This work has been funded by the National Research Foundation grant NRF-CRP4-2008-02 (J.T.) and Tier 1 grant RG 51/13.

Este protocolo é baseado nos seguintes recursos, que devem ser encaminhados para mais detalhes e considerações especiais 3, 25-28. 1. Densidade de harmonização de micelas detergentes com 2 H2O Nota: A densidade da solução tampão deve ser adaptada à densidade das micelas detergentes. Agentes de ajuste de densidade comuns incluem 2 H 2 O, 2 H 18 O, 2 H 2 O 18, glicerol e sacarose 29. H 2 O 18 tem a mesma densidade que 2 H 2 O e pode ser uma escolha melhor se deuteração de protões permutáveis ​​na proteína não é desejado. Neste processo, a densidade de 3- -propanesulfonate (C14SB) detergente (N, N-dimethylmyristylammonio) em Tris 50 mM pH 7,3, NaCl 100 mM será combinado com 2 H 2 O. Como uma estimativa inicial as seguintes concentrações de2 H2O será utilizado: 10, 30, e 50% v / v. 1.1. Preparação de amostra <ol><li> Preparar as seguintes soluções de reserva e esterilizar filtro através de um filtro de seringa de 0,2 um: 50 ml de Tris 500 mM pH 7,3 e NaCl 1 M (tampão 10X); 1 mL C14SB 250 mM (solução detergente 50X). </li><li> Prepare a 200 ul de solução de amostra através da mistura de 20 uL 10X tampão, 4 ul 50X solução detergente, 20 ul de H 2 O 2 (99,9%), e 156 ul de H2O desionizada Prepare também 200 jil de solução de referência, através da mistura de 20 uL solução tampão 10X, 20 ul de H 2 O 2 (99,9%), e 160 ul de H2O desionizada </li><li> Repetir o passo 1.1.2 para os outros 2 H 2 O concentrações, isto é, 30% e 50%, ajustando as quantidades de H 2 O 2 e H 2 O apropriadamente. </li></ol> 1.2. Assembleia de 6 canais AUC células e as amostras de carregamento para dentro das células. Nota: Existem dois tipos de células AUC, dependendo do método de carregamento de amostra. As células sem preenchimento externa tem de ser carregados antes da sua selagem da célula, ao passo que as células de enchimento externo pode ser carregado depois as células são selados. Montagem de uma célula de AUC externa de enchimento foi descrito anteriormente 3. Neste protocolo, a montagem de uma célula AUC 6 canais sem abastecimento externo é descrito. A principal diferença é que tem anéis de rosca de ambos os lados que têm de ser apertadas separadamente, e ele não precisa de tampões de habitação (Fig. 1). A diferença de etapas de montagem são destacadas a seguir. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig1.jpg" /> Figura 1. Vista explodida de uma célula AUC 6 canais sem abastecimento externo. Este valor foi modificado a partir do Beckman Coulter An-50 e An-Ti Ti 60 Analytical Rotor, Cells, e manual do usuário frontal. <ol><li> Preparar dois conjuntos de janelas para cada célula da AUC com janela de safira, em vez da janela de quartzo (Fig. 2). Coloque a junta da janela no suporte da janela. Ligeiramente dobrar o forro de janela e colocá-lo no suporte da janela de tal modo que a abertura é formada para a ranhura oposta titular janela. Coloque a janela de safira dentro do forro janela, alinhando a marca com a chaveta titular janela. Nota:. A janela de quartzo é compressível e, portanto, irá produzir refracção mais luz a alta velocidade 28, 30 Portanto, para medições de interferência acima de 30000 rpm, como nesta experiência correspondente densidade, são utilizadas janelas de safira. Uma janela de safira, é mais pesado do que a janela de quartzo e tem um &quot;X&quot; para o lado gravado. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig2.jpg" /> Figura 2. Vista explodida of o conjunto janela. Este valor foi modificado a partir do Beckman Coulter An-50 e An-Ti Ti 60 Analytical Rotor, de células e, manual do usuário Counterbalance <ol><li> Coloque o compartimento celular com o número de peça de cabeça para baixo. Com os keyways alinhadas com a chave da habitação, deslizar para dentro da caixa de células em primeiro lugar, uma peça central de 6 sector com o lado chanfrado para baixo, seguido por um conjunto de janela com a janela virada para baixo (Fig. 1, à esquerda). </li><li> Cubra ligeiramente o roscas do anel de rosca e anel de parafuso arruela com spinkote. Coloque uma arruela anel de parafuso na parte superior do conjunto janela. Instale o anel de parafuso na habitação janela com a palavra &quot;OUT&quot; voltado para fora. Aperte o anel de parafuso utilizando a ferramenta de alinhamento celular. </li><li> Usando a chave de torque, aperte o anel de parafuso para apenas 60 libras por polegada. </li><li> Coloque a célula com o número de peça vertical e posicionadas em 12 horas. Load 120 ul de referência para as carreiras da esquerda e 110 ul de amostra para as carreiras da direita. Certifique-se de que cada amostra e referência está corretamente pareado. Nota: O volume de amostra exacta não é crítica, mas a referência precisa de ter um pouco mais do que o volume da amostra (5-10 uL) de modo que o menisco da amostra sejam distintas. </li><li> Cuidadosamente deslize para dentro do conjunto habitacional celular uma janela com a janela virada para baixo (Fig. 1, à direita). Tome cuidado para não perturbar o celular excessivamente e derramar o conteúdo. </li><li> Repita o passo 1.2. 3 e 1.2. 4, apertando o segundo anel de parafuso para 120 libras por polegada. Inverter o celular e voltar a apertar o primeiro anel de parafuso para 120 libras por polegada. </li><li> Carregar as células dentro do rotor, instalar o rotor no centrifugador e instalar o monocromador de acordo com as instruções do fabricante 28. Nota: Os detalhes deste step também pode ser encontrado nesta referência 3. </li></ol> 1.3. Configurando medição interferência <ol><li> Inicie o software de interface de usuário para o instrumento AUC e realizar a configuração de laser radial e calibração para cada célula a 3000 rpm, de acordo com as instruções do fabricante, que serão resumidos na etapa seguinte. </li><li> 1.3.1.1 Depois de vácuo suficiente tiver sido atingido (&lt;100 micra), executar a centrifugar a 3000 rpm. Visualize o padrão de interferência no software de interface de usuário e ajustar os parâmetros do laser para obter o mais alto contraste. </li><li> Criar um novo ajustar o arquivo (File | New File) especificando &quot;Equilibrium&quot; e &quot;interferência&quot; de medição. Configurar um método de equilíbrio de sedimentação (botão &quot;Method&quot;) para serem executadas em 45000 rpm ou a velocidade mais alta prevista para amostras de proteínas, o que for maior, com temperatura de execução a 20 ° C e coletar uma verificação a cada 15 minutos. Monitor equilíbrio andamento abrindo os arquivos de dados em HeteroAnalysis e selecionando a função &quot;Match&quot;, depois de pelo menos 12 horas (aproximadamente durante a noite, Fig. 3). Nota: a função similar também está disponível em SEDFIT (Opções | Carregando Opções | Teste abordagem para Equilibrium). </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig3.jpg" /> Figura 3. O resultado de função HeteroAnalysis Match. A função de fósforo pode ser usado para monitorar o progresso de equilíbrio, comparando RMSD entre as varreduras sucessivas e a última verificação. Este exemplo mostra para atingir o equilíbrio depois de 8 horas, tal como indicado por valores RMSD assimptóticas ao eixo-X. 1.4. Análise de dados <ol><li> Para cada conjunto de amostras, traçar o declive do perfil de distribuição radial contra o 2 H2O concentração. Nota: A distribuição será um muito superficial exponencial que apabordagens linearidade. Intersecção do eixo-X corresponde à concentração de H 2 O 2 correspondentes. </li><li> Para resultados mais precisos, realizar o experimento em várias repetições. Alternativamente, repetir a experiência com uma faixa mais estreita de 2 H 2 O concentração. </li></ol> 2. Sedimentação equilíbrio do SH em micelas C14SB 2.1. Parâmetros de execução <ol><li> Calcular a densidade e viscosidade do tampão, a proteína volume específico parcial e velocidade de centrifugação usando SEDNTERP. Para calcular a densidade e viscosidade de buffer, selecione Compute na seção &quot;Buffer de Dados Select&quot; e insira os componentes do tampão em conformidade, incluindo a D 2 O concentração. </li><li> 2.1.1.1 Para calcular proteína volume específico parcial, selecione Compute na secção de &quot;V-bar&quot; e digite a sequência de aminoácidos da proteína. Especifique o tamanho oligomï¿½ica esperado mais alto em &quot;Faça um oligômero deste monômero: N =&quot;campo, neste caso N = 5. Calcule a velocidade ao entrar valores no campo RPM na janela principal até σ ≈ 1; esta é uma regra de ouro para garantir