Esta pesquisa foi apoiada por uma concessão do NIH: R21AG042066. Gostaríamos de agradecer a Philip Schulz por suas contribuições na criação de vídeos de captura de tela.

1. Produção Phage <ol><li> Execute todos os processos de produção de fagos e bioprospecção em uma cabine de segurança biológica. Produzir partículas de fagos das diferentes bibliotecas (bibliotecas Tomlinson I e J e folhas de bibliotecas 21) para o processo de bioprospecção usando as instruções do fabricante (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf). NOTA: Nós usamos várias bibliotecas em nosso processo de panning para aumentar a diversidade dos anticorpos disponíveis. </li><li> Em resumo, as bactérias de cultura de existências das três bibliotecas em 200 ml de YT 2 × contendo glicose a 1% e 100 ug / ml de ampicilina, num agitador a 37 ° C até DO600 de 0,4. </li><li> Adiciona-se 8 x 10 11 de fago auxiliar KM13 a 200 ml de bibliotecas Tomlinson I e J e 8 x 10 11 de fago auxiliar VCSM13 para 200 ml da biblioteca Sheets. Incubar as amostras da biblioteca com o fago auxiliar, durante 30 min a 37 ° C sem agitação. </li><li> Centrifugar aculturas a 3000 xg durante 10 min e ressuspender o sedimento de células em 200 ml de YT 2 × com 0,1% de glucose, 100 ug / ml de ampicilina e 50 ug / ml de canamicina. </li><li> Incubam-se as culturas de O / N a 30 ° C com agitação e, em seguida girar durante 30 min a 3300 xg o dia seguinte. </li><li> Adicionam-se 50 ml de polietileno glicol (PEG) 8000 em 2,5 M de NaCl para 200 ml de sobrenadante a partir de cada uma das bibliotecas e incubar em gelo durante 1 hr. Após precipitação com PEG, girar as soluções de novo durante 30 min a 3.300 x g. </li><li> Adicionar 1-2 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para o sedimento de células (dependendo do tamanho do grânulo) e transferência para tubos de microcentrífuga. </li><li> Incubar partículas de fago em gelo durante 1 hr a 37 ° C com mistura ocasional antes da centrifugação durante 10 min a 11.600 x g. Recolhe-se o sobrenadante e armazenar a -80 ° C. </li><li> Antes da congelação, transferir um pequeno volume das partículas de fago a partir de três bibliotecas para um outro tubo de microcentrífuga e titular cada bibliotecaindividualmente usando células TG1 para determinar a concentração. Abaixo está uma descrição do processo de titulação para uma biblioteca. <ol><li> Cultivar células TG1 de OD 600 de 0,4. Adicionar 990 ul de PBS para 6 tubos de microcentrífuga. </li><li> Para o primeiro tubo de adicionar 10 ul de partículas fágicas. Após a mistura, retire 10 ul de um tubo e adicionar ao tubo 2. Repita este passo para os restantes 4 tubos. </li><li> Adicionar 200 ul de células TG1 de 6 tubos e adicionar 10 ul de cada uma das seis diluições de fagos para esses tubos. Permitir que as partículas de fago para infectar durante 30 min sem agitação a 37 ° C. </li><li> Placa de 100 ul das células Unto Luria-Bertani de ágar placas com 100 ug / ml de ampicilina (LBA). Incubar O / N a 37 ° C e, em seguida, determinar a pfu / mL, utilizando o número de colónias visíveis. </li></ol></li></ol> 2. Negative Processo bioprospecção Nota: Evite muitos degelo congelamento dos fagos em todo o processo de bioprospecção. Identidadeeally, o melhor é realizar o maior número de etapas panning negativos quanto possível em um dia. Após a conclusão das rodadas de panning negativo ou positivo contra cada alvo é importante para salvar alguns dos fagos em caso de contaminação em qualquer etapa. <ol><li> 12 rodadas de Panning negativa contra albumina sérica bovina (BSA) <ol><li> Adicionar 4 ml de / ml de solução de BSA a 1 mg em PBS a 12 imunotubos e incubar O / N a 4 ° C. </li><li> Combinar 1 x 10 12 partículas de fago a partir de cada uma das três bibliotecas (reservar uma pequena quantidade desta mistura de fagos para verificação futura do processo de panning negativo). </li><li> Descartar a solução de BSA a partir do primeiro tubo e o tubo de lavar 2-3 vezes com PBS para remover toda a BSA não ligado. </li><li> Adicionar as bibliotecas de fago combinados para este primeiro tubo, incubar durante 30 min à temperatura ambiente no rotor e recolher os fagos não ligados. </li><li> Repita o passo 2.1.3 com o segundo imunotubo e adicione o fago coletadas a partir do passo 2.1.4 do presente immunotube. Repita o passo 2.1.4. </li><li> Repetir passos 2.1.3-2.1.4 com os restantes 10 tubos de solução de BSA e o fago não ligado recolhidas após cada incubação. </li><li> Para verificar a remoção de todos os ligantes BSA fagos usar AFM. Adicionar 10 ul de fago a partir do passo 2.1.2 e 10 ul de fago remanescente após o passo 2.1.7 separadamente a 10 ug / ml de BSA ligadas a mica clivada. Uma versão resumida do processo AFM é descrito na secção 8. </li><li> É