This work was supported by grant 13IRG14560023 from the American Heart Association and NIH grants AI078972 and HL108054 to CJO. Support for AOB was from the NIH National Center for Advancing Translational Sciences NIH ULTR001120, and F31 A110417701.

NOTA: Todas as experiências com camundongos foram revisadas e aprovadas pelo Animal Care Institucional e Comissões de uso na University of Texas Health Science Center em San Antonio (protocolo nº 13032-34-01C). Cuidados com os animais e os protocolos experimentais aderiram ao Direito Público 89-544 (Animal Welfare Act) e suas alterações, as orientações serviços de saúde pública, e no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA). 1. Infecção <ol><li> Obter ratinhos BALB / c de ambos os sexos com idades entre 10-12 semanas de idade. NOTA: S. pneumoniae sorotipo 4 estirpe TIGR4 é um isolado clínico virulenta que foi seqüenciado 16. </li><li> Cresça TIGR4 em caldo de Todd-Hewitt a 37 ° C em 5% de CO2 até atingirem uma densidade óptica (DO) 620 de 0,5 (correspondendo a 1,0 x 10 8 unidades formadoras de colónias [] CFU / ml). Agregar a cultura de pneumococos por centrifugação durante 10 min a 3, 500 x g e eliminar o sobrenadante usando uma linha de vácuo. Suspender as bactérias e diluir com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) a uma concentração final de 1,0 x 10 4 CFU / mL. </li><li> Utilizando uma câmara de indução, anestesiar ratos com 2,5% de isoflurano vaporizado em oxigênio. Confirme estado de anestesia por pitada toe suave com uma pinça sem corte. <ol><li> Segurando o rato anestesiado pela sua nuca e na vertical com uma mão, injetar cada rato por via intraperitoneal (ip) com 100 mL da S. pneumoniae suspensão utilizando uma seringa com uma agulha de calibre 27-30 (correspondente a uma dose de desafio de 1,0 x 10 3 CFU). Coloque a parte de trás do mouse em sua gaiola. Ratos normalmente despertar 30-40 seg após a injeção. </li></ol></li><li> Permitir que a infecção para continuar por pelo menos 24 (antecipado) ou 30 (avançado) hr. <ol><li> Eutanásia dos ratinhos por asfixia com CO 2. Execute deslocamento cervical para garantir rato tem falecido. A eutanásia é ainda confirmada pela remoçãodo coração no passo 1.6. </li></ol></li><li> Desinfetar a cauda com um algodão embebido em álcool e cortar uma seção de 2-3 mm. Recolhe 2 ul de sangue em série e diluir o sangue de 10 vezes em PBS contendo heparina de sódio 1 U / ml de cinco vezes. Diluições em série de placa sobre uma placa de agar tríptico de soja sangue e incubar durante a noite a 37 ° C em 5% de CO 2. O próximo dia de extrapolar colónia conta o nível de bacteremia. </li><li> Imobilizar o mouse em decúbito dorsal sobre uma plataforma cirúrgica. Pulverizar o peito com etanol 70% e seque. Usando uma tesoura cirúrgica e uma pinça abrir a cavidade torácica, retire a caixa torácica, e transecto o diafragma para expor o coração e os pulmões. Usando uma tesoura cortar os vasos sanguíneos ligados ao coração e extirpar suavemente o coração com cuidado para evitar contusões com uma pinça. </li><li> Lavar o coração com PBS e, em seguida, colocar em cassetes de colheita de amostras de tecidos que tais secções coronais seria obtido durante o corte do tecido. Para inclusão em parafina, place as cassetes em 10% solução tamponada com formalina e no dia seguinte enviar para inclusão em parafina. <ol><li> Alternativamente congelamento flash usando outubro Composto dentro de um cryomold que foi colocado em gelo seco. </li></ol></li></ol> 2. A visualização das lesões cardíacas e pneumococos dentro das lesões <ol><li> Reduzir secções de coração embebidos em parafina de tal forma que os quatro câmaras do coração são visíveis na secção de cada tecido. Cortar as lâminas com uma espessura de 5 mm. </li><li> Desparafinar e mancha slides com hematoxilina e eosina (H &amp; E) usando métodos padrão 17. </li><li> Ver H &amp; E manchada seções cardíacos usando um microscópio de luz em baixa (100X, 200X) e