60 mm de diâmetro placa de Petri com uma camada de elastômero de ~ 1 cm. Evitar bolhas de ar. </li><li> Instrumentos: Manter todos os instrumentos cirúrgicos estéreis, antes e durante o procedimento. </li><li> Preparação de DNA: Adiciona-se 3 ug de ADN e 12 uL de Opti-MEM em um tubo. Adiciona-se 3 mL de Lipofectamine 2000 e 12 ul de Opti-MEM em outro tubo. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente e misturar as duas soluções. Use imediatamente. </li><li> Preparação celular: Prepara-se uma suspensão de 10 6 células / ml de DMEM (Meio de Eagle de Dulbecco, glicose alta e 50% de soro de rato). 50 ul da suspensão celular final é suficiente para 8-10 embriões. </li><li> Tingir preparação: Use o verde fluorescente CDCFDA-SE a 25 mg / ml de DMSO. Prepare 20 mL alíquotas e armazenar a -20 ° C. Diluir 1:100 / 1:200 em soro fisiológico estéril ou com PBS antes da utilização. </li><li> Preparação de vírus: Use um PGK-expressando GFP lentivírus comercial 3 ª geração com um título de ~ 10 9 -10 10 transducing unidades / ml de DMEM. Para a preparação do lentivírus, consulte Tiscornia et al 14. Use equipamento de proteção pessoal e usar e dispor de vírus com segurança. </li></ol> 2. Recolha de E9.5 e E10.5 embriões para Ex vivo Injeção <ol><li> Euthanize um rato grávida no dia embrionário 9.5 ou 10.5. </li><li> Esterilizar o tórax e abdômen do mouse com etanol 70%. </li><li> Faça uma incisão na linha média ventral para abrir o abdômen e recuperar o corno uterino na RT em PBS e transferi-lo depois de duas lavagens de PBS para uma placa de Petri cheia de silicone com o meio M16. </li><li> Pin o corno uterino com pinos de insectos para a camada de silicone, de modo que o lado vascularizado do útero é, na parte inferior. </li><li> Cortar a superfície do útero com uma pinça fina, e uma tampa do decidua em 1 mm abaixo da superfície. </li><li> Gentilmente recuperar o embrião no saco vitelino, espalhando para fora das paredes da decídua. </li><li> Guarde os embriões a 37 °, C em meio M16 antes da injeção das células. Para a injecção, cada embrião é transferido para o prato de silicone enchida com meio M16 pré-aquecido a 37 ° C. </li></ol> 3. DNA ou injeção de células sob microscópio estereoscópico <ol><li> Encha a pipeta de vidro na parte de trás com uma seringa Hamilton e agitar a pipeta para remover as bolhas na ponta. </li><li> Defina a pipeta no suporte da microinjeção; definir a pressão de retenção de 50 (ADN) ou 30 (células) hPa, e a pressão de injecção de 150 (ADN) e 300 (células) hPa. Defina o tempo de injeção para 0,2 seg (DNA) ou 0,5 s (células). Estas configurações podem variar ligeiramente de acordo com o tipo de microinjector e pipeta. </li><li> Pin o embrião para a parte inferior de silicone através do saco vitelino, sem tocar no próprio embrião. Cuidado a região do coração e abrir o saco logo acima desta região. </li><li> Adicione 4 pinos ao redor do embrião para evitar qualquer movimento durante a injeção de células. </li><li> Usando o micromanipulador (definido para manual), slowly posição da ponta da pipeta a um ângulo de 45 ° acima do pericárdio, logo acima da região do coração, que é para ser injectada (Figura 1). </li><li> Mova a pipeta na região de interesse e acionar a injeção. Retire a pipeta, tão rapidamente quanto possível. Certifique-se o coração está batendo corretamente após a injeção de DNA / célula. </li></ol> 4. Embrião, coração isolado e Explant Cultura <ol><li> Cultura de embriões E9.5 em 25% M2 médio e 75% de soro de rato, suplementado com penicilina / estreptomicina, pré-aquecido a 37 ° C e oxigenada com 40% de O 2. </li><li> Adicionar 2 ml de meio de cultura num tubo de vidro de 25 ml, adicionar cuidadosamente o embrião, e oxigenado com 40% O2 antes de aparafusar a tampa no tubo. Incube-se a 36 horas a 37 ° C durante a rotação ou agitação (30 rotações / min). </li><li> No ponto de tempo desejado (por exemplo, 24 horas), dissecar o coração cuidadosamente com uma pinça fina, sem tocar os corações, por primeiro decapitating os embriões; o coração é fácil de impostos especiais de consumo, puxando-o usando a via de saída distal. </li><li> Cultura do coração isolado para outro 36-48 horas em DMEM com 50% de FCS num inserto Matrigel revestido definido em uma placa de 12 poços. Veja Dyer &amp; Patterson (2013) para um protocolo melhorado da cultura coração 15. </li><li> Faça qualquer explante da região de interesse. Como exemplo, dissecar o canal atrioventricular (AVC) e cultura-lo por 48 horas em colágeno tipo 1 gel 16. </li></ol> 5. Injeção de ultra-som-guiada no Coração I n utero <ol><li> Configuração da máquina de ultra-som e microinjetor: <ol><li> Use o sistema de ultra-som de alta resolução com um transdutor de 40 MHz e configuração microinjeção em um trilho. </li><li> Defina o volume de injeção