uma boa forma exponencial do perfil de distribuição radial 25. Nota: Os valores calculados para esta experiência foi a seguinte: ρ = 1,03839 g / ml, 1,0267 η = cP = 0,7569 ml / g, 1 ω = 16000 rpm. </li><li> Calcule velocidades posteriores a seguir para garantir adequada diferença entre o perfil de distribuição em uma velocidade e no próximo 25. Nota: Isto também pode ser feito a partir da função &quot;Estimar equilíbrio rotor acelera função&quot; em SEDFIT, que leva em conta a coluna de solução (volume de enchimento). </li></ol> 2.2. Preparações de amostras <ol><li> Prepare 1 ml de solução de referência com mM C14SB 5 e 32,3% 2 H 2 O, conforme determinado a partir de experimento correspondente densidade (seção 1), através da mistura de 100 l solutio 10X tampãon (passo 1.1.1), 20 ul de 50X solução detergente (passo 1.1.1), 323 ul de H 2 O 2 (99,9%) e 527 ul de H2O desionizada </li><li> Dissolve-se liofilizado, SH péptidos purificados por HPLC (expressão e purificação descrito anteriormente 31) num solvente apropriado tal como metanol ou 50% v / v de acetonitrilo aquoso. Medir A280 dos péptidos dissolvidos em escala microlitro espectrofotómetro UV / Vis e alíquota para três amostras para dar um 280, 12 mm = 0,3, 0,5, e 0,8 (A280, 10 milímetros = 0,25, 0,417, e 0,67) quando diluída para cada 130 ul. Liofilizar as amostras durante a noite e ressuspender em 130 solução de referência ul (passo 2.2.1) para dar soluções de amostra. Nota: proteína CS pode ser detectada a partir de UV / Vis a absorvância a 280 nm, porque contém resíduos de Tyr e Trp. Proteínas sem resíduos aromáticos podem ser detectados por marcá-los com um cromóforo adequado, utilizando um mutante contendo Trp, ou usando interferirnce em vez de medições de absorvância. </li><li> Siga as etapas na seção 1.2 para montar uma célula AUC 6 canais com janelas de quartzo. Carregar a amostra de maior concentração (280 A, 12 mm = 0,8) no canal mais próxima do centro do rotor e menor concentração da amostra (A280, 12 mm = 0,3) mais distante do centro do rotor. </li></ol> 2.3. Configurando medidas de absorbância <ol><li> Criar um novo ajustar o arquivo (File | New File) especificando &quot;Equilibrium&quot; e mensuração &quot;Absorbance&quot;. Especificar 280 nm como o comprimento de onda do detector. </li><li> Execute a calibração radial a 3000 rpm, verificando &quot;calibração Radial antes da primeira varredura&quot; em Opções de verificação, especificando a coleta de dados em baixa resolução, por exemplo, com tamanho do passo Radial = 0,01 centímetros, réplicas = 3 (baixa resolução, rápida), e executar uma única varredura . Após a verificação for concluída, desmarque a opção. </li><li> Configurar um método de equilíbrio de sedimentação (&quot;Method botão &quot;) para ser executado na primeira velocidade calculada no passo 2.1.3, a 20 ° C, e recolher uma verificação a cada 30 minutos. Em &quot;Detail&quot; uns dos células, especifique a coleta de dados em baixa resolução como no passo 2.3.2. Monitorar o progresso de equilíbrio, abrindo os arquivos de dados em HeteroAnalysis e selecionando a função &quot;Match&quot;, após pelo menos 18 horas (aproximadamente durante a noite, Fig. 4). Nota: para atingir o equilíbrio podem demorar muito mais tempo para a primeira velocidade, enquanto velocidades subseqüentes levará menos tempo. </li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig4.jpg" /> Figura 4. Os resultados de função HeteroAnalysis Match. A primeira e segunda velocidades (topo à esquerda e à direita) parecem ter atingido o equilíbrio, mas é melhor esperar mais algumas horas para ter certeza. Em comparação, a terceira e quarta velocidades (canto inferior esquerdo e direito) têm claramente atingido o equilíbrioem um tempo menor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52404/52404fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol><li> Uma vez que o equilíbrio foi atingido, recolher uma única varredura em alta resolução, por exemplo, com o tamanho do passo Radial = 0,001 centímetros, réplicas = 10 (alta resolução, lento). </li><li> Após a verificação for concluída, repita o passo 2.3.3 e 2.3.4 para a próxima velocidade. </li><li> Opcionalmente, quando necessário o tempo para atingir o equilíbrio para cada velocidade é conhecida (ou calculada a partir da experiência), configurar o método de equilíbrio de sedimentação de verificação para incluir todas as velocidades calculadas no passo 2.1.3 e recolher uma varredura após o tempo de equilíbrio para cada velocidade. Neste caso, especifique a coleta de dados de alta resolução em &quot;Detail&quot; cada célula. </li></ol> 2.4. A análise dos dados em SEDFIT e SEDPHAT Nota: Para mais detalhes e considerações em leitor de análise de dados é chamado to seguinte site: www.analyticalultracentrifugation.com. <ol><li> Abertas scans de alta resolução em SEDFIT (Dados | dados de equilíbrio de carga de sedimentação) e dividir os dados em três canais (estas correspondem a diferentes concentrações para cada amostra; Opções | Carregando Opções | Salve 6 canais de dados brutos em 3 subconjuntos). </li><li> Re-abertos arquivos de dados que pertencem a uma mesma amostra e mesma concentração, mas diferentes velocidades em SEDFIT. Ajuste o menisco (linha vermelha vertical), fundo de células (linha vertical azul) e os limites de montagem (linhas verdes verticais), e exportar os dados para uso em SEDPHAT (Data | Exportação de dados para SEDPHAT). Entrada dos parâmetros calculados na etapa 2.1.1, assim como o tipo de rotor e tipo central, conforme solicitado. Repita este passo para cada amostra e concentração. </li><li> Abra todos os dados da mesma amostra (todas as concentrações e velocidades) em SEDPHAT e preencha parâmetros da experiência; um exemplo é mostrado na Fig. 5. Nota: quando D 2 O é adicionado no buffer, deut<html> peração de protões permutáveis ​​alterar significativamente o peso molecular da proteína, especialmente para as proteínas solúveis em água. As proteínas da membrana, especialmente as pequenas, como proteína SH, são menos afetados porque as regiões incorporado à membrana são protegidos de câmbio. Para corrigir isso, introduzir o &quot;tampão D fração mol&quot;. Nota: Nesta etapa é recomendado para salvar o conjunto de dados editados separadamente, selecionando menu Data | copiar todos os dados e salvar como Nova Configuração. </li><li> Selecione um modelo e preencha parâmetros globais para esse modelo. Nota: A título de exemplo, o modelo &quot;Monómero-n-Mer auto-associação&quot; e os seus parâmetros são apresentados na Fig. 6. </li></ol><img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig5.jpg" /> Figura 5. Um exemplo de como preencher parâmetros experimentais. files / ftp_upload / 52404 / 52404fig6.jpg &quot;/&gt; Figura 6. Um exemplo de como preencher parâmetros globais para o modelo monômero-n-Mer Auto-Associação. <ol><li> Executar um Fit global selecionando o menu Fit | Global de Fit e esperar até que os converge ajuste. Anote (ou tomar um screenshot) os resultados de ajuste, especialmente o qui-quadrado mundial reduziu e log K de valores. Extrato de outros dados, como dados de ajuste e resíduos de montagem a partir do menu de cópia e exibe | Mostrar informação termodinâmica. </li><li> Retornar para parâmetros globais e verificar M (1) para acomodar o peso molecular monômero e repita o passo 2.4.5. Anote o peso molecular equipada e reduziu qui-quadrado global. </li><li> Repita o passo 2.4.3 a 2.4.6 para cada modelo a ser testado e comparar a qualidade ajuste de cada modelo, comparando a redução do valor do qui-quadrado global, bem como resíduos de montagem. Nota: As pequenas e aleatórias resíduos montagem geralmente indica um bom ajuste, e o modelo que se encaixa melhor fariatem a menor redução do qui-quadrado global. O peso molecular do monómero colocada e que o valor de qui-quadrado não devem diferir substancialmente da do peso molecular (teórico) fixo. </li><li> Calcule o intervalo de confiança para o registro obtido Ka por valor selecionando primeiro Estatísticas | Critical qui-quadrado para as projeções de superfície de erro e de introduzir o intervalo de confiança desejado. Em seguida, vá para Estatísticas | Gerar projeção superfície de erro 1-dimensional e desmarque log Ka em diálogo parâmetros globais para obter os valores de qui-quadrado para log Ka. Nota: Os leitores são aconselhados a consultar as seguintes fontes (http://www.analyticalultracentrifugation.com/ sedphat / statistics.htm) para obter mais detalhes sobre o método 32, bem como ilustração deste método 33. </li></ol>