importante para salvar uma pequena quantidade de fago depois de terminar as inúmeras rodadas de panning negativa contra cada alvo para verificar o sucesso do processo de filtração. </li></ol></li><li> 10 rodadas de Panning negativo contra diversas formas de alfa-sinucleína NOTA: Neste projeto, nós queremos remover fago que poderia ligar outras formas agregadas de proteínas como a alfa-sinucleína (monômero, dímero, trímero, etc.) e por isso vamos eliminar qualquer um destes fagos (o objetivo é eliminar o maior muitos fagos de reação cruzada possível). Permitir purificada alfa-sinucleína agregar por pelo menos 7 dias, para que ambas as formas monoméricas e oligoméricas estão presentes para panning negativo. <ol><li> Prepare 4 imunotubos com 500 ug / ml de agregado de alfa-sinucleína em PBS e 4 imunotubos com 100 ug / ml de agregado de alfa-sinucleína e incubar O / N a 4 ° C. </li><li> Descartar a solução de um dos tubos, com 500 ug / ml de agregado de alfa-sinucleína, lava-se com PBS e adicionar a biblioteca de fagos recolhida após 12 ciclos de panning negativo com BSA. </li><li> Incubar o tubo durante 30 minutos à temperatura ambiente no rotor e recolher os fagos não ligados. </li><li> Repita os passos 2.2.3 e 2.2.4 para os restantes tubos com 500 ug / ml de agregado de alfa-sinucleína e, em seguida, os tubos com 100 ug / ml de agregado de alfa-sinucleína usando o fago não ligado de cada vez recolhidos após o passo 2.2.4. </li><li> Repetir o passo 2.1.8 utilizando o fago após a primeira de deslizamento negativo contra 500 ng / ml de alfa agregada-sinuclea e os fagos após a oitava rodada de panning negativa contra 100 mg / ml de alfa-sinucleína. </li><li> Para eliminar todos os fichários negativas contra alfa-sinucleína preparar dois imunotubos extras com 500 ng / ml de agregado alfa-sinucleína e repita os passos 2.2.2-2.2.4. </li></ol></li><li> 10 rodadas de Panning negativa contra saudável Cérebro humano homogeneizado de tecido <ol><li> Adicionar tampão 1x Sten (50 mM de Tris (pH 7,6), NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, 0,2% de NP-40, 0,2% de BSA, PMSF 20 mM e cocktail inibidor de protease) para o tecido cerebral humano 28. Homogeneíza-se a 24.000 rpm durante 1 min, as amostras de centrifugação a 3.000 rpm e recolher o sobrenadante. </li><li> Preparar dois imunotubos com 2 ml de 50 ug / ml de tecido de cérebro humano em PBS e 8 imunotubos com 10 ug / ml de tecido de cérebro humano e incubar O / N a 4 ° C. </li><li> Repetir passos 2.2.3-2.2.5 primeiro com os tubos contendo 50 ug / ml de tecido de cérebro humano e, em seguida, com os que contêm 10 ug / ml de b humanotecido chuva usando o fago não ligado recolhidas após a panning negativa contra alfa-sinucleína. </li><li> Repetir o passo 2.1.8 utilizando o fago após a primeira de deslizamento negativo contra 50 ng / ml de tecido de cérebro humano e o fago após o décimo ciclo de prospecção negativa contra o tecido do cérebro humano. </li></ol></li><li> 8 rodadas de Panning negativa contra Saudável imunoprecipitou TDP-43 <ol><li> Imunoprecipitam saudável proteína TDP-43 a partir de tecido do cérebro humano saudável utilizando o protocolo descrito na secção 9. Devido à menor quantidade de proteína imunoprecipitado, realizar estas rodadas de panning negativo usando mica. </li><li> Cleave oito superfícies mica. </li><li> Para o primeiro mica adicionar ~ 100 uL de 5 ug / ml de proteína imunoprecipitada e incubar durante 5-10 min à temperatura ambiente. </li><li> Lava-se a mica 5 vezes com PBS com 0,1% de Tween 20 (PBST). </li><li> Adicionar 100 l ~ do fago após a filtração negativa contra o tecido saudável do cérebro e incubar durante 5-10 min aRT. </li><li> No meio do caminho de incubação da etapa 2.4.5, realizar o passo 2.4.3 usando o segundo mica. </li><li> Recolhe-se o fago a partir do passo 2.4.5 e lava-se a mica 5 vezes com PBST 0,1%. </li><li> Lave mica do passo 2.4.6 e adicione o fago de 2.4.7. </li><li> Repita os passos 2.4.4 a 2.4.9 até o fago é criticado negativamente contra todos os oito mica com a proteína imunoprecipitou. Repita o passo 2.1.7 usando o fago após o primeiro e oito ciclo de prospecção negativo. </li></ol></li><li> 2 Rounds de Panning negativa contra FTD imunoprecipitou TDP-43 <ol><li> Imunoprecipitam TDP-43 proteína do cérebro de indivíduos com FTD. </li><li> Cleave 2 superfícies mica. </li><li> Adicionar 50 ul de 10 ug / ml de FTD TDP-43 para uma de mica. Incubar durante 5 min à TA. </li><li> Lava-se a mica 5 vezes com PBST 0,1%. </li><li> Adicionar 50 ul do fago coletadas após panning negativa contra saudável TDP-43. Incubar durante 5 min. </li><li> Recolha os fagos não ligados. </li><li> Repeats passos 2.5.3 a 2.5.6 com o segundo mica e o fago não ligado coletadas em 