na microinjetor em 69 nl por injeção. Consulte o manual de microinjeção do fabricante para a programação do microinjetor. </li></ol></li><li> Preparação do microinjection instalação e injeção: <ol><li> Coloque uma micropipeta de vidro no microinjetor. Para assegurar a injecção, o primeiro revestimento eficiente o lado interior da pipeta com óleo mineral, aspirando-se para o volume máximo. Em seguida, retire o óleo novamente, deixando 1-2 mm de óleo no interior da agulha. </li><li> Aspirar o produto de injecção até que o volume máximo é atingido. Tenha cuidado para não tocar em qualquer superfície com a ponta da agulha, pois isso vai enfraquecer a ponta e fazer a injeção mais difícil. </li><li> Para estabilizar o corno uterino contendo os embriões durante a injecção, utilizar um prato Petri modificado com um furo no meio (2,5 cm de diâmetro), coberta por uma fina membrana de silicone com uma pequena fenda de corte no centro, e posicioná-lo acima do local da incisão . Estabilizar a placa de Petri sobre a mesa de manuseamento rato posicionando 3-4 aglomerados de argila de acordo com as bordas do prato. </li></ol></li><li> Processo de injeção: <ol><li> Raspar o abdômen de um rato grávida (na fase embrionária desejado) antes da anestesiasia para remover pêlos. Trate o abdômen com um agente de depilação química para remover pêlos residual e esterilizar com álcool 70%. </li><li> Anestesiar um rato grávida de oxigênio / isoflurano através de uma máscara facial. Use 3-5% de isoflurano em 100% de oxigénio durante a anestesia inicial, seguido de 1-1,5%, durante o resto do procedimento. Certifique-se de que o mouse está devidamente anestesiados por beliscar suavemente suas patas e / ou cauda. </li><li> Colocar o rato supina sobre a mesa de tratamento do rato (ajustado para aquecer a 37 ° C) e cobrir os olhos com lubrificante para evitar a desidratação da córnea. </li><li> Aplique gel eletrodo sobre os eletrodos e cole as patas para os eletrodos para monitorar a frequência cardíaca, frequência respiratória, e ECG. Coloque um termômetro retal para monitorar a temperatura do corpo. </li><li> Verifique primeiro se o rato está grávida, visualizando e contando os embriões por ultra-som. Aplique o gel de ultra-som no abdômen e posicionar a cabeça de leitura acima da bexiga. Para manter a consistência, visualizar a bexiga em primeiro lugar,e contagem de embriões na esquerda e cornos uterinos direita, a partir da posição da bexiga. Certifique-se de que os corações embrionárias estão batendo normalmente. </li><li> Se o mouse está grávida, posicione a placa de Petri acima do local da incisão futuro com o barro. Pressione levemente o prato para o abdômen, para que o prato está em contato direto. </li><li> Retire o prato e esterilizar o abdômen novamente. Faça um 1,5-2 cm ventral incisão mediana, cerca de 0,75-1 cm acima da vagina, para abrir o abdômen e peritônio. Evite lesões de órgãos internos. </li><li> Exteriorizar a esquerda ou corno uterino direito com uma pinça, puxe-o através da membrana de silício do prato, e estabilizar o prato no barro novamente. Impedir extensa puxar ou manipulação, uma vez que isso pode causar sangramento dos vasos uterinos e morte prematura da mulher e / ou embriões. </li><li> Conte os embriões novamente para garantir a manutenção de registros adequados de que os embriões foram injetados. </li><li> Aplique o gel de ultra-som no ucornos uterino a imagem do coração e para evitar a desidratação. </li><li> Imagem do primeiro embrião a ser injectado. Verifique batida normal do coração embrionário e manter registros de orientação crânio-caudal e esquerda-direita do embrião. Se necessário, reposicionar o corno uterino ligeiramente para assegurar orientação apropriada. Se isso for difícil, passar para a próxima embrião. </li><li> Perfurar o útero cuidadosamente com a agulha de microinjecção para posicionar a agulha com um ângulo de 45 ° acima do embrião, ligeiramente fora do pericárdio (Figura 3). Para marcação de células do epicárdio, a imagem do coração em uma visão de quatro câmaras e posicionar a agulha para que ele aponta para o sulco atrioventricular (Figura 3). Se o ângulo precisa ser ajustada, puxe a agulha, e reposicionar. Não ajustar o ângulo com a agulha dentro do útero, uma vez que isto pode quebrar a agulha. Evitar a perfuração de outros tecidos, tais como membros ou placenta. </li><li> Mover a agulhana parede do pericárdio e perfurá-la com um movimento suave, mas rápido. De um modo geral, haverá alguma resistência, mas movendo-se a agulha demasiado rápido pode fazer com que a ponta da agulha para perfurar o próprio coração. A ponta deve acabar no espaço pericárdico do sulco atrioventricular. No caso de hemorragia pericárdio, as células do sangue será visível como um padrão de neve como branco. Se este for o