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W., Ng, L., Xin, L., Gong, X., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+ion+channel+activity+of+the+human+respiratory+syncytial+virus+(hRSV)+small+hydrophobic+protein+transmembrane+domain.">Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain.</a> Protein Sci. 17, 813-820 (2008).</li><li>Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Small+Hydrophobic+Protein+and+Structural+variations+in+a+bicelle+environment.">Inhibition of the Human Respiratory Syncytial Virus Small Hydrophobic Protein and Structural variations in a bicelle environment.</a> J. Virol. 88 (22), 11899-914 (2014).</li><li>Burgess, N. K., Stanley, A. M., Fleming, K. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+membrane+protein+molecular+weight+using+sedimentation+equilibrium+analytical+ultracentrifugation.">Determination of membrane protein molecular weight using sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation.</a> Curr. Protoc. Prot. Sci. 53, 17.12.11-17.12.13 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An-50 Ti and An-60 Ti Analytical Rotor, Cells, and Counterbalance. , (2005).</li><li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+membrane+proteins+in+detergent+solution+by+analytical+ultracentrifugation:+Different+methods+for+density+matching.">Studying membrane proteins in detergent solution by analytical ultracentrifugation: Different methods for density matching.</a> Prog. Colloid Polym. Sci. 113, 176-181 (1999).</li><li>Laue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+20.3.">Ch. 20.3.</a> Current Protocols in Protein Science. 20, 20.23.21-20.23.13 (2001).</li><li>Gan, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Small+Hydrophobic+Protein+Of+The+Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Forms+Pentameric+Ion+Channels.">The Small Hydrophobic Protein Of The Human Respiratory Syncytial Virus Forms Pentameric Ion Channels.</a> J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).</li><li>Bevington, P. R., Robinson, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Data reduction and error analysis for the physical sciences. 336, (1969).</li><li>Schuck, P., Radu, C. G., Ward, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sedimentation+equilibrium+analysis+of+recombinant+mouse+FcRn+with+murine+IgG1.">Sedimentation equilibrium analysis of recombinant mouse FcRn with murine IgG1.</a> Molecular Immunology. 36, 1117-1125 (1999).</li><li>Gan, S. W., Vararattanavech, A., Nordin, N., Eshaghi, S., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cost-effective+method+for+simultaneous+homo-oligomeric+size+determination+and+monodispersity+conditions+for+membrane+proteins.">A cost-effective method for simultaneous homo-oligomeric size determination and monodispersity conditions for membrane proteins.</a> Anal. Biochem. 416, 100-106 (2011).</li><li>Montserret, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+structure+and+ion+channel+activity+of+the+p7+protein+from+hepatitis+C+virus).">NMR structure and ion channel activity of the p7 protein from hepatitis C virus).</a> J. Biol. Chem. 285, 31446-31461 (2010).</li><li>Stouffer, A. L., DeGrado, W. F., Lear, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Ultracentrifugation+Studies+of+the+Influenza+M2+Homotetramerization+Equilibrium+in+Detergent+Solutions.">Analytical Ultracentrifugation Studies of the Influenza M2 Homotetramerization Equilibrium in Detergent Solutions.</a> Progr Colloid Polym Sci. 131, 108-115 (2006).</li><li>Sorkin, A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+and+endocytosis:+Close+encounters+of+many+kinds.">Signal transduction and endocytosis: Close encounters of many kinds.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 600-614 (2002).</li><li>Gan, S. W., Ng, L., Lin, X., Gong, X., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+ion+channel+activity+of+the+human+respiratory+syncytial+virus+(hRSV)+small+hydrophobic+protein+transmembrane+domain.">Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain.</a> Protein science : a publication of the Protein Society. 17, 813-820 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Este documento fornece um protocolo experimental para a preparação e análise de oligomerização de uma pequena proteína de membrana em detergente usando equilíbrio sedimentação da amostra. O protocolo descrito é igualmente válido para -e simpler- proteínas solúveis, como o passo correspondente da densidade não é necessária. Com efeito, o sistema é constituído por uma mistura de detergente e da proteína. Para realizar estudos de sedimentação, o detergente deve estar invisível para o campo gravitacion...