2.5.6. </li></ol></li></ol> 3. Positivo Panning contra imunoprecipitou TDP-43 a partir de indivíduos com ALS <ol><li> Imunoprecipitado proteína TDP-43 a partir de cérebros de indivíduos com ELA. Cleave 3 superfícies mica. Adicionar 50 ul de 10 ug / ml de ALS TDP-43 para uma de mica. Incubar durante 5 min à TA. Lava-se a mica 5 vezes com PBST 0,1%. </li><li> Adicionar 50 ul do fago coletadas após panning negativa contra saudável TDP-43 para a mica. Incubar durante 5 min. </li><li> Recolha os fagos não ligados. Também recolher os fagos ligados utilizando três métodos de eluição. É importante manter todos os fagos recolhidos nestes passos panning separadas. <ol><li> Em primeiro lugar, adicionar 50 ul de tripsina (1 mg / ml em PBS) a cada um de mica e incubar durante não mais do que 10 min. Recolhe a solução e salvar. Em seguida, adicionar 50 ul de trietilamina 100 mM (TEA) para cada mica e incubar durante não mais do que 10 min. Collect a solução, adicionar um volume igual de 1 M de Tris-HCl, pH 7,4, e guardar. </li><li> Em terceiro lugar, adicionar 50 ul de TG1 em OD 600 de 0,4 directamente para o mica e incubar durante 30 min a 37 ° C. Também adicionar os fagos obtidos pelos dois métodos de eluição em 3.3.1 a 100 ul de TG1 em OD 600 de 0,4 e incubar durante 30 min a 37 ° C. </li></ol></li><li> Repita os passos 3.1 com um segundo mica. </li><li> Leve o fago não ligado coletadas em 3.3.2. usando a primeira mica com ALS TDP-43 e adicioná-lo ao segundo mica com ALS TDP-43. Incubar durante 5 min. </li><li> Repita todas as etapas em 3.3 para esses segundo conjuntos de mica. </li><li> Combina-se as células TG1 infectadas com os fagos eluídos com tripsina a partir dos dois ALS TDP-43 mica e placa em placas de LBA. Repetir o mesmo processo para a TEA e TG1 fagos eluídos a partir dos dois ALS TDP-43 mica para um total de três placas. NOTA: Devido ao envolvimento da TDP-43 em ambos ALS e FTD, alguns dos clones isolados naduas rodadas de panning positivo contra ALS TDP-43 pode ser específico para essa meta, mas alguns podem também ligar FTD. Para melhor isolar ALS clones específicos, tomar o fago não ligado coletadas após duas rodadas de panning negativa contra FTD TDP-43 (uma vez que estes dois ciclos de panning negativo deve ter removido qualquer alvo que é reactivo a FTD TDP-43) e utilizar estes fagos em mais um ciclo de prospecção positivo contra o antígeno ALS TDP-43 em mica (preparar o ALS TDP-43 mica, como descrito acima, em 3,3 e 3,4). </li><li> Repita todas as etapas em 3.3 com este terceiro mica ALS e placa das células TG1 infectados nas três placas LBA O / N a 37 ° C. No dia seguinte, contar o número de colônias nas 6 placas LBA com os potenciais clones ALS. Deveria haver menos colônias nas três placas LBA com os potenciais clones ALS após o terceiro ciclo de prospecção positiva em comparação com os três placas LBA após as duas rodadas de panning positivo. </li></ol> 4. A cultura e Phage Produtoion de potenciais clones positivos contra ALS Específico TDP-43 <ol><li> Cresça cada colónia a partir das 6 placas em placas de 96 poços contendo 100 ul de 2xYT com glicose a 1% e 100 ug / ml de ampicilina, num agitador a 37 ° CO / N. </li><li> A próxima transferência dia 10 ul dos poços contendo os clones das 3 placas de LBA depois da terceira ronda de separação positiva com a proteína ALS TDP-43 para tubos de microcentrífuga contendo 1 ml de YT 2 × com 1% de glucose e 100 ug / ml de ampicilina . </li><li> Adicionar glicerol a todas as culturas em placas de 96 poços a uma concentração final de 15% e congelamento das placas a -80 ° C. Permitir que as culturas de 1 ml a crescer durante 2-3 horas com agitação a 37 ° C. </li><li> Adicionar 10 9 de fago auxiliar KM13 e permitir que o fago auxiliar para infectar durante 1 hora a 37 ° C com agitação. Centrifugar as células durante 10 min a 3000 xg, descartar o sobrenadante e adicionar 1 ml de 2xYT com 0,1% de glucose, 100 ug / ml de ampicilina e 50 ug / ml de Kanamycin. </li><li> Cultura das células O / N a 30 ° C com agitação. Centrifugar os tubos a 3300 x g durante 30 minutos, transferir o sobrenadante para novos tubos de microcentrifuga e adicionar 250 uL de PEG / NaCl para cada tubo. </li><li> Incubar os tubos em gelo durante 1 h. Centrifugar os tubos novamente em 3300 xg durante 30 minutos, rejeitar o sobrenadante e adicionar 100 ul de PBS a cada tubo. </li><li> Incubar os tubos em gelo durante 1 h. Girar os tubos durante 10 minutos a 11.600 xg, e transferir o sobrenadante para tubos novos. Armazenar os fagos a -80 ° C. </li></ol> 5. Seqüenciamento do potencial Clones ALS <ol><li> Repetir o passo 4.2 e permitir a culturas a crescer O / N a 37 ° C com agitação. No dia seguinte realizar preps de plasmídeo DNA dos clones de acordo com as instruções do