Assim, este protocolo nos permite induzir transições de fase patológica do TDP-43 e abordar sua consequência celular nos neurônios motores espinhais in vivo, o que é relevante para entender por que os neurônios motores degeneram em ELA. Devido à alta transparência das larvas de zebrafish, os neurônios motores da medula espinhal são diretamente visíveis. Assim, pode-se visualizar o comportamento dinâmico do TDP-43 passando por transições de fase em neurônios motores únicos espinhais.
Este método oferece um novo modelo animal de ELA. Acreditamos que qualquer método que possa impedir a transição e agregação de fase tdp-43 induzidos pela luz neste modelo de ELA pode ser um potencial candidato à terapia de ELA. Outras proteínas relacionadas à ELA com regiões intrinsecamente desordenadas podem ser expressas para explorar a neurotoxicidade associada às transições de fases anormais.
A chave para o sucesso nesta abordagem é expressar o TDP-43 optogenético nos neurônios motores espinhais a nível nãotóxico. A transgênese BAC é um passo demorado, mas uma vez que você cria um peixe transgênico adequado, os seguintes passos são relativamente mais fáceis e simples. Para começar, ligue o diodo emissor de luz, ou painel LED, usando o aplicativo associado instalado em um tablet ou telefone.
Em seguida, coloque a sonda espectrômetro em um poço vazio de um prato de 6 poços. Em seguida, usando o aplicativo, ajuste a luz LED para um comprimento de onda de 456 nm. Coloque o sensor óptico de um medidor óptico no poço vazio e ajuste a potência da luz LED.
Em seguida, coloque o prato com a configuração do painel LED em uma incubadora a 28 C.Para a imagem das larvas de peixe zebra expressando TDP-43 optogenética, descoriorar o peixe transgênico duplo e anestesia-los em tampão E3 contendo 250 g/mL de Tricane. Em seguida, pré-aqueça 1% de baixa temperatura de fusão agarose contendo 250 g/mL de etil 3-aminobenzoato metanosulfonato a 42 C.Em seguida, coloque uma gota da agarose no prato de base de vidro. O diâmetro da gota de agarose em forma de cúpula no prato de vidro deve ser de 8 a 10 mm.
Em seguida, usando uma pipeta Pasteur, adicione o peixe anestesiado à agarose no prato à base de vidro. Minimize a quantidade de tampão E3 adicionado à agarose junto com o peixe. Em seguida, misture por pipetting algumas vezes.
Durante a solidificação da agarose, mantenha o peixe de lado usando uma agulha de seringa, de tal forma que a medula espinhal esteja em uma posição horizontal apropriada. Depois que a agarose se solidificar, adicione algumas gotas de tampão E3 no peixe montado em agarose em forma de cúpula. Usando um microscópio confocal equipado com uma lente objetiva de imersão de água 20 vezes, adquira seções z confocal serial da medula espinhal.
Inclua a cloaca no lado ventral do peixe nas regiões de interesse como referência para identificar e comparar os segmentos espinhais através dos pontos de tempo. Assim que a imagem estiver completa, use uma agulha de seringa para quebrar cuidadosamente a agarose e remover o peixe da agarose. Mantenha a quantidade de tempo que o peixe está embutido na agarose o mais curto possível, embora a garose incorporando por menos de 30 minutos não afete a viabilidade do peixe.
Adicione 7,5 mL de tampão E3 a um poço de um prato de 6 poços e coloque o peixe duplo transgênico imaged nesse poço. Em seguida, coloque o prato no painel LED, mantendo o prato e o painel LED 5 mm separados com um espaçador, e ligue a luz LED azul. Mantenha alguns peixes transgênicos duplos em um prato separado de 6 poços coberto com papel alumínio para peixes de controle nãoilluminados.
Após o tempo de iluminação desejado, imagem da medula espinhal do peixe iluminado como demonstrado anteriormente. A realocação citoplasmática do opTDP-43h em neurônios motores espinhal único foi visualizada separando as imagens da série Z adquiridas aos 48. e 72 horas pós fertilização em cada canal EGFP-TDP-43z e opTDP-43h.
A partir de imagens de projeção de intensidade máxima de EGFP-TDP-43z, um único neurônio espinhal isolado identificável em ambos os 48. e 72 horas após a fertilização foram selecionadas. Regiões de interesse que cobriam as somas dos neurônios motores foram definidas pelo rastreamento da borda do sinal EGFP em 48.
e 72 horas após a fertilização. A intensidade fluorescente normalizada ao longo do eixo principal da soma foi traçada. E em 48 horas após a fertilização, os padrões de ambos os sinais se sobrepuseram em grande parte um ao outro.
Em contraste, às 72 horas, o pico para o sinal opTDP-43h foi encontrado na região onde o sinal EGFP-TDP-43z estava baixo, indicando a realocação citoplasmática de opTDP-43h. Para quantificar os sinais opTDP-43h e EGFP-TDP-43z antes e depois da estimulação da luz azul, algumas fatias de imagens de projeção para cada canal das mesmas imagens da série Z foram produzidas em 48. e 72 horas após a fertilização.
Das quatro células mnr2b+que foram investigadas, a célula 1, notavelmente exibiu um sinal EGFP-TDP-43z saturado. Os valores relativos de opTDP-43h para EGFP-TDP-43z foram calculados dividindo o valor RFP pelo valor de GFP. As células 2 a 4 apresentaram níveis de opTDP-43h decrescentes após a iluminação da luz azul.
É importante minimizar o tempo em que os peixes estão embutidos na agarose para mantê-los saudáveis. Ajustando a intensidade e duração da iluminação LED, controlamos a transição de fase TDP-43 de forma regulamentada temporária, o que pode ajudar a dissecar a progressão da transição patológica de fase TDP-43 no neurônio motor.
