Os autores gostariam de agradecer aos membros do Laboratório de Genômica do Câncer e Biocomumia de Doenças Complexas por seus agudos insumos observacionais e sua participação em múltiplas discussões em diferentes etapas deste projeto. O apoio ao financiamento inclui a Israel Cancer Association (bolsa ICA para m.F-M 2017-2019) e a bolsa Kamin da Israel Innovation Authority (para m.F-M.).

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A coleta de sangue de um paciente em um tubo, embarque e armazenamento são etapas iniciais cruciais na biópsia líquida. O manuseio inadequado pode prejudicar a qualidade do plasma e, portanto, pode interferir nos resultados da biópsia líquida47. Se uma amostra de sangue for coletada em um tubo sanguíneo EDTA, o plasma deve ser separado dentro de duas horas de coleta de sangue para evitar a lise dos WBCs e liberar seu DNA genômico no plasma48. Os WBCs também podem so...

Os avanços tecnológicos levaram ao sequenciamento de centenas de genomas cancerígenos e transcritos1. Isso contribuiu para a compreensão das paisagens das mudanças moleculares em diferentes tipos de câncer2. Outros estudos sobre essas paisagens ajudaram a caracterizar as alterações sommáticas sequenciais e as fusões gene-gene3 que estão envolvidas na progressão do câncer ou tumor, interrompendo seriamente as vias de apoptose4. Portanto, mutações somáticas e fusões gene-gene podem fornecer informações sobre tumores servindo como biomarcadores em pacientes individuais para um determinado tumor tipo5, identificando o prognóstico de tumores primários existentes6,categorizando tumores secundários baseados em alterações moleculares7e identificando alvos tumorais drogados8. Essas informações podem facilitar na seleção do tratamento personalizado para pacientes com câncer e na determinação de respostas positivas e negativas ao tratamento9. No entanto, a obtenção de material tumoral para identificação de perfil genômico do tecido tumoral é um procedimento invasivo10. Além disso, uma biópsia tumoral compreende apenas uma pequena parte de um tumor heterogêneo; e pode, portanto, não ser representativo para o perfil molecular de todo o tumor11. O monitoramento serial e a genotipagem tumoral requerem uma coleta repetida de tecidos tumorais, o que, geralmente, não é viável devido à invasão do procedimento de biópsia tumoral e às questões de segurança decorrentes desses procedimentos12.
A técnica de biópsia líquida, por outro lado, ganhou uma tremenda atenção na oncologia de precisão na última década13,14. Deve-se principalmente à não invasiva dessa técnica, e à possibilidade de ser repetida em vários momentos, possibilitando assim uma técnica de monitoramento fácil de usar e segura para os cursos da doença15,16. A biópsia líquida é baseada em um fenômeno que as células tumorais se multiplicam rapidamente, e simultaneamente muitas delas sofrem apoptose e necrose. Isso leva à liberação de detritos celulares apoptóticos no sangue dos pacientes, juntamente com os fragmentos de DNA que são cortados em tamanhos precisos durante a apoptose17. A apoptose de células não cancerosas também leva à liberação de seus detritos celulares no sangue, no entanto, a taxa de apoptose nessas células é relativamente muito menor do que as células tumorais18. O racional da técnica de biópsia líquida é capturar moléculas associadas ao tumor, como DNA, RNA, proteínas e células tumorais14,19 que circulam continuamente no sangue. Várias técnicas20 podem ser usadas para a análise dessas moléculas, incluindo Sequenciamento de Próxima Geração (NGS), reação em cadeia de polimerase de gotícula digital (ddPCR), PCR em tempo real e ensaio imunosorbente ligado à enzima (ELISA). A técnica de biópsia líquida permite identificar biomarcadores que são características das células tumorais. Essas moléculas biomarcadores não são apenas liberadas de partes específicas de um tumor, mas sim de todas as partes do tumor21. Assim, os marcadores identificados na biópsia líquida representam o perfil molecular de todo um tumor heterogêneo, além de outros tumores no corpo, tendo vantagens sobre a técnica baseada em biópsiatecidual 22.
O cfDNA tem um curto tempo de meia-vida no sangue circulante que varia de alguns minutos a 1-2 horas23. No entanto, o curto tempo de meia-vida do CFDNA facilita análises em tempo real, avaliando a resposta ao tratamento e avaliações dinâmicas do tumor. Os níveis de CFDNA derivados do tumor indicam prognóstico do estágio/tamanho do tumor evidenciado por diversos estudos, que mostraram relação entre os níveis de CFDNA e os desfechos de sobrevivência24. Além disso, estudos comprovaram que o CFDNA tem uma melhor capacidade de previsão do que os marcadores tumorais existentes25. O prognóstico do CFDNA é ainda mais acentuado após o tratamento do câncer, níveis mais elevados de CFDNA após o tratamento correlaciona-se bem com uma taxa reduzida de sobrevivência e resistência ao tratamento. Considerando que os níveis mais baixos de CFDNA após a terapia geralmente correspondem à resposta positiva ao tratamento. Além disso, o CFDNA facilita a detecção precoce da resposta ao tratamento do que os métodos tradicionais de detecção.
O CFDNA aumenta a possibilidade de detecção precoce de mutações associadas ao câncer: durante a doença em estágio inicial15, o aparecimento dos sintomas26 e antes do diagnóstico de câncer até 2 anos27. Como o CFDNA é liberado de múltiplas regiões tumorais ou focos, sua análise fornece uma visão abrangente do genoma tumoral que representa28. Portanto, o CFDNA permite detectar mutações somáticas que podem ter sido perdidas nas amostras de tecido29. Como a heterogeneidade intra-tumoral e mutações subclonais podem ser detectadas pelo sequenciamento profundo de regiões genômicas que abrangem milhares de bases, daí a análise do CFDNA permite descobrir subtipos moleculares específicos com assinaturas genômicas distintas13. Para obter um nível semelhante de informação através da amostra de tecido muitas biópsias sólidas teriam sido necessárias.
Além disso, os níveis de CFDNA em pacientes com uma doença localizada, como câncer de cólon, ovário e pulmão após tratamento cirúrgico e/ou quimioterapia, demonstraram ser um poderoso marcador prognóstico para a recidiva do câncer e os resultados do tratamento20. Além disso, em pacientes com câncer de cólon, mama e pulmão, análises de CFNA do sangue puderam detectar com sucesso as alterações específicas do tumor, o que levou à previsão precisa de recidiva com vários meses de antecedência13. Além disso, os marcadores de resistência ao tratamento, como mutações kras em pacientes com CRC recebendo terapia anti-EGFR30; VAFs para genes como PIK3CA, MED1 ou EGFR em pacientes com câncer de mama após o tratamento com várias terapias31; e a mutação de resistência EGFR T790M em pacientes com câncer de pulmão tratada com TKIs32 direcionados ao EGFR também podem ser identificadas pela análise de CFDNA.