fabricante. Sequenciar os clones usando o apropriado para a frente e primers reverter. </li></ol> 6. Triagem potenciais clones positivos contra ALS TDP-43 Usando ELISA indireta Specific <ol><li> Adicionar 100 ul de 2,5 ug / ml de ALS, FTD e o tecido cerebral humano saudável para os poços de uma placa de ELISA de alta ligação para cada potencial clone de ALS. Incubar as placas a 37 ° C durante 1 h, com agitação lenta. </li><li> Lavar as placas 3 vezes com PBST 0,1%. Adicionar 200 ul de 2% de leite em pó em PBS para o poço e incubar as placas a 37 ° C durante 1 h, com agitação lenta. </li><li> Repetir o passo de lavagem e, em seguida, adicionar 100 ul de cada fago diluído, pelo menos, 1/100 em PBS aos poços. Após a incubação e passos de lavagem, adicionar 100 ul de 1 / 1.000 de anti-M13 HRP a cada poço. Lavam-se as placas e visualizar usando o kit de quimioluminescência do substrato femto ELISA. </li></ol> 7. scFv Produção e rastreio utilizando ELISA Indireto <ol><li> Crescer HB 2151 células para DO600 de 0,4. Adiciona-se 5 ul dos diferentes fagos de 20 ul das células HB 2151. Permitir que os fagos para infectar 30 min a 37 ° C sem agitação. Divida placas LBA nas redes de modoque cerca de 20 clones podem ser semeadas em cada. </li><li> Junte 5-10 ul de cada fago bactérias infectadas para a placa e incubar O / N a 37 ° C. No dia seguinte, adicionar colónias individuais de 1 ml de 2xYT com 0,1% de glucose e 100 ug / ml de ampicilina e agitar a 37 ° C durante 3-4 horas até DO600 é igual a 0,6. </li><li> Adicionar 1 ml de 1 M de isopropiltiogalactósido (IPTG) a cada tubo e incubar O / N a 30 ° C com agitação. Girar os tubos a 11.600 xg durante 10 min e colher o sobrenadante para o ensaio de ELISA. </li><li> Para o teste ELISA seguir os mesmos procedimentos no Capítulo 6, exceto em vez de fagos em 6,5 adicionar o scFv não diluída e para 6,6 adicione 100 ml de 1 / 1.000 9E10 HRP. </li></ol> 8. Processo AFM <ol><li> Adicionar 10-20 uL do antigénio alvo para a mica clivada e incubar durante 5-10 min. Lava-se a mica 5 vezes com água. Adicionar 10-20 uL dos fagos para o mica e incubar durante 5-10 min. </li><li> Lava-se a mica 5 vezes wi novamenteth água e permitem que a mica para o ar seco. Visualize fago ligação usando AFM 1. Execute o processo de imagem AFM usando o modo tocando AFM com um controlador Nanoscope IIIa ao ar a RT 29. As sondas AFM silício tem uma freqüência de ressonância de 300 kHz e uma constante de 40 N / m primavera. Use uma velocidade de varredura de 3,05 Hz e uma resolução de digitalização de 512 amostras / linha. </li><li> Processar as imagens por achatamento de base do fundo para assegurar que todos os tamanhos de partícula são comparáveis ​​dentro de cada imagem. Width fagos (não comprimento) pode variar de imagem para imagem devido a outros tamanhos de partículas e área de digitalização, mas nunca irá comprometer a precisão da existência ou não de fago se liga ao antígeno. </li><li> Se durante a verificação da AFM para cada conjunto de fagos panning negativos são visíveis na mica, realizar rodadas de adição até que não fagos são detectados antes de prosseguir para o próximo conjunto de panning negativo. </li></ol> 9. Immunoprecipitation do Target Antigen <ol><li> Ao isolae o antígeno alvo (TDP-43), adicione 250 g de tecido homogeneizar cérebro (do córtex motor), 100 l de 1/100 diluição do anti-TDP 43 anticorpo policlonal e 1x STEN buffer para volume total de 700 mL de uma Eppendorf tubo 28. </li><li> Incubar O / N a 4 ° C num rotor. Lavagem A / G agarose com o tampão 1x Sten 2-3 vezes e adicionar 25 ml à mistura de tecido. Incubar a 4 ° C durante 1,5 horas num agitador rotativo e depois centrifugar a 2.000-4.000 rpm durante 1 min. </li><li> Remover o sobrenadante e lavar o sedimento uma vez com tampão 1x Sten e 5 vezes com PBS. Adicionar 40-60 uL de tampão 1x Sten ao sedimento e ferver durante 5 min. Depois que as amostras são legais, centrífuga e recolher o sobrenadante. Use de SDS-PAGE e transferência de Western para verificar o sucesso do processo de imunoprecipitação 30. </li></ol> 10. Análise Dot Blot <ol><li> Cortar papel de nitrocelulose em pequenos retângulos para cada clone, que será testado. Dot 2 ul de ALS, FTD e amostras de tecido cerebral humano saudáveis ​​até o papel de nitrocelulose e deixe secar completamente. </li><li> Adicionar 1-2 ml de 5% de leite em pó em PBS e deixar agitar durante 1 hora à TA. Adicionar 1 ml de cada diluição 1/100 de fago e deixá-lo agitar O / N a 4 ° C. Lava-se a membrana 3 vezes durante 10 minutos cada com 0,5% de PBST. </li><li> Adicionar 1 ml de 1 / 1.000 de diluição de anti-M13 HRP e deixar agitar durante 1 hora à TA. Repita o procedimento de lavagem e visualizada utilizando solução quimiluminescência ocidental. </li></ol>