caso, pare de injetar o embrião e passar para outro embrião. </li><li> Injectar a injetado. Injectar maximamente 700 nl no espaço pericárdico para evitar efeitos adversos sobre o desenvolvimento corações. Monitorar a injeção adequada, ligeiro inchaço, temporal do saco pericárdico. </li><li> Após a injecção, retire a agulha e confirmar que injectado pode ainda ser ejectado para assegurar que a agulha não foi obstruído por fragmentos de tecido. </li><li> Reposicionar a tabela de manipulação de imagem e para injectar o lado do embrião. Manter o número de embriões injectados a um máximo de 3-4 (em uma trompa uterina) para impediralargado anestesia, para permitir a embriões de controlo no corno uterino opostos, e para assegurar que o procedimento não perturbar o desenvolvimento embrionário. </li><li> Depois de injectar o número desejado de embriões, remover o excesso de gel de ultra-som e colocar suavemente a trompa uterina de volta para o abdómen na sua posição correcta. </li><li> Fechar o abdómen da mãe usando uma camada de fio de sutura para o peritoneu e os músculos abdominais, e uma segunda camada de fio de sutura para a pele. </li><li> Injetar o mouse com a primeira dose de medicação para dor. Use uma injeção de 0,05-0,1 mg / kg de Buprenorfina 15 min antes do término da anestesia e três injeções adicionais com intervalos de 12 h. </li><li> Descontinuar anestesia e monitorar o mouse para a recuperação adequada do procedimento. Casa do rato grávida em uma gaiola individual para o período desejado de follow-up. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Mummery, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes:+a+methods+overview.">Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview.</a> Circ. Res. 111, 344-358 (2012).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-organ+tissue+engineering:+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds.">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).</li><li>Dickinson, L. E., Kusuma, S., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstructing+the+differentiation+niche+of+embryonic+stem+cells+using+biomaterials.">Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials.</a> Macromol. Biosci. 11, 36-49 (2011).</li><li>Van Vliet, P., Zaffran, S., Wu, S., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cardiac+development:+a+view+from+stem+cells+to+embryos.">Early cardiac development: a view from stem cells to embryos.</a> Cardiovasc. Res. In press, (2012).</li><li>Cai, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myocardial+lineage+derives+from+Tbx18+epicardial+cells.">A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells.</a> Nature. 454, 104-108 (2008).</li><li>Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+human+stem+cells+into+the+chicken.">Xenotransplantation of human stem cells into the chicken.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Liu, A., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+limb+and+brain+patterning+in+early+mouse+embryos+by+ultrasound-guided+injection+of+Shh-expressing+cells.">Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells.</a> Mech. Dev. 75, 107-115 (1998).</li><li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-guided+microinjection+into+the+mouse+forebrain+in+utero+at+E9.5.">Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+recombinase:+the+universal+reagent+for+genome+tailoring.">Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring.</a> Genesis. 26, 99-109 (2000).</li><li>Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+cells+for+tracking+cell+lineage+and+clonal.">Tracing cells for tracking cell lineage and clonal.</a> Dev. Cell. 21, 394-409 (2011).</li><li>Phoon, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tools+for+the+developmental+biologist:+ultrasound+biomicroscopy+of+mouse+embryonic+development.">Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development.</a> Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).</li><li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Ex+vivo+Culture+Method+for+the+Embryonic+Mouse.">A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse.</a> J. Vix. Exp. , (2013).</li><li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels:+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue.">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os ex vivo protocolos de injeção intra-cardíacas descritas acima são projetados para preservar a função miocárdica por pelo menos 48 horas, em meados de estágio (E9.5-E11.5) embriões de camundongos. Estas abordagens de injecção de permitir a injecção espacialmente direccionada de DNA ou células. Os poucos exemplos mostrados nas Figuras 1-3 fornecer prova de conceito para delinear ex vivo e em mecanismos moleculares in vivo de processos de desenvolvimento...