Ultracentrifugação analítica 1-5 é um dos métodos mais importantes para estudar as interações de macromoléculas em condições fisiológicas, sendo acessível para ambas as interações fracas e fortes. O método é livre-label e utiliza a absorção de luz ou interferência, e até mesmo sistemas ópticos de fluorescência pode ser usado para acessar faixas de concentração ao longo de várias ordens de magnitude 6. Este método é especialmente útil, pois a maioria dos processos bioquímicos dependem de interações reversíveis. A estequiometria e resistência destas interacções têm de ser quantitativamente caracterizada para compreender os processos biológicos, e um número de métodos existentes para este fim 7, 8. No entanto, as interacções transientes são difíceis de estudar 9. A escolha de um método para caracterizar as interacções macromoleculares depende da sua natureza estática ou dinâmica. No primeiro caso, SEDIM<html> entação velocidade (SV) é usada, em que a taxa de transporte radial é medida e complexos são fraccionados com base em diferenças na massa e forma flutuante. Em contraste, as associações dinâmicas que são reversíveis na escala temporal da experiência não pode ser fisicamente separadas. Neste caso, auto ou hetero-interacções que as interacções não covalentes são em um equilíbrio que depende da concentração de proteína total. Estas interacções dinâmicas pode ser estudado por ambos equilíbrio de sedimentação (SE) e velocidade de sedimentação (SV) 10. No entanto, o primeiro método é mais simples de realizar e é descrito aqui. Em SE, a centrifugação é realizada a uma velocidade suficientemente baixa de modo a que se atingir um equilíbrio entre difusão e sedimentação. Neste ponto, o perfil de equilíbrio de um sinal óptico (UV-VIS), como uma função da distância radial, pode ser analisada utilizando modelos termodinâmicos pré-definido para associações 11. ve_content &quot;&gt; No presente documento, um estudo de equilíbrio de sedimentação, é apresentado o auto-associação de uma proteína da membrana virai que forma canais de iões. Devido à sua hidrofobicidade, a experiência é executado em presença de detergentes, e no presente caso, a densidade de solvente tem de ser compensada com a do detergente. No entanto, o protocolo descrito seria idêntica no caso de uma proteína solúvel em água, excepto que sem correspondência de densidade solvente seria necessário. A proteína utilizada é codificado no vírus respiratório sincicial humano (hRSV), um pneumovirus envelopado na família paramyxoviridae que causa a doença do trato respiratório inferior em crianças, idosos e imunocomprometidos populações em todo o mundo 12. Até 64 milhões de casos notificados de infecção hRSV e 160.000 mortes ocorrem a cada ano. O genoma hRSV transcreve 11 proteínas, incluindo as proteínas de membrana de três F, G, e pequeno hidrofóbico (SH). SH proteína está envolvidana patogênese da infecção pelo VSR. RSV sem o gene SH (RSVΔSH) era viável, causou a formação de sincícios e cresceu tão bem como o tipo selvagem (WT) vírus 13-16. No entanto, o vírus RSVΔSH replicado 10 vezes menos eficientemente do que o WT no tracto respiratório superior 15, 16. Além disso, o vírus RSVΔSH foi atenuada nos no rato vivo e modelos chimpanzé 13, 17. A proteína é um SH (RSV subgrupo A) 64 ou 65 (RSV subgrupo B) aminoácidos de comprimento do tipo II de proteína integral da membrana que se acumula maioritariamente nas membranas do Golgi compartimento 18. SH proteína tem um único previu uma hélice transmembranar (TM) 19 de domínio que é altamente conservada 20,21. Os domínios extramembrane C- e N-terminais são orientados lumenally / extracelularmente e no citoplasma, respectivamente. Ambos domínio TM sintético (resíduos 18-43) E SH proteína de comprimento completo foram mostrados para formar homopentamers em uma variedade de detergentes. A forma homopentameric é responsável pela atividade do canal em bicamadas lipídicas planas 22,23. A orientação correcta dos monómeros TM na bicamada lipídica foi primeiro determinada utilizando dicroismo local específico de infravermelhos 23, o qual mostrou His-22 para estar em uma luminal, perto de inter-helicoidal, a orientação. O domínio TM mesma orientação foi confirmada por estudos de RMN que reconstituídas a pentamérica um feixe helicoidal da proteína de comprimento completo em dodecylphosphocholine (DPC) 22 micelas. Neste modelo &#39;micela&#39;, um único domínio TM a- helicoidal foi flanqueada no terminal-N por uma a-hélice, e C-terminal por uma b-gancho de cabelo estendida. Os dois resíduos de proteína protonáveis ​​SH, His-22 e His-51, estão localizados no domínio TM (orientada lumenally), e na extremidade do C-terminal extramembrane β hairpin (medida a partir da poro do canal), respectivamente. Em um ambie bicellarnment, no entanto, o TM α-hélice estende-se a His-51, e ambos os resíduos His são acessíveis para o lúmen do canal 24. A estrutura do canal adopta uma arquitectura em forma de funil 22, onde a região mais estreita (Ser-Cys-29 a 45) 22 está alinhada com cadeias laterais hidrofóbicas (Ile-32, Ile-36, Ile-40 e Leu-44), e Ile-36 define o ponto mais estreito no lúmen do canal. His-22 está localizado na maior abertura deste funil, enquanto que His-51 está na ponta de abertura mais pequena. No presente documento, centrifugação analítica em equilíbrio de sedimentação de um modo foi usado para determinar se a sua protonação afecta a estabilidade do pentâmero da proteína de CS. Neste caso, SH proteína foi solubilizada em detergente de betaína-C14, que tem sido utilizado anteriormente para mostrar que as formas de proteínas pentaméricas oligómeros SH 22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1345">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:448px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T0807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Deuterium oxide 99.8%</td>
			<td style="width:147px;">Cambridge Isotope</td>
			<td style="width:119px;">DLM-4-99.8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">363782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">361964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Cell housing</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">334784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">331376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Window holder</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Window gasket</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">327021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Window liner</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">362329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Sapphire window</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">307177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Quartz window</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">301730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Screw-ring washer</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">362328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Screw ring</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">301922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Spinkote</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">306812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Torque stand assembly</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">361318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Counterbalance</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">360219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Cell alignment tool</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">362340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEDNTERP</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HeteroAnalysis&#160;</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEDFIT</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.analyticalultracentrifugation 
			.com/sedfit.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEDPHAT</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.analyticalultracentrifugation 
			.com/sedphat/default.htm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sedimentation equilibrium of a small oligomer-forming membrane protein: effect of histidine protonation on pentameric stability

Ultracentrifugação analítica (AUC) pode ser usado para estudar as interacções reversíveis entre macromoléculas sobre uma ampla gama de forças de interacção e em condições fisiológicas. Isso faz com que AUC um método de escolha para avaliar quantitativamente estequiometria e termodinâmica dos homo e hetero-associação que são transitórias e reversíveis nos processos bioquímicos. Na modalidade de equilíbrio de sedimentação (SE), um equilíbrio entre difusão e sedimentação fornece um perfil como uma função da distância radial que depende de um modelo de associação específica. Nisto, um protocolo detalhado SE é descrita para determinar a energia associação tamanho e monómero-monómero de uma pequena oligómero de proteína de membrana usando uma ultracentrífuga analítica. ES-AUC é livre de marcador, apenas com base em princípios físicos, e pode ser usado em ambas as proteínas solúveis da membrana e água. Um exemplo é mostrado deste último, o pequeno hidrofóbico (SH) nas proteínas do vírus sincicial respiratório humano (HRSV), Um polipeptídeo de ácido 65-amino com um único transmembranar (TM) de domínio helicoidal-α que forma canais de iões pentaméricos. Dados estrutural à base de RMN mostra que a proteína tem duas SH protonável resíduos de His no seu domínio transmembranar que são orientados de frente para o lúmen do canal. SE experimentos foram concebidos para determinar como pH afeta constante de associação e do tamanho da proteína oligomérica SH. Embora a forma pentamérica foi preservada em todos os casos, a sua constante de associação foi reduzida a pH baixo. Esses dados estão de acordo para uma dependência de pH semelhante ao observado para atividade canal SH, consistente com uma orientação do lúmen das duas Seus teor de resíduos no proteína SH. Este último pode experimentar repulsão eletrostática e estabilidade oligômero reduzida em pH baixo. Em resumo, este método é aplicável sempre que a informação quantitativa sobre proteína-proteína subtis alterações de associação em condições fisiológicas têm de ser medidos.

O perfil radial de distribuição C14SB micelas detergentes em Tris 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,3, forma um exponenciais muito raso que poderiam ser ajustados a um modelo linear (Figura 7A). O declive desta distribuição está inversamente correlacionada com a concentração de D 2 O (Figura 7B). O ponto em que o declive é zero, ou seja, o correspondente D 2 O concentração, verificou-se ser de 32,3%. Veja a Figura 7 ab...

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Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

A sedimentação de equilíbrio de uma proteína de membrana de formação de oligómero pequeno: Efeito de Histidina A protonação em pentamérica Estabilidade

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

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10.5K visualizações.  Nanyang Technological University. Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

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Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

This work outlines the synthesis of a non-emissive, cyclometalated Ir(III) complex, Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1), which elicits a rapid, long-lived phosphorescent signal when coordinated to a histidine-containing protein immobilized on the surface of a magnetic particle. Synthesis of Ir1, in high yields,is complete O/N&#160;and involves splitting of the parent cyclometalated Ir(III) chloro-bridged dimer into two equivalents of the solvated complex. To confirm specificity, several amino acids were probed for coordination activity when added to the synthesized probe, and only histidine elicited a signal response. Using BNT-II, a branched peptide mimic of the malarial biomarker Histidine Rich Protein II (pfHRP-II), the iridium probe was validated as a tool for HRP-II detection. Quenching effects were noted in the BNT-II/Ir1 titration when compared to L-Histidine/Ir1, but these were attributed to steric hindrance and triplet state quenching. Biolayer interferometry was used to determine real-time kinetics of interaction of Ir1 with BNT-II. Once the system was optimized, the limit of detection of rcHRP-II using the probe was found to be 12.8 nM in solution. When this protein was immobilized on the surface of a 50 &#181;m magnetic agarose particle, the limit of detection was 14.5 nM. The robust signal response of this inorganic probe, as well as its flexibility of use in solution or immobilized on a surface, can lend itself toward a variety of applications, from diagnostic use to imaging.

IridiumIII Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.

Iridium (III) luminescentes Sonda para detecção da proteína maláricos Biomarker proteína rica em histidina-II

This work outlines the synthesis of a non-emissive, cyclometalated Ir(III) complex, Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1), which elicits a rapid, long-lived ...

Química

Dynamic Electrochemical Measurement of Chloride Ions

This protocol describes the dynamic measurement of chloride ions using the transition time of a silver silver chloride (Ag/AgCl) electrode. Silver silver chloride electrode is used extensively for potentiometric measurement of chloride ions concentration in electrolyte. In this measurement, long-term and continuous monitoring is limited due to the inherent drift and the requirement of a stable reference electrode. We utilized the chronopotentiometric approach to minimize drift and avoid the use of a conventional reference electrode. A galvanostatic pulse is applied to an Ag/AgCl electrode which initiates a faradic reaction depleting the Cl&#713; ions near the electrode surface. The transition time, which is the time to completely deplete the ions near the electrode surface, is a function of the ion concentration, given by the Nernst equation. The square root of the transition time is in linear relation to the chloride ion concentration. Drift of the response over two weeks is negligible (59 &#181;M/day) when measuring 1 mM [Cl&#713;]using a current pulse of 10 Am-2. This is a dynamic measurement where the moment of transition time determines the response and thus is independent of the absolute potential. Any metal wire can be used as a pseudo-reference electrode, making this approach feasible for long-term measurement inside concrete structures.

Dynamic measurement of chloride ions is presented. Transition time of an Ag/AgCl electrode, during a chronopotentiometric technique, can give the concentration of chloride ions in electrolyte. This method does not require a stable conventional reference electrode.

Dinâmica eletroquímico Medição de íons cloreto

This protocol describes the dynamic measurement of chloride ions using the transition time of a silver silver chloride (Ag/AgCl) electrode. Silver silver ...

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.

This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.

Local Dirigido Labeling rotação e EPR espectroscópicos Estudos de Canais pentamérica Ligand-Gated Ion

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Original Experimental Approach for Assessing Transport Fuel Stability

The study of fuel oxidation stability is an important issue for the development of future fuels. Diesel and kerosene fuel systems have undergone several technological changes to fulfill environmental and economic requirements. These developments have resulted in increasingly severe operating conditions whose suitability for conventional and alternative fuels needs to be addressed. For example, fatty acid methyl esters (FAMEs) introduced as biodiesel are more prone to oxidation and may lead to deposit formation. Although several methods exist to evaluate fuel stability (induction period, peroxides, acids, and insolubles), no technique allows one to monitor the real-time oxidation mechanism and to measure the formation of oxidation intermediates that may lead to deposit formation. In this article, we developed an advanced oxidation procedure (AOP) based on two existing reactors. This procedure allows the simulation of different oxidation conditions and the monitoring of the oxidation progress by the means of macroscopic parameters, such as total acid number (TAN) and advanced analytical methods like gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) and Fourier Transform Infrared - Attenuated Total Reflection (FTIR-ATR). We successfully applied AOP to gain an in-depth understanding of the oxidation kinetics of a model molecule (methyl oleate) and commercial diesel and biodiesel fuels. These developments represent a key strategy for fuel quality monitoring during logistics and on-board utilization.

Oxidation stability of transport fuels has become a concern for future fuel development. This work presents an original methodology developed by IFP Energies Nouvelles for assessing fuel stability using two different reactors. This methodology was successfully applied to gain an in-depth understanding of the oxidation kinetics and pathways of model molecules and commercial fuels.

Abordagem Experimental original para avaliação dos transportes de combustível Estabilidade

The study of fuel oxidation stability is an important issue for the development of future fuels. Diesel and kerosene fuel systems have undergone several ...

Application and Methodology of the Non-destructive 19F Time-domain NMR Technique to Measure the Content in Fluorine-containing Drug Products

Here, we describe a protocol developed by our group that uses low-field fluorine-19 (19F) time-domain (TD) nuclear magnetic resonance (NMR) to measure the average content of fluorinated drugs in their formulated drug product forms: tablets or capsules. This method is specific to fluorinated drugs because it detects only the content of fluorine, avoiding interference from the excipients that lack fluorine. The advantages of measuring the active content of fluorinated drugs using low-field 19F TD-NMR versus high-field 19F solid-state (SS) NMR are the simplicity of the method; the low cost; and the non-destructive nature of the technique, with all samples recoverable in intact forms (e.g., powders, tablets, and capsules), making this technique affordable for any laboratory.
We have tested the method with three fluorinated drug products available on the market - cinacalcet, lansoprazole, and ciprofloxacin - with doses ranging from 15 to 500 mg. The results of the analyses, measured by low-field 19F TD-NMR, supported the reported label claims for the average drug content.
Based on the simplicity and reproducibility of the analysis, we envision this methodology being implemented in any laboratory, including manufacturing plants, as a process analytical technology (PAT) tool in the pharmaceutical industry.

Application and Methodology of the Non-destructive 19F Time-domain NMR Technique to Measure the Content in Fluorine-containing Drug Products

A simple and non-destructive technique that measures the average content of drug substances in formulated drug products containing fluorine using low-field fluorine-19 (19F) time-domain (TD) nuclear magnetic resonance (NMR) is presented here. The technique can be applied to the development and manufacturing of drugs in the pharmaceutical industry.

Aplicação e metodologia da técnica não-destrutiva 19F no domínio do tempo NMR para medir o teor em flúor-contendo produtos de droga

Here, we describe a protocol developed by our group that uses low-field fluorine-19 (19F) time-domain (TD) nuclear magnetic resonance (NMR) to measure the ...

The Effect of Interfacial Chemical Bonding in TiO2-SiO2 Composites on Their Photocatalytic NOx Abatement Performance

The chemical bonding of particulate photocatalysts to supporting material surfaces is of great importance in engineering more efficient and practical photocatalytic structures. However, the influence of such chemical bonding on the optical and surface properties of the photocatalyst and thus its photocatalytic activity/reaction selectivity behavior has not been systematically studied. In this investigation, TiO2 has been supported on the surface of SiO2 by means of two different methods: (i) by the in situ formation of TiO2 in the presence of sand quartz via a sol-gel method employing tetrabutyl orthotitanium (TBOT); and (ii) by binding the commercial TiO2 powder to quartz on a surface silica gel layer formed from the reaction of quartz with tetraethylorthosilicate (TEOS). For comparison, TiO2 nanoparticles were also deposited on the surfaces of a more reactive SiO2 prepared by a hydrolysis-controlled sol-gel technique as well as through a sol-gel route from TiO2 and SiO2 precursors. The combination of TiO2 and SiO2, through interfacial Ti-O-Si bonds, was confirmed by FTIR spectroscopy and the photocatalytic activities of the obtained composites were tested for photocatalytic degradation of NO according to the ISO standard method (ISO 22197&#8722;1). The electron microscope images of the obtained materials showed that variable photocatalyst coverage of the support surface can successfully be achieved but the photocatalytic activity towards NO removal was found to be affected by the preparation method and the nitrate selectivity is adversely affected by Ti-O-Si bonding.

The Effect of Interfacial Chemical Bonding in TiO2-SiO2 Composites on Their Photocatalytic NOx Abatement Performance

The focus of the present work is to establish means to generate and quantify levels of Ti-O-Si linkages and to correlate these with the photocatalytic properties of the supported TiO2.

O efeito da Ligação Química Interfacial em Compósitos de TiO2-SiO2 em seu Desempenho Fotocatalítico de Redução de NOx

The chemical bonding of particulate photocatalysts to supporting material surfaces is of great importance in engineering more efficient and practical ...

The Effect of Charging and Discharging Lithium Iron Phosphate-graphite Cells at Different Temperatures on Degradation

The effect of charging and discharging lithium iron phosphate-graphite cells at different temperatures on their degradation is evaluated systematically. The degradation of the cells is assessed by using 10 charging and discharging temperature permutations ranging from -20 &#176;C to 30 &#176;C. This allows an analysis of the effect of charge and discharge temperatures on aging, and their associations. A total of 100 charge/discharge cycles were carried out. Every 25 cycles a reference cycle was performed to assess the reversible and irreversible capacity degradation. A multi-factor analysis of variance was used, and the experimental results were fitted showing: i) a quadratic relationship between the rate of degradation and the temperature of charge, ii) a linear relationship with the temperature of discharge, and iii) a correlation between the temperature of charge and discharge. It was found that the temperature combination for charging at +30 &#176;C and discharging at -5 &#176;C led to the highest rate of degradation. On the other hand, the cycling in a temperature range from -20 &#176;C to 15 &#176;C (with various combinations of temperatures of charge and discharge), led to a much lower degradation. Additionally, when the temperature of charge is 15 &#176;C, it was found that the degradation rate is nondependent on the temperature of discharge.

This article describes the effect of dissimilar charging/discharging temperatures on the degradation of lithium iron phosphate-graphite pouch cells, aiming at simulating close to real case scenarios. In total, 10 temperature combinations are investigated in the range -20 to 30 &#176;C in order to analyze the impact of temperature on degradation.

O efeito de carregamento e de descarregamento de lítio ferro fosfato-grafite células em diferentes temperaturas na degradação

The effect of charging and discharging lithium iron phosphate-graphite cells at different temperatures on their degradation is evaluated systematically. ...

The Effect of Ultraviolet Radiation on the Chemical Bath Deposition of Bis(thiourea) Cadmium Chloride Crystals and the Subsequent CdS Obtention

In this work, the effects on the preparation of bis(thiourea) cadmium chloride crystals when illuminated with ultraviolet (UV) light at a wavelength of 367 nm using the chemical bath deposition technique are studied comparatively. Two experiments are performed to make a comparison: one without UV light and the other with the aid of UV light. Both experiments are performed under equal conditions, at a temperature of 343 K and with a pH of 3.2. The precursors used are cadmium chloride (CdCl2) and thiourea [CS(NH2)2], which are dissolved in 50 mL of deionized water with an acidic pH. In this experiment, the interaction of electromagnetic radiation is sought at the moment the chemical reaction is carried out. The results demonstrate the existence of an interaction between the crystals and the UV light; the UV light assistance causes crystal growths in an acicular shape. Also, the final product obtained is cadmium sulfide and shows no evident difference when synthesized with or without the use of UV light.

The Effect of Ultraviolet Radiation on the Chemical Bath Deposition of Bisthiourea Cadmium Chloride Crystals and the Subsequent CdS Obtention

This article presents a protocol for the synthesis of bis(thiourea) cadmium chloride crystals by chemical bath deposition. Two experiments are described: one aided by ultraviolet light compared to one without ultraviolet light.

O efeito da radiação ultravioleta, a deposição química de banho de cristais de cloreto de cádmio de Bis(thiourea) e a subsequente obtenção de CdS

In this work, the effects on the preparation of bis(thiourea) cadmium chloride crystals when illuminated with ultraviolet (UV) light at a wavelength of ...

Extraction of Lignin with High &#946;-O-4 Content by Mild Ethanol Extraction and Its Effect on the Depolymerization Yield

Lignin valorization strategies are a key factor for achieving more economically competitive biorefineries based on lignocellulosic biomass. Most of the emerging elegant procedures to obtain specific aromatic products rely on the lignin substrate having a high content of the readily cleavable &#946;-O-4 linkage as present in the native lignin structure. This provides a miss-match with typical technical lignins that are highly degraded and therefore are low in &#946;-O-4 linkages. Therefore, the extraction yields, and the quality of the obtained lignin are of utmost importance to access new lignin valorization pathways. In this manuscript, a simple protocol is presented to obtain lignins with high &#946;-O-4 content by relatively mild ethanol extraction that can be applied to different lignocellulose sources. Furthermore, analysis procedures to determine the quality of the lignins are presented together with a depolymerization protocol that yields specific phenolic 2-arylmethyl-1,3-dioxolanes, which can be used to evaluate the obtained lignins. The presented results demonstrate the link between lignin quality and potential for the lignins to be depolymerized into specific monomeric aromatic chemicals. Overall, the extraction and depolymerization demonstrates a trade-off between the lignin extraction yield and the retention of the native aryl-ether structure and thus the potential of the lignin to be used as the substrate for the production of chemicals for higher-value applications.

Extraction of Lignin with High &amp;#946;-O-4 Content by Mild Ethanol Extraction and Its Effect on the Depolymerization Yield

Here, we present a protocol to perform ethanol extraction of lignin from several biomass sources. The effect of the extraction conditions on the lignin yield and &#946;-O-4 content are presented. Selective depolymerization is performed on the obtained lignins to obtain high aromatic monomer products.

Extração da lignina com alto teor de β-O-4 por extração de etanol suave e seu efeito sobre o rendimento de despolimerização

Lignin valorization strategies are a key factor for achieving more economically competitive biorefineries based on lignocellulosic biomass. Most of the ...

Niobium Oxide Films Deposited by Reactive Sputtering: Effect of Oxygen Flow Rate

Reactive sputtering is a versatile technique used to form compact films with excellent homogeneity. In addition, it allows easy control over deposition parameters such as gas flow rate that results in changes on composition and thus in the film required properties. In this report, reactive sputtering is used to deposit niobium oxide films. A niobium target is used as metal source and different oxygen flow rates to deposit niobium oxide films. The oxygen flow rate was changed from 3 to 10 sccm. The films deposited under low oxygen flow rates show higher electrical conductivity and provide better perovskite solar cells when used as electron transport layer.

Here, we present a protocol for niobium oxide films deposition by reactive sputtering with different oxygen flow rates for use as an electron transport layer in perovskite solar cells.

Óxido de nióbio filmes depositados por sputtering reativa: efeito da taxa de fluxo de oxigênio

Reactive sputtering is a versatile technique used to form compact films with excellent homogeneity. In addition, it allows easy control over deposition ...