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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43:+the+relationship+between+protein+aggregation+and+neurodegeneration+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+lobar+degeneration.">TDP-43: the relationship between protein aggregation and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration.</a> FEBS Journal. 278, 3539-3549 (2011).</li><li>Ling, S. -. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+construction+of+a+large+nonimmune+phage+antibody+library:+The+production+of+high-affinity+human+single-chain+antibodies+to+protein+antigens.">Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: The production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6157-6162 (1998).</li><li>Hairul Bahara, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+antibodies+for+diagnostic+applications.">Phage display antibodies for diagnostic applications.</a> Biologicals. 41, 209-216 (2013).</li><li>Azzazy, H. M. E., Highsmith, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+technology:+clinical+applications+and+recent+innovations.">Phage display technology: clinical applications and recent innovations.</a> Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+single-chain+antibodies+from+a+human+synthetic+phage+display+library+for+detection+of+Bacillus+thuringiensis+(Bt).">Rapid isolation of single-chain antibodies from a human synthetic phage display library for detection of Bacillus thuringiensis (Bt).</a> Cry1B toxin. Ecotoxicology and Environmental Safety. 81, 84-90 (2012).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+characterization+of+single-chain+recombinant+antibodies+against+spring+viraemia+of+carp+virus+from+mouse+phage+display+library.">Selection and characterization of single-chain recombinant antibodies against spring viraemia of carp virus from mouse phage display library.</a> Journal of Virological Methods. 194, 178-184 (2013).</li><li>Cukkemane, N., Bikker, F. J., Nazmi, K., Brand, H. S., Veerman, E. C. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+Ubiquitinates+Tar-DNA+Binding+Protein-43+(TDP-43)+and+Promotes+Its+Cytosolic+Accumulation+via+Interaction+with+Histone+Deacetylase+6+(HDAC6).">Parkin Ubiquitinates Tar-DNA Binding Protein-43 (TDP-43) and Promotes Its Cytosolic Accumulation via Interaction with Histone Deacetylase 6 (HDAC6).</a> Journal of Biological Chemistry. 288, 4103-4115 (2013).</li><li>Wang, M. S., Zameer, A., Emadi, S., Sierks, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+Antibody+Specificity+to+Different+Protein+Morphologies+by+AFM.">Characterizing Antibody Specificity to Different Protein Morphologies by AFM.</a> Langmuir. 25, 912-918 (2008).</li><li>Williams, S., Sakic, B., Hoffman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+brain-reactive+autoantibodies+and+behavioral+deficits+in+the+MRL+model+of+CNS+lupus.">Circulating brain-reactive autoantibodies and behavioral deficits in the MRL model of CNS lupus.</a> Journal of Neuroimmunology. 218, 73-82 (2010).</li><li>Jo&#324;czyk, E., K&#322;ak, M., Mi&#281;dzybrodzki, R., G&#243;rski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+external+factors+on+bacteriophages&#8212;review.">The influence of external factors on bacteriophages&#8212;review.</a> Folia Microbiol. 56, 191-200 (2011).</li><li>Hammers, C. M., Stanley, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+Phage+Display:+Technique+and+Applications.">Antibody Phage Display: Technique and Applications.</a> J Invest Dermatol. 134, e17 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Protein variants have been shown to be involved in the progression of many neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, Parkinson&#8217;s, ALS and FTD1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Isolation of antibodies that can selectively recognize these different protein variant targets can be effective reagents to study, diagnose and potentially treat such ailments. To generate such variant specific antibodies we have developed a novel biopanning process that utilizes atomic force microscopy to monitor the progress ...