Em resumo, a análise cfDNA pode ser utilizada para identificar biomarcadores precisos no campo da oncologia13,33. Neste protocolo, amostras de sangue de 3 pacientes com glioma e 3 controles saudáveis foram processadas para obter DNA genômico de WBCs e CFDNA do plasma. No câncer de glioma, mutações em IDH, TERT, ATRX, EGFR e TP53 servem como diagnóstico, bem como marcadores prognósticos que podem ajudar no diagnóstico precoce de tumores glioma, classificando diferentes tipos de tumores de glioma, orientando o tratamento preciso para o paciente individual e entendendo a resposta ao tratamento34,35. O status mutacional desses genes pode ser identificado usando cfDNA derivado do sangue. Neste manuscrito, apresentamos um protocolo detalhado de CFDNA derivado do plasma que tem sido usado para estudar alterações mutacionais no câncer de glioma12. Esse protocolo de biópsia líquida baseado em CFDNA explicado neste artigo pode ser usado para estudar alterações mutacionais em muitos outros tipos de câncer. Além disso, um estudo recente mostrou que a biópsia líquida baseada em CFDNA pode detectar 50 tipos diferentes decânceres 36.
A coleta, o armazenamento e o envio de amostras de sangue são etapas cruciais neste protocolo, pois a temperatura descontrolada durante essas etapas causa lise dos WBCs, levando à liberação de DNA genômico do WBC no plasma e causando contaminação da amostra de CFDNA, que afeta o resto do procedimento37. A hemólise devido à temperatura descontrolada pode prejudicar os processos de preparação da amostra a jusante do CFDNA, como as etapas38do PCR . O soro contém uma alta proporção de cfDNA germinal em vez de plasma, embora apresente um grande ruído de fundo para cfDNA39associada ao tumor . Portanto, para isolar o CFDNA associado ao tumor, o plasma é uma amostra adequada39. O sangue extraído em um anticoagulante contendo tubo de coleta de sangue deve ser centrifutor imediatamente ou dentro de até duas horas, para separar o plasma e evitar a contaminação por CFDNA. Neste protocolo são utilizados tubos comerciais dedicados de coleta de sangue cfDNA (ver Tabela de Materiais),que são uma alternativa ao anticoagulante contendo tubos de coleta de sangue. Estes tubos dedicados de coleta de sangue preservam cfDNA e cfRNA, e previne a lise de WBCs por até 30 dias a temperatura ambiente, e até 8 dias a 37 °C. Isso facilita a manutenção da temperatura apropriada durante um carregamento de amostras de sangue e até que o plasma e o WBC sejam separados40.
Existem três tipos de metodologias de extração de CFDNA atualmente disponíveis: isolamento de fase, coluna de spin baseada em membrana de silício e isolamento à base de contasmagnéticas 41. O método da coluna spin baseada em membrana de silício rendeu uma alta quantidade de cfDNA com alta integridade em comparação com outros métodos de extração de CFDNA42.
A avaliação quantitativa do DNA é um requisito fundamental na biópsia líquida, há a necessidade de desenvolver um procedimento simples, acessível e padronizado para sua fácil implementação e amplo uso. Três métodos comumente utilizados para quantificação de CFDNA são espectrofotométrico, fluorimétrico e qPCR. O método fluorimétrico é comprovado melhor em relação aos outros métodos relativos à precisão, custo e facilidade de condução43.
A integridade e pureza do CFDNA podem ser estimadas por eletroforese agarose ou eletroforese capilar. A eletroforese agarose não mostra sensibilidade na baixa concentração de CFDNA nem tem alta resolução para mostrar o tamanho preciso do fragmento de cfDNA. Por outro lado, a eletroforese capilar tem uma vantagem sobre a eletroforese agarose, superando os desafios associados e, portanto, amplamente utilizada pelos pesquisadores para a análise do tamanho do fragmento de CFDNA. Neste protocolo, a distribuição do tamanho do fragmento do CFDNA isolado foi estimada utilizando um instrumento automatizado de eletroforese capilar (ver Tabela de Materiais).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable Clip for Priming Station</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5042-1398</td>
			<td>Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes</td>
			<td>Norgen Biotek Corp.</td>
			<td>63950</td>
			<td>Norgen&#39;s cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip Priming Station</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5065-4401</td>
			<td>Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit&#8212; used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Cleaner Kit</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>5065-9951</td>
			<td>Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for Gel Matrix</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc.</td>
			<td>185-5990</td>
			<td>Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA Basic Chip Vortex</td>
			<td>IKA-Werke GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>MS-3-S36</td>
			<td>Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740952.5</td>
			<td>With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells 
			(e.g., bacteria), and many other sources.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp circulating nucleic acid kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac 24 Plus vacuum manifold</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19413</td>
			<td>The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAvac Connecting System</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19419</td>
			<td>In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assay tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td>Qubit assay tubes are 500 &#181;L thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/&#181;L to 100 ng/&#181;L.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>84010</td>
			<td>used for vacuum processing of QIAGEN columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crushed ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (96&#8211;100%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block or similar at 56 &#176;C (capable of holding 2 ml collection tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (100%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (adjustable)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of cell-free dna in blood plasma samples of cancer patients