Mais de uma década atrás, as células-tronco embrionárias humanas (HuESCs) foram derivadas de blastocistos humanos 1. Desde então, estas células tornaram-se objecto de um importante campo de pesquisa que aborda questões não satisfeitas em biologia do desenvolvimento humano. HuESCs ter ainda fornecido esperanças na medicina regenerativa. Nos últimos anos, as células estaminais pluripotentes humanas induzidas (iPSCs) foram geradas a partir de células somáticas de doentes específica, o fornecimento de modelos de doença genética 2. Muitos em protocolos in vitro para a diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas ou embrionárias para várias linhagens celulares, incluindo linhagens coração 3, foram relatados. As células diferenciadas são frequentemente fenotipadas por análise de ARN e a expressão da proteína, a imunocoloração, e / ou em testes funcionais in vitro. No entanto, os derivados de células estaminais pluripotentes tem que ser colocada num ambiente embrionária adequada, a fim de testar se adquirem totalmente o cell destino de suas contrapartes embrionárias e se recapitular a função in vivo genuíno em resposta às sugestões regionais. Enquanto a engenharia de tecidos é promissor, ainda não fornecem todos os sinais conhecidos e desconhecidos do bom desenvolvimento in vivo tecido embrionário 4,5. Rotulagem celular com corantes ou vetores retrovirais em embriões, incluindo embriões de camundongos, trouxeram informações importantes sobre a origem embrionária das linhagens de células durante o desenvolvimento cardíaco 6. Por exemplo, corante de injecção para dentro do espaço pericárdico de embriões de ratinho ex vivo, seguido de cultura in vitro de corações isolados, foi usado para marcar as células do epicárdio e seus descendentes 7. No entanto, corante e marcação celular retroviral foram aplicados principalmente para embriões de rato com os órgãos ainda pouco desenvolvidos, ou embriões de galinha, que são mais facilmente acessível 8. Uma exceção é o cérebro, que é mais fácil de atingir em embryos 9,10. Tal abordagem ainda não tenha sido aplicada ao coração do rato embrionário de bater. Para complementar a rotulagem direto com corantes ou vírus e para realizar o rastreamento em estágio mais avançado embriões de camundongos e ratos adultos da linhagem, a abordagem marcação celular foi combinada com análise de camundongos transgênicos, utilizando a tecnologia Cre / Lox. A abordagem Cre / Lox 11 apresenta no entanto algumas limitações devido à especificidade espaço-temporal das regiões reguladoras genómicas utilizadas para conduzir a expressão da recombinase, e a eficiência da recombinação Cre / Lox 12. Além disso, esta abordagem não contempla plenamente as questões específicas de aquisição orientada a migração de células de destino da célula, uma vez que só pode rotular um precursor após a ativação da região reguladora usada para dirigir a expressão Cre. Ele também não pode aplicar-se a embriões humanos para as questões éticas óbvias. Dadas essas limitações, nós projetamos uma série de novos protocols para injectar uma variedade de agentes de marcação de células, tais como corantes fluorescentes, vírus, moduladores de expressão de genes, tais como vectores de rotulagem e shRNAs celular à base de ADN, ou células no embrião de rato em E9.5 e as fases posteriores do desenvolvimento em regiões alvo do coração. As injeções de DNA / celulares usar uma lupa e um dispositivo de microinjeção simples combinado com ex vivo de cultura de embriões de até 48 horas, ou de coração isolado ou cultura explante embrionário para 48-72 horas. Nós também relatam um protocolo de microinjeção mediada por ultra-som nos corações embrionárias de rato no útero. Esta técnica permite acompanhar o desenvolvimento de embriões 13 e permite a longo prazo de seguimento dos injectates e / ou células marcadas. Descobrimos que estas abordagens preservar a função do órgão e proporcionar um ambiente mais representativo do que os testes in vitro de potencial de células estaminais. Ele também oferece a oportunidade de acompanhar a migraçãode rotulados e / ou injetaram células para controlar o seu destino. Em última análise, este deve proporcionar uma melhor compreensão da padronização tecido regional e processos biológicos fundamentais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="986">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Setups / Hardware</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:411px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">40 MHz Transducer</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td>MS550S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microinjector</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td>5242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td>5171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Nitrogen</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>required to pressurize the injector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Rail system</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">rotator</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>to rotate glass tube with embryos inside the incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Standard incubator</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>5% CO2, 37 C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:175px;">Zeiss</td>
			<td style="width:104px;">Discovery. V8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Vevo 2100</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microinjection</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">borosilicate capillary tubes</td>
			<td style="width:175px;">World Precision Instrument</td>
			<td style="width:104px;">KTW-120-6</td>
			<td>1.2 mm external diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pipette puller&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sutter</td>
			<td style="width:104px;">Model P87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">microinjection needles</td>
			<td>Origio-Humagen&#160;</td>
			<td>C060609</td>
			<td>OD/ID 1.14mm/53mm, with 50/35 um OD/ID tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hamilton syringes&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Petridishes</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral oil&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td>M8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Silicon membrane</td>
			<td style="width:175px;">Visualsonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>4.3x4.3 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Play-Doh</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:175px;">Vet One</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hair removal agent&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Nair</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:297px;">eye lubricant</td>
			<td style="width:175px;">Optixcare</td>
			<td>31779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Electrode gel (Signa)</td>
			<td style="width:175px;">Parker</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Suture</td>
			<td style="width:175px;">Sofsilk 5-0</td>
			<td style="width:104px;">S1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ultrasound gel</td>
			<td style="width:175px;">Aquasonic</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride)</td>
			<td style="width:175px;">Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.</td>
			<td style="width:104px;">NDC 12496-0757-1</td>
			<td>0.05-0.1 mg/kg in saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Elastomer</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Glass petridishes</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>60mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">insect pins&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Media and culture reagents</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optimem medium</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">51985026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M2 medium&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Eagle Medium</td>
			<td style="width:175px;">Lonza</td>
			<td style="width:104px;">BE12-640F</td>
			<td>high glucose and 50% rat serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M16 medium&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">M7292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">rat serum</td>
			<td style="width:175px;">Janvier</td>
			<td style="width:104px;">ODI 7158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pennicilin/streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">15140-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">oxygen 40%</td>
			<td style="width:175px;">Air liquid</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>required to oxygenate the embryo culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:104px;">RVJ35882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">matrigel</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">collagen type I</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">354236</td>
			<td>to coat culture dishes for explant culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">culture dishes</td>
			<td style="width:175px;">Dutcher /Orange</td>
			<td style="width:104px;">131020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Injectates</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CDCFDA-SE&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Molecular Probes&#160;</td>
			<td>C1165</td>
			<td>25mg/ml DMSO. Store at -20 C. Dilute 1:100-200 in saline before use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PGK-GFP-expressing lentivirus&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>~8E9 transducing units/ml DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell labeling and injection in developing embryonic mouse hearts

Testando o destino de células-tronco embrionárias de derivativos ou pluripotentes in vitro protocolos levou a resultados controversos que não necessariamente refletem seu potencial in vivo. De preferência, essas células devem ser colocados num ambiente embrionária adequada, a fim de adquirir o seu fenótipo definitiva. Além disso, células de linhagem rastreamento estudos no rato após marcação das células com corantes ou vetores retrovirais permanece mais limitada a embriões de camundongos em fase inicial com órgãos ainda pouco desenvolvidos. Para superar essas limitações, nós projetamos protocolos microinjeção padrão e mediada por ultra-som para injetar vários agentes em regiões-alvo do coração em embriões de camundongos em E9.5 e estágios mais avançados de desenvolvimento. Explante embrionárias ou embriões são então cultivados ou à esquerda para continuar a desenvolver no útero. Esses agentes incluem corantes fluorescentes, vírus, shRNAs, ou células-tronco progenitoras derivadas de células. Nossos abordagens permitir preservação do function do órgão durante o acompanhamento de migração e destino de células marcadas e / ou injetadas. Estas tecnologias podem ser estendidos a outros órgãos e será muito útil para abordar questões biológicas fundamentais em biologia do desenvolvimento.

Utilizando os protocolos de injecção descritos acima, as células podem ser identificadas e / ou injectado no coração embrionário do rato. Como prova do conceito, vários exemplos são mostrados na qual o protocolo de injecção e o ex vivo AVC explante, isolado do coração, ou a cultura do embrião inteiro foram combinadas (Figura 1). A Figura 1 mostra a preparação do embrião, antes da injecção das células. O embrião E9.5 é removido d...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts at JoVE.com

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Nós descrevemos uma série de métodos para injectar corantes, os vectores de ADN, vírus e células, a fim de controlar tanto o destino celular e fenótipo das células endógenas e enxertados derivados de células embrionárias ou pluripotentes dentro de embriões de ratinho no dia embrionário (E) 9,5 e as fases posteriores de desenvolvimento.

Rotulagem celular e injeção em Desenvolvimento embrionárias corações do rato

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

cell-labeling-and-injection-in-developing-embryonic-mouse-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K visualizações.  Aix-Marseille University.  Nós descrevemos uma série de métodos para injectar corantes, os vectores de ADN, vírus e células, a fim de controlar tanto o destino celular e fenótipo das células endógenas e enxertados derivados de células embrionárias ou pluripotentes dentro de embriões de ratinho no dia embrionário (E) 9,5 e as fases posteriores de desenvolvimento. 

Vídeo: Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

Medição Exocitose em Neurônios Usando Labeling FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Biologia

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

Eletroporação única célula in vivo dentro do cérebro intacto desenvolvimento

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

Na rotulagem in vitro de células estaminais embrionárias humanas para Ressonância Magnética

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparação de embriões de Microscopia Eletrônica do Drosophila Tubo cardíaco embrionário

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Isolamento e derivação de células embrionárias de rato Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

Retro-orbital de injeção no Zebrafish Adulto

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

Gravações de uma única célula de sucção de cones fotorreceptores rato

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Vídeo Bioinformática Análise de Crescimento Humano embrionárias Colony Stem Cell

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In vivo de imagens e tratamentos terapêuticos em um modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Orofacial clefts are the most frequent craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal facial development3. In human and mouse, initial growth and patterning of the face relies on several small buds of tissue, the facial prominences4,5. The face is derived from six main prominences: paired frontal nasal processes (FNP), maxillary prominences (MxP) and mandibular prominences (MdP). These prominences consist of swellings of mesenchyme that are encased in an overlying epithelium. Studies in multiple species have shown that signaling crosstalk between facial ectoderm and mesenchyme is critical for shaping the face6. Yet, mechanistic details concerning the genes involved in these signaling relays are lacking. One way to gain a comprehensive understanding of gene expression, transcription factor binding, and chromatin marks associated with the developing facial ectoderm and mesenchyme is to isolate and characterize the separated tissue compartments.
Here we present a method for separating facial ectoderm and mesenchyme at embryonic day (E) 10.5, a critical developmental stage in mouse facial formation that precedes fusion of the prominences. Our method is adapted from the approach we have previously used for dissecting facial prominences7. In this earlier study we had employed inbred C57BL/6 mice as this strain has become a standard for genetics, genomics and facial morphology8. Here, though, due to the more limited quantities of tissue available, we have utilized the outbred CD-1 strain that is cheaper to purchase, more robust for husbandry, and tending to produce more embryos (12-18) per litter than any inbred mouse strain8. Following embryo isolation, neutral protease Dispase II was used to treat the whole embryo. Then, the facial prominences were dissected out, and the facial ectoderm was separated from the mesenchyme. This method keeps both the facial ectoderm and mesenchyme intact. The samples obtained using this methodology can be used for techniques including protein detection, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, microarray studies, and RNA-seq.

A protocol for separation of embryo facial ectoderm and mesenchyme is described. We use Dispase II to treat whole embryos first, dissect whole facial prominences out, and then separate the facial ectoderm and mesenchyme.

Separação de Ectoderma embrionárias de camundongos Facial e mesênquima

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...