A presença de variantes de proteína tem sido implicada como um factor na progressão de muitas doenças, incluindo as doenças neurodegenerativas, tais como Alzheimer, Parkinson, ALS e demência fronto-temporal (FTD) 1,2,3,4,5,6,7,8,9 , 10,11. Formas oligoméricas de proteínas da beta-amilóide e alfa-sinucleína está pensado para ser as espécies tóxicas responsáveis ​​pela doença de Alzheimer e de Parkinson, respectivamente 2,3,4,5. Agregados de TAR ADN da proteína de ligação 43 (TDP-43) têm sido associados a ALS e FTD 12,13,14. Portanto reagentes tais como anticorpos que podem atingir selectivamente as diferentes variantes de proteína podem ser ferramentas poderosas para servir como marcadores de diagnóstico e terapêuticas potenciais. Neste estudo, focado no desenvolvimento de reagentes que se ligam selectivamente variantes da proteína TDP-43 implicado em ELA, no entanto a técnica descrita no presente documento deve ser aplicável ao isolamento de reagentes contra uma ampla gama de protein variantes. Agregação citoplasmática de TDP-43 foi identificado como uma característica patológica em ALS 15,16,17,18,19. Tipicamente TDP-43 encontra-se no núcleo de todas as células de um indivíduo normal, apesar de tender a mover-se entre o citoplasma e núcleo 15,17. Formas No entanto, em ALS agregados de TDP-43 são detectadas no citoplasma de neurónios e células da glia seleccione com concentrações mais baixos encontrados no núcleo, sugerindo o movimento de TDP-43 a partir do núcleo para o citoplasma durante a progressão da doença 16,20. Apesar da agregação de TDP-43 encontra-se na maioria dos casos de ALS, não leva em conta todos os casos, desde 1% a 2% do total de casos de ALS (ou 15% -20% dos casos de ALS familiar) estão ligados a mutações no superóxido dismutase 1 (SOD1) 15,17 gene. Devido ao importante papel da TDP-43, na grande maioria dos casos de ELA, aqui vamos focar no desenvolvimento de reagentes de anticorpos com base que pode se ligar seletivamente a TDP-43 variantes que sãopresentes no tecido cerebral humano ALS utilizando nossas técnicas de bioprospecção baseado romance AFM. Inicialmente precisamos de um repertório diversificado de ligação do anticorpo domínios. Combinamos três (scFvs) bibliotecas diferente de apresentação de fagos de fragmentos de anticorpos de domínio variável de cadeia única, (Tomlinson I e J e folhas de bibliotecas 21). O processo de filtração é dividida em fases panning negativos e positivos. Os fagos das bibliotecas são primeiro submetido ao processo de panning negativo durante o qual os fagos reactivo para fora múltiplos antigénios-alvo são excluídos. Após a conclusão de cada ciclo de prospecção negativa contra cada antigénio fora do alvo, o processo é acompanhado por AFM imagiologia para assegurar que todos os fagos de ligação dos antigénios-alvo fora ter sido removido. Somente após a verificação pela AFM imagem que todos os fagos reativas são removidos podemos avançar para o próximo alvo. Para isolar reagentes contra TDP-43 variantes implicados em ALS utilizamos os seguintes antígenos panning negativos:<html> 1) de BSA para remover fago que se ligam fracamente ou não-especificamente a proteínas; 2) alfa-sinucleína agregado para remover fagos que se ligam a elementos estruturais genéricas de proteínas agregadas; 3) homogenatos de tecido cerebral humano para remover fagos que se ligam a quaisquer proteínas ou outros componentes presentes em amostras pós-mortem de tecido de cérebro humano saudável; 4) imunoprecipitou TDP-43 do cérebro humano saudável para remover fago que se ligam a todos os TDP-43 formas associadas com o cérebro humano saudável; e 5) imunoprecipitada a TDP-43 isolada a partir de homogenatos de cérebro de FTD para remover fago que se ligam TDP-43 variantes associadas com a patologia não-ALS. Após remoção de todo o fago reactivo a todos os antigénios off-alvo, que, em seguida, procedeu-se à fase de filtração positivo durante o qual os fragmentos de anticorpos que se ligam ao antigénio de interesse são isolados, neste caso TDP-43 imunoprecipitada a partir de tecido cerebral humano ALS. Estes anticorpos isolados podem ser reativas a formas de TDP-43 agregados ou modificados. &quot;&gt; Convencional bioprospecção fago centra-se principalmente na fase de filtração positiva 22,23. Normalmente, o alvo de interesse estiver imobilizado, a biblioteca de fago adicionado e fagos ligados eluídos. Os fagos são então amplificados e adicionado ao alvo novamente. Este processo de amplificação e a incubação geralmente é repetido várias vezes para aumentar a percentagem de fago de ligação positivo. Embora variações deste processo têm sido extensivamente usados ​​para isolar os reagentes de anticorpos contra uma vasta gama de antigénios alvo, que geralmente requer grandes quantidades de antigénio alvo purificada 24,25,26, 27, enquanto que o nosso processo requer apenas pequenas quantidades do antigénio alvo. O protocolo aqui descrito pode ser utilizado para isolar os reagentes que se ligam selectivamente a antigénios alvo que estão presentes em concentrações muito baixas, sem a necessidade de purificação e a filtração pode ser efectuada directamente contra antígeno presente em amostras de tecidos complexos. O uso de protocolos panning negativas exaustivas como verificadopor AFM garante que clones isolados contra o antígeno positivo deve se ligar seletivamente o alvo, mesmo quando não purificado ou enriquecido. Kasturirangan e colegas (2003) levaram a cabo um processo de bioprospecção negativo e positivo semelhante para isolar anticorpos reativos ao oligomï¿½ica beta-amilóide utilizando concentração nanograma do alvo 5. Aqui vamos expandir esse processo para permitir a geração de reagentes que se ligam seletivamente a proteína específica da doença variantes diretamente de amostras de tecidos humanos. Em estudos futuros, pretendemos investigar não só o valor diagnóstico dos reagentes isolados aqui, mas também avaliar a sua relevância terapêutica para o tratamento de ELA. No geral, a nova tecnologia AFM bioprospecção com base deve ser aplicável ao isolamento de qualquer variante da proteína específica da doença em qualquer material biológico sem a necessidade de purificação da proteína ou modificação, mesmo quando o antigénio alvo Concentraçãns são extremamente baixos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="940">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:287px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:212px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:323px;">Tomlinson I and J Libraries</td>
			<td style="width:287px;">MRC (Cambridge, England)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sheets Library</td>
			<td style="width:287px;">MRC (Cambridge, England)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">2xYT</td>
			<td style="width:287px;">BD Sciences</td>
			<td style="width:119px;">244020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Glucose</td>
			<td style="width:287px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0188-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:287px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0339-25G</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">KM13 Helper Phage</td>
			<td style="width:287px;">MRC (Cambridge, England)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:287px;">OmniPur</td>
			<td style="width:119px;">5880</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Polyethylene Glycol 8000</td>
			<td style="width:287px;">OmniPur</td>
			<td style="width:119px;">6510</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:287px;">Macron</td>
			<td style="width:119px;">7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:287px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0404-1KG</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:287px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">PX1405-1</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:287px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0781-500G</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">TG1 Cells</td>
			<td style="width:287px;">MRC (Cambridge, England)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria-Bertani Agar</td>
			<td style="width:287px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">1.10283.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:287px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">STEN buffer</td>
			<td style="width:287px;">Crystalgen Inc.</td>
			<td style="width:119px;">33429775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Immunotubes</td>
			<td style="width:287px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">470319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Mica</td>
			<td style="width:287px;">Spruce Pine Mica</td>
			<td style="width:119px;">24365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Tween 20</td>
			<td style="width:287px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Trypsin</td>
			<td style="width:287px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T-0303</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triethylamine</td>
			<td style="width:287px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T-0886</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Glycerol</td>
			<td style="width:287px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0854-1L</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">DNA Plasmid Prep Kit</td>
			<td style="width:287px;">qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27106</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Non-Fat Milk Powder</td>
			<td style="width:287px;">Carnation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">96-Well High Binding ELISA Plate</td>
			<td style="width:287px;">Costar</td>
			<td style="width:119px;">3590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Anti-M13 HRP</td>
			<td style="width:287px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">27-9421-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:323px;">ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit</td>
			<td style="width:287px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">37074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody</td>
			<td style="width:287px;">ProteinTech</td>
			<td style="width:119px;">10782-2-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">A/G Agarose Beads</td>
			<td style="width:287px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">HB 2151 Cells</td>
			<td style="width:287px;">MRC (Cambridge, England)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropylthiogalactoside</td>
			<td style="width:287px;">Teknova</td>
			<td style="width:119px;">13325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">9e10 HRP</td>
			<td style="width:287px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Nitrocellulose Membrane</td>
			<td style="width:287px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">162-0115</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:287px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Sorvall RC 6+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope</td>
			<td style="width:287px;">Veeco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AFM Probes</td>
			<td style="width:287px;">VistaProbes</td>
			<td style="width:119px;">T300R-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel atomic force microscopy based biopanning for isolation of morphology specific reagents against tdp-43 variants in amyotrophic lateral sclerosis