alta (imersão em óleo: 400X, 1000X) ampliações. Caracterizar os corações para a presença de microlesões no miocárdio. Aqui, adquirir H &amp; E imagens usando um microscópio Zeiss Axioskop 2 equipado com um 100X 1,3 numérica objetivo abertura Plan-Neofluar. NOTA: Em fases iniciais l cardíacaesions são discriminados pela sua aparência colorida diferencial e, em alguns casos, a presença de células imunes (monócitos e granulócitos) que parecem ser monócitos. Nas lesões avançadas, particularmente aqueles observados em 30 horas, as células imunológicas são lesões vacuole-como ausentes e grandes são observados em seu lugar. É importante notar que, enquanto o influxo de células imunitárias durante as fases iniciais do desenvolvimento da lesão cardíaca pode ocorrer não parece ser um requisito. </li></ol> 3. Immunofluorescent Microscopia para pneumococos dentro Microle- <ol><li> Seção coração em cryomolds com microtome a uma espessura de 5 seções um e colocar em lâminas de vidro com carga positiva. Permitir secções cardíacas congelados para descongelar e ar seco. Fix secções durante 10 minutos em 10% de formalina tamponada neutra (pH 6,8-7,2 a 25 ° C). </li><li> Lavagem das lâminas (3x) em PBS durante 5 min, para permeabilizar 15 min em 0,2% de Triton X-100 em PBS, em seguida, lavar novamente em PBS. </li><li> Secti tecido Bloco<html> em em lâminas com 10% de soro de cabra em PBS durante 1 hora. </li><li> Lavar as lâminas com PBS, e incubar tampa com secções cardíacos de coelho anti-pneumococos do serotipo 4 anti-soro a 1: 1000 em PBS com 10% de soro de cabra durante 2 horas a 37 ° C. NOTA: Para os controles negativos investigadores devem usar ingênuo anti-soro de coelho </li><li> Após lavagem com PBS, a tampa e incubar secções com 10% de soro de cabra-PBS com cabra anti-coelho FITC anticorpo conjugado a 1: 2000 durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Seguindo as instruções do fabricante, usar DAPI (4 &#39;, 6- diamidino-2-fenilindolo) em 5 mg / ml para a visualização de núcleos eucarióticos. Lave e montar secções de tecido com FluorSave. </li><li> Adquirir imagens fluorescentes utilizando um sistema de microscópio confocal tanto a baixa como alta ampliação. Ajustar a abertura numérica em conformidade para se obter resultados óptimos. Aqui, adquirir imagens fluorescentes usando um sistema confocal com um objetivo abertura numérica 60X 1,42. </li></ol>&quot;&gt; 4. Salvamento Antibiótico de fossa séptica Mice <ol><li> Comece com ratinhos infectados ip com 1,0 x 10 3 CFU de TIGR4 como anteriormente indicado na etapa 1. </li><li> Começando às 30 horas pós-infecção, administrar farmacêutica ampicilina grau ip (80 mg / kg de peso corporal) em 100 ul de solução salina a cada 12 h durante 36 h. Recolha corações no ponto de tempo desejado e processo tal como descrito no passo 1.6 para inclusão em parafina e tecido, o seccionamento. </li></ol> 5. Collagen Detection Deposition <ol><li> Usando xileno e lavagens álcool graduado com água, Desparafinar e tecidos hidrato seções deionizada usando métodos padrão 17. Tratar secções com ácido fosfomolíbdico aquosa a 0,2% durante 5 minutos e lavar com água desionizada durante 5 minutos. </li><li> Secções mancha com 0,1% de vermelho Sirius em ácido pícrico de 2 h à temperatura ambiente. </li><li> Lave os cortes em ácido clorídrico 0,01 N durante 3 min e enxaguar utilizando etanol a 70% durante 1 min. </li><li> Desidrataçãote as seções usando o idêntico, mas a fim de lavagens ao indicado na 5.1 reverter, desidratar seções cardíacas no aumento e classificados concentrações de etanol, em seguida, xileno. </li><li> Cortes de tecido Mount com uma solução de montagem para avaliação microscópica. </li><li> Para identificar as regiões de deposição de colágeno, examinar secções de tecido manchado por áreas de coloração leitura profunda com baixa e alta ampliação usando um microscópio de luz. Qualquer área dentro dos ventrículos do coração, que é o vermelho é uma área onde o colágeno tem sido depositado. Áreas sem essa mancha vermelha são locais de tecido saudável falta deposição de colágeno. Aqui, adquirir Picro Sirius Red imagens coradas utilizando um microscópio equipado com um objetivo abertura numérica 20X 0,5. NOTA: As manchas vermelhas no átrio tecidos saudáveis. </li></ol>