Identificar mutações em tumores de pacientes com câncer é um passo muito importante no manejo da doença. Essas mutações servem como biomarcadores para o diagnóstico de tumor, bem como para a seleção do tratamento e sua resposta em pacientes com câncer. O método padrão-ouro atual para detectar mutações tumorais envolve um teste genético do DNA tumoral por meio de biópsias tumorais. No entanto, este método invasivo é difícil de ser realizado repetidamente como um teste de acompanhamento do repertório mutacional tumoral. A biópsia líquida é uma técnica nova e emergente para detectar mutações tumorais como uma abordagem de biópsia fácil de usar e não invasiva.
As células cancerígenas se multiplicam rapidamente. Paralelamente, inúmeras células cancerígenas sofrem apoptose. Detritos dessas células são liberados no sistema circulatório de um paciente, juntamente com pedaços de DNA finamente fragmentados, chamados fragmentos de DNA livre de células (CFDNA), que carregam mutações de DNA tumoral. Portanto, para identificar biomarcadores à base de CFDNA utilizando a técnica de biópsia líquida, amostras de sangue são coletadas dos pacientes com câncer, seguidas pela separação de plasma e casaco buffy. Em seguida, o plasma é processado para o isolamento do CFDNA, e o respectivo casaco buffy é processado para o isolamento do DNA genômico de um paciente. Ambas as amostras de ácido nucleico são então verificadas quanto à sua quantidade e qualidade; e analisado para mutações usando técnicas de sequenciamento de última geração (NGS).
Neste manuscrito, apresentamos um protocolo detalhado para biópsia líquida, incluindo coleta de sangue, plasma e separação de casacos buffy, extração de DNA cfDNA e germinal, quantificação de DNA cfDNA ou germinal, e análise de enriquecimento de fragmentos cfDNA.

Separação plasmática O sangue de 8,5-9 mL coletado em tubos de conservação cfDNA ou cfRNA produz cerca de ~4 mL de plasma em volume. O volume de plasma separado do sangue coletado nos tubos EDTA pode variar dependendo da temperatura. A exposição de tubos EDTA contendo sangue a uma temperatura superior a 37 °C leva à diminuição do volume de plasma44.
Resultados do ensaio do ensaio do fluorômetro a concentração de CFDN...

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Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Neste artigo apresentamos um protocolo detalhado para a técnica de biópsia líquida não invasiva, incluindo coleta de sangue, separação de plasma e casaco buffy, extração de DNA cfDNA e germinal, quantificação de DNA cfDNA ou germinal, e análise de enriquecimento de fragmentos cfDNA.

Detecção de DNA livre de células em amostras de plasma de sangue de pacientes com câncer

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

detection-of-cell-free-dna-in-blood-plasma-samples-of-cancer-patients

Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.8K visualizações.  Bar-Ilan University. Neste artigo apresentamos um protocolo detalhado para a técnica de biópsia líquida não invasiva, incluindo coleta de sangue, separação de plasma e casaco buffy, extração de DNA cfDNA e germinal, quantificação de DNA cfDNA ou germinal, e análise de enriquecimento de fragmentos cfDNA.

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Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of cancer, few studies have focused on the potential use of urine cell-free (UCF) DNA. Starting from the hypotheses that normal apoptotic cells produce highly fragmented DNA and that cancer cells release longer DNA, the potential role of UCF DNA integrity was evaluated as an early diagnostic marker capable of distinguishing between patients with prostate or bladder cancer and healthy individuals.
A UCF DNA integrity analysis is proposed on the basis of four quantitative real-time PCRs of four sequences longer than 250 bp: c-MYC, BCAS1, HER2, and AR. Sequences that frequently have an increased DNA copy number in bladder and prostate cancers were chosen for the analysis, but the method is flexible, and these genes could be substituted with other genes of interest. The potential utility of UCF DNA as a source of biomarkers has already been demonstrated for urologic malignancies, thus paving the way for further studies on UCF DNA characterization. The UCF DNA integrity test has the advantage of being non-invasive, rapid, and easy to perform, with only a few milliliters of urine needed to carry out the analysis.

A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

Análise integridade do DNA de células-Free em amostras de urina

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

Pesquisa do câncer

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, and prediction of treatment resistance. Starting from the hypothesis that androgen receptor (AR) gene copy number (CN) gain is a frequent event in metastatic castration resistance prostate cancer (mCRPC), we propose to analyze this event in cfDNA as a potential predictive biomarker.
We evaluated AR CN in cfDNA using 2 different real-time PCR assays and 2 reference genes (RNaseP and AGO1). DNA amount of 60 ng was used for each assay combination. AR CN gain was confirmed using Digital PCR as a more accurate method. CN variation analysis has already been demonstrated to be informative for the prediction of treatment resistance in the setting of mCRPC, but it could be useful also for other purposes in different patient settings. CN analysis on cfDNA has several advantages: it is non-invasive, rapid and easy to perform, and it starts from a small volume of serum or plasma material.

This manuscript describes the copy number variation analysis performed in serum or plasma DNA using real-time PCR approach. This method is suitable for the prediction of drug resistance in castration resistant prostate cancer patients, but it could be informative also for other diseases.

Soro e Plasma cópia número deteção usando PCR em tempo real

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer (NSCLC). Testing for PD-L1 expression with the PD-L1 immunohistochemistry (IHC) 22C3 companion diagnostic assay, which gives a tumor proportion score (TPS), has been validated on tumor tissue. We developed an optimized laboratory-developed test (LDT) that uses the 22C3 antibody (Ab) concentrate on a widely available IHC autostainer for biopsy and cytology specimens. The PD-L1 TPS was evaluated with 120 paired whole-tumor tissue sections and biopsy samples and with 70 paired biopsy and cytology samples (bronchial washes, n = 40; pleural effusions, n = 30). The 22C3 Ab concentrate-based LDT showed a high concordance rate between biopsy (~100%) and cytology (~95%) specimens when compared to PD-L1 IHC expression determined using the PD-L1 IHC 22C3 companion assay at both TPS cut points (&#8805;1%, &#8805;50%). The optimized LDT presented here, using the 22C3 Ab concentrate to determine the PD-L1 expression in both tumor tissue and in cytology specimens, will expand the ability of laboratories worldwide to assess the eligibility of patients with NSCLC for treatment with pembrolizumab monotherapy in a reliable and reproducible manner.

To expand the ability of laboratories worldwide to assess the eligibility of patients with lung cancer for treatment with pembrolizumab, in a reliable and reproducible manner, we developed an assay that uses the 22C3 antibody concentrate on a widely available immunohistochemical autostainer, for both biopsy and cytology specimens.

Usando 22 3 anticorpo Anti-PD-L1 concentrar-se na biópsia e citologia amostras de pacientes de câncer de pulmão não-pequenas células

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, a small population of cells does not respond to TKI treatment, resulting in minimal residual disease (MRD); even the most potent TKIs fail to eradicate these cells. These MRD cells serve as a reservoir to develop resistance to therapy. Why TKI treatment is ineffective against MRD cells is not known. Growth factor signaling is implicated in supporting the survival of MRD cells during TKI treatment, but a mechanistic understanding is lacking. Recent studies demonstrated that an elevated c-Fos and Dusp1 expression as a result of convergent oncogenic and growth factor signaling in MRD cells mediate TKI resistance. The genetic and chemical inhibition of c-Fos and Dusp1 renders CML exquisitely sensitive to TKIs and cures CML in both genetic and humanized mouse models. We identified these target genes using multiple microarrays from TKI-sensitive and -resistant cells. Here, we provide methods for target validation using in vitro and in vivo mouse models. These methods can easily be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

Here, we describe protocols for the genetic and chemical validation of c-Fos and Dusp1 as a drug target in leukemia using in vitro and in vivo genetic and humanized mouse models. This method can be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

Métodos para avaliar o papel de c-Fos e Dusp1 em dependência do Oncogene

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful biomarkers for clinical practice. Here, we present a protocol to extract, reverse transcribe and evaluate the expression levels of circulating miRNAs from plasma samples of patients with colorectal cancer (CRC). microRNAs (miRNAs) are a class of non-coding RNAs of 18-25 nucleotides in length that regulate the expression of target genes at the translational level and play an important role, including that of pro- and anti-angiogenic function, in the physiopathology of various organs. miRNAs are stable in biological fluids such as serum and plasma, which renders them ideal circulating biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and treatment decision-making and monitoring. Circulating miRNA extraction was performed using a rapid and effective method that involves both organic and column-based methodologies. For miRNA retrotranscription, we used a multi-step procedure that considers polyadenylation at 3&#39; and the ligation of an adapter at 5&#39; of the mature miRNAs, followed by random miRNA pre-amplification. We selected a 24-miRNA custom panel to be tested by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and spotted the miRNA probes on array custom plates. We performed qRT-PCR plate runs on a real-time PCR System. Housekeeping miRNAs for normalization were selected using GeNorm software (v. 3.2). Data were analyzed using Expression suite software (v 1.1) and statistical analyses were performed. The method proved to be reliable and technically robust and could be useful to evaluate biomarker levels in liquid samples such as plasma and/or serum.

We present a protocol to evaluate the expression levels of circulating microRNA (miRNAs) in plasma samples from cancer patients. In particular, we used a commercially available kit for circulating miRNA extraction and reverse transcription. Finally, we analyzed a panel of 24 selected miRNAs using real-time pre-spotted probe custom plates.

Deteção de um painel personalizado de MicroRNA circulantes em pacientes com câncer colorretal metastático

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a reliable probability of the presence of pre-neoplastic or neoplastic colorectal lesions. This method, called fluorescence long DNA (FL-DNA), is a fast, non-invasive procedure that is an improvement upon the primary prevention system. This method is based on evaluation of fecal DNA integrity by quantitative amplification of specific targets of genomic DNA. In particular, the evaluation of DNA fragments longer than 200 bp allows for detection of patients with colorectal lesions with very high specificity. However, this system and all currently available stool DNA tests present some general issues that need to be addressed (e.g., the frequency at which tests should be carried out and optimal number of stool samples collected at each timepoint for each individual). However, the main advantage of FL-DNA is the possibility to use it in association with a test currently used in the CRC screening program, known as the immunochemical-based fecal occult blood test (iFOBT). Indeed, both tests can be performed on the same sample, reducing costs and achieving a better prediction of the eventual presence of colorectal lesions.

The presented diagnostic FL-DNA kit is a time-saving and user-friendly method to determine the reliable probability of the presence of colorectal cancer lesions.

Avaliação do Risco e Prevalência de Câncer Colorretal por Detecção de Integridade do DNA das fezes

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from healthy mice as well as mice with AML driven by MLL-AF9. Specifically, we describe a two-step cell staining process, whereby healthy or leukemia BM cells are first stained with a fluorogenic dye that detects mitochondrial superoxides, followed by staining with fluorochrome-linked monoclonal antibodies that are used to distinguish various healthy and malignant hematopoietic progenitor populations. We also provide a strategy for acquiring and analyzing the samples by flow cytometry. The entire protocol can be carried out in a timeframe as short as 3-4 h. We also highlight the key variables to consider as well as the advantages and limitations of monitoring ROS production in the mitochondrial compartment of live hematopoietic and leukemia stem and progenitor subpopulations using fluorogenic dyes by flow cytometry. Furthermore, we present data that mitochondrial ROS abundance varies among distinct healthy HSPC sub-populations and leukemia progenitors and discuss the possible applications of this technique in hematologic research.

We describe a method for using multiparameter flow cytometry to detect mitochondrial reactive oxygen species (ROS) in murine healthy hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and leukemia cells from a mouse model of acute myeloid leukemia (AML) driven by MLL-AF9.

Análise Citométrica de fluxo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial em células tronco e progenitoras hematopoiéticas Murinas e leucemia acionada por MLL-AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

Deteção e monitoração do ADN de circulação associado do tumor em Biofluids pacientes

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Simple and Fast Rolling Circle Amplification-Based Detection of Topoisomerase 1 Activity in Crude Biological Samples

Isothermal amplification-based techniques such as the rolling circle amplification have been successfully employed for the detection of nucleic acids, protein amounts, or other relevant molecules. These methods have shown to be substantial alternatives to PCR or ELISA for clinical and research applications. Moreover, the detection of protein amount (by Western blot or immunohistochemistry) is often insufficient to provide information for cancer diagnosis, whereas the measurement of enzyme activity represents a valuable biomarker. Measurement of enzyme activity also allows for the diagnosis and potential treatment of pathogen-borne diseases. In all eukaryotes, topoisomerases are the key DNA-binding enzymes involved in the control of the DNA topological state during important cellular processes and are among the important biomarkers for cancer prognosis and treatment.
Over the years, topoisomerases have been substantially investigated as a potential target of antiparasitic and anticancer drugs with libraries of natural and synthetic small-molecule compounds that are investigated every year. Here, the rolling circle amplification method, termed rolling circle enhanced enzyme activity detection (REEAD) assay that allows for the quantitative measurement of topoisomerase 1 (TOP1) activity in a simple, fast, and gel-free manner is presented.By cleaving and ligating a specially designed DNA substrate, TOP1 converts a DNA oligonucleotide into a closed circle, which becomes the template for rolling circle amplification, yielding ~103 tandem repeat rolling circle products. Depending on the nucleotide incorporation during the amplification, there is the possibility of different readout methods, from fluorescence to chemiluminescence to colorimetric. As each TOP1-mediated cleavage-ligation generates one closed DNA circle, the assay is highly sensitive and directly quantitative.

A protocol for the sensitive and quantitative detection of topoisomerase 1 activity using the rolling circle enhanced enzyme activity detection assay is described. The method allows detection of topoisomerase 1 activity from purified components or cell/tissue extracts. This protocol has wide-ranging applications in any field involving detection of enzymatic activity.

Detecção Simples e Rápida de Amplificação por Círculo de Rolamento da Atividade da Topoisomerase 1 em Amostras Biológicas Brutas

Isothermal amplification-based techniques such as the rolling circle amplification have been successfully employed for the detection of nucleic acids, ...

Diagnóstico de linfoma vitreorretiniano usando DNA livre de células

Cell-Free DNA Extraction of Vitreous and Aqueous Humor Specimens for Diagnosis and Monitoring of Vitreoretinal Lymphoma

Vitreoretinal lymphoma (VRL) represents an aggressive lymphoma, often categorized as primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma. To diagnose VRL, specimens such as vitreous humor and, more recently, aqueous humor are collected. Diagnostic testing for VRL on these specimens includes cytology, flow cytometry, and molecular testing. However, both cytopathology and flow cytometry, along with molecular testing using cellular DNA, necessitate intact whole cells. The challenge lies in the fact that vitreous and aqueous humor typically have low cellularity, and many cells get destroyed during collection, storage, and processing. Moreover, these specimens pose additional difficulties for molecular testing due to the high viscosity of vitreous humor and the low volume of both vitreous and aqueous humor. This study proposes a method for extracting cell-free DNA from vitreous and aqueous specimens. This approach complements the extraction of cellular DNA or allows the cellular component of these specimens to be utilized for other diagnostic methods, including cytology and flow cytometry.

Autor em destaque: Avançando no diagnóstico de VRL usando extração de DNA livre de células do humor vítreo 

A procedure to extract cell-free DNA from vitreous and aqueous humor to perform molecular studies for diagnosing vitreoretinal lymphoma is established here. The method offers the ability to concurrently extract DNA from the cellular component of the sample or to reserve it for ancillary testing.

Extração de DNA livre de células de espécimes de humor vítreo e aquoso para diagnóstico e monitoramento de linfoma vitreorretiniano

Vitreoretinal lymphoma (VRL) represents an aggressive lymphoma, often categorized as primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma. To ...