Porque variantes de proteína desempenham papéis críticos em muitas doenças, incluindo TDP-43 em Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS), alfa-sinucleína em doença e beta-amilóide e de tau na doença de Alzheimer, é criticamente importante desenvolver reagentes morfologia específicos que podem direccionar selectivamente Parkinson estes proteína específica da doença variantes para estudar o papel destas variantes na patologia da doença e para potenciais aplicações de diagnóstico e terapêuticas. Nós desenvolvemos novos microscopia de força atômica (AFM) técnicas de bioprospecção base que permitem o isolamento de reagentes que reconhecem seletivamente variantes de proteína de doenças específicas. Existem duas fases principais envolvidos no processo, as fases de panning negativos e positivos. Durante a fase de panning negativo, os fagos que são reativos a antígenos off-alvo são eliminados através de várias rodadas de panning subtrativo utilizando uma série de cuidadosamente selecionados antígenos fora do alvo. Uma característica fundamental no negativofase panning está utilizando imagens AFM para acompanhar o processo e confirmar que todas as partículas de fago indesejados são removidos. Para a fase de deslizamento positivo, o antigénio alvo de interesse é fixa sobre uma superfície de mica e fagos ligados são eluídos e pesquisados ​​para identificar os fagos que se ligam selectivamente o antigénio alvo. A variante da proteína alvo não necessita de ser purificada para proporcionar os controlos negativos adequados panning foram utilizados. Mesmo variantes da proteína alvo que estão presentes apenas em concentrações muito baixas em material biológico complexo pode ser utilizado no passo de filtração positivo. Através da aplicação desta tecnologia, adquirimos anticorpos para proteínas variantes de TDP-43 que são encontrados seletivamente no tecido cerebral humano ALS. Espera-se que este protocolo deve ser aplicável para geração de reagentes que se ligam selectivamente variantes proteicas presentes numa grande variedade de diferentes processos biológicos e doenças.

Na Figura 1, o esquema demonstra o processo de deslizamento negativo pelo qual removido fago de ligação antigénios fora do alvo da nossa biblioteca utilizando imunotubos. Inicialmente começou com BSA uma vez que este é um agente bloqueador comum e qualquer fago que iria reagir de forma não específica com esta meta seria problemático em imunoensaios futuras. Em seguida, removeu-ligantes para agregados alfa-sinucleína para eliminar fagos que são reactivos com estruturas genéricas de proteínas ...

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Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Novel Microscopia de Força Atômica bioprospecção Based para Isolamento de Morfologia reagentes específicos contra TDP-43 variantes em Esclerose Lateral Amiotrófica

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

novel-atomic-force-microscopy-based-biopanning-for-isolation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.7K visualizações.  Arizona State University. Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

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Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

A imobilização de bactérias for Imaging por Microscopia de Força Atômica

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Bioengenharia

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

Visualização do DNA recombinante e Complexos de Proteínas Usando Microscopia de Força Atômica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Quantificar as propriedades mecânicas do Glicocálix endotelial com Microscopia de Força Atômica

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Um novo método para localizar Repórter fluorescentes Beads perto da superfície de cultivo celular para Tração Microscopia de Força

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Projeção de imagem atômica e força Espectroscopia de Bicamadas Lipídicas suportados

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved oxygen concentration). Nevertheless, the morphology of cells can be a suitable indicator for optimal conditions, since it changes with dependence on the growth state, product accumulation and cell stress. Furthermore, the single-cell size distribution provides not only information about the cultivation conditions, but also about the population heterogeneity. To gain such information, a photo-optical in situ microscopy device1 was developed to enable the monitoring of the single-cell size distribution directly in the cell suspension in bioreactors. An automated image analysis is coupled to the microscopy based on a neural network model, which is trained with user-annotated images. Several parameters, which are gained from the captures of the microscope, are correlated to process relevant features of the cells, like their metabolic activity. Until now, the presented in situ microscopy probe series was applied to measure the pellet size in filamentous fungi suspensions. It was used to distinguish the single-cell size in microalgae cultivation and relate it to lipid accumulation. The shape of cellular particles was related to budding in yeast cultures. The microscopy analysis can be generally split into three steps: (i) image acquisition, (ii) particle identification, and (iii) data analysis, respectively. All steps have to be adapted to the organism, and therefore specific annotated information is required in order to achieve reliable results. The ability to monitor changes in cell morphology directly in line or on line (in a by-pass) enables real-time values for monitoring and control, in process development as well as in production scale. If the off line data correlates with the real-time data, the current tedious off line measurements with unknown influences on the cell size become needless.

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

A photo-optical in situ microscopy device was developed to monitor the size of single cells directly in the cell suspension. The real-time measurement is conducted by coupling the photo-optical sterilizable probe to an automated image analysis. Morphological changes appear with dependence on the growth state and cultivation conditions.

Em Situ Microscopia para determinação em tempo real da morfologia unicelular em bioprocessos

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Aplicação de microscopia de força atômica para detectar osteoartrite precoce

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

Automação de Medições de Microscópio de Força Bio-Atômica em centenas de células de C. albicans

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning and transmission electron microscope, to the invention of atomic force microscopy, and advances in fluorescent imaging, there have been substantial gains in technologies that enable the study of small materials. Conpokal is a portmanteau that combines confocal microscopy with atomic force microscopy (AFM), where a probe &#8220;pokes&#8221; the surface. Although each technique is extremely effective for the qualitative and/or quantitative image collection on their own, Conpokal provides the capability to test with blended fluorescence imaging and mechanical characterization. Designed for near simultaneous confocal imaging and atomic force probing, Conpokal facilitates experimentation on live microbiological samples. The added insight from paired instrumentation provides co-localization of measured mechanical properties (e.g., elastic modulus, adhesion, surface roughness) by AFM with subcellular components or activity observable through confocal microscopy. This work provides a step by step protocol for the operation of laser scanning confocal and atomic force microscopy, simultaneously, to achieve same cell, same region, confocal imaging, and mechanical characterization.

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy Conpokal on Live Cells

Presented here is the protocol of the Conpokal technique, which combines confocal and atomic force microscopy into a single instrument platform. Conpokal provides same cell, same region, near simultaneous confocal imaging and mechanical characterization of live biological samples.

Microscopia confocal e força atômica (Conpokal) em células vivas

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...