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	<li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+complications+in+patients+with+community-acquired+pneumonia:+incidence,+timing,+risk+factors,+and+association+with+short-term+mortality.">Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: incidence, timing, risk factors, and association with short-term mortality.</a> Circulation. 125, 773-781 (2012).</li><li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+bacterial+pneumonia+is+associated+with+the+occurrence+of+acute+coronary+syndromes.">Acute bacterial pneumonia is associated with the occurrence of acute coronary syndromes.</a> Medicine (Baltimore). 88, 154-159 (2009).</li><li>Corrales-Medina, V. 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Mayo Clin.</a> Proc. 89, 60-68 (2014).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+11+common+viral+and+bacterial+pathogens+causing+community-acquired+pneumonia+or+sepsis+in+asymptomatic+patients+by+using+a+multiplex+reverse+transcription-PCR+assay+with+manual+(enzyme+hybridization)+or+automated+(electronic+microarray)+detection.">Detection of 11 common viral and bacterial pathogens causing community-acquired pneumonia or sepsis in asymptomatic patients by using a multiplex reverse transcription-PCR assay with manual (enzyme hybridization) or automated (electronic microarray) detection.</a> Journal Of Clinical Microbiology. 46, 3063-3072 (2008).</li><li>Musher, D. M., Rueda, A. M., Kaka, A. S., Mapara, S. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+receptor+initiates+bacterial+contact+with+the+blood+brain+barrier+in+experimental+meningitis+models.">Laminin receptor initiates bacterial contact with the blood brain barrier in experimental meningitis models.</a> The Journal of Clinical Investigation. 119, 1638-1646 (2009).</li><li>Flick, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+elimination+of+the+binding+motif+on+fibrinogen+for+the+S.+aureus+virulence+factor+ClfA+improves+host+survival+in+septicemia.">Genetic elimination of the binding motif on fibrinogen for the S. aureus virulence factor ClfA improves host survival in septicemia.</a> Blood. 121, 1783-1794 (2013).</li><li>Cheng, A. G., DeDent, A. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reentry+as+a+cause+of+ventricular+tachycardia+in+patients+with+chronic+ischemic+heart+disease:+electrophysiologic+and+anatomic+correlation.">Reentry as a cause of ventricular tachycardia in patients with chronic ischemic heart disease: electrophysiologic and anatomic correlation.</a> Circulation. 77, 589-606 (1988).</li><li>Verma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+successful+ablation+sites+and+the+scar+border+zone+defined+by+substrate+mapping+for+ventricular+tachycardia+post-myocardial+infarction.">Relationship between successful ablation sites and the scar border zone defined by substrate mapping for ventricular tachycardia post-myocardial infarction.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 465-471 (2005).</li><li>Wu, K. 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The authors declare no conflict of interest in this study.

Neste relatório, um método altamente reprodutível para induzir S. pneumoniae mediada microlesões cardíacos em ratos durante IPD e as técnicas para a sua visualização é demonstrada. Os ratinhos são infectados com uma dose de bactérias que ultrapassa o limiar do sistema imunitário para a depuração, que conduz a bacteremia de alto grau, semelhante ao que ocorre durante a sepsia humano, e leva a uma eventual translocação bacteriana no miocárdio. Por razões ainda desconhecidas, S. pneumoniae</e...

Internação de adultos para pneumonia adquirida na comunidade (PAC) carrega um risco documentado para eventos cardíacos adversos que contribui para a mortalidade 1-4. Em um estudo recente realizado por Corrales-Medina et al. Complicações cardíacas foram encontrados para ser associado com e / ou responsáveis ​​por 27% dos óbitos associados à pneumonia 3. Streptococcus pneumoniae (pneumococo), a causa mais comum de PAC e sepse 5, foi diretamente associada a eventos cardíacos adversos em tantos como 19% dos pacientes adultos internados 6. Eventos cardíacos adversos associados com pneumonia incluem falha nova ou agravada cardíaca congestiva, arritmias e infarto do miocárdio em ordem decrescente de freqüência de 6. Num artigo recente PLoS Pathogens por Brown et al., S. pneumoniae foi encontrado para ser capaz de translocação através do endotélio vascular cardíaca, a entrada no myocardium, e formação de lesões microscópicas não purulentos discretos (microlesões) cheios de bactérias nos ventrículos durante a doença pneumocócica invasiva (DPI) 7. Evidência de formação microlesion cardíaca foi observada em amostras cardíacas a partir de primatas não humanos e os indivíduos que tinham sucumbido à infecção pneumocócica. Da mesma forma, camundongos infectados experimentalmente reproducibly desenvolvido microlesões cardíacos. Em camundongos, o tamanho microlesion e número foi positivamente correlacionada com a duração e gravidade de bacteremia, os níveis de troponina cardíaca em soros e eletrofisiologia cardíaca aberrante. A translocação bacteriana para o coração foi observado que ocorre através dos mesmos mecanismos responsáveis ​​pela translocação do pneumococo através da barreira sangue-cérebro e o desenvolvimento de meningite pneumocócica, ou seja, a proteína de ligação a colina A invasão mediada por células endoteliais vasculares em um receptor de laminina e Plaquetas receptor do fator de -activating forma dependente 8. Microlesformação de iões também exigiu a pneumocócica toxina pneumolisina de formação de poros que foi encontrado para matar cardiomiócitos 7. Microlesões cardíacos pneumocócicas são distintas do soft-tecido purulenta e abcessos cardíacos que são causadas por outras bactérias Gram-positivas, incluindo Staphylococcus aureus. Estes são caracterizados por um único focos das bactérias rodeadas por neutrófilos e a deposição de fibrina 9,10. Microle- formado por S. pneumoniae são menores em tamanho, distribuídos por todo o coração afetado, e carecem de infiltrados de células imunes. Durante as fases iniciais da infecção, microlesões causada por S. pneumoniae aparecem como áreas de tecido danificado ou inflamado reminiscente dos sinais patológicos de cardiomiopatia. Alguns monócitos podem ser observados durante este tempo, no entanto a sua presença é de curta duração e lesões rapidamente tornam-se necróticas na aparência e cheia de bactérias ao mesmo tempo continuar a GRow em tamanho até a morte do animal ou intervenção antimicrobiana. É importante salientar, no prazo de 3 dias de intervenção antibiótico, infiltração de células imunes profusa é observada no antigo local da lesão e isso é acompanhado por deposição de colágeno robusto. Remodelação cardíaca semelhante foi relatado para ocorrer após o infarto, juntamente com consequências duradouras na função cardíaca 11-15. Assim, microlesões são uma possível explicação para os eventos cardíacos adversos que ocorrem durante o IPD e, possivelmente, o aumento da incidência de mortalidade cardíaca relacionada com em indivíduos convalescentes que sobreviveram o episódio da doença. Nisto, a instrução é fornecido no modelo experimental de rato IPD e a formação da lesão cardíaca e visualização de microlesões cardíacas em estágios precoces e tardios da infecção. O protocolo para detecção de deposição de colágeno nos animais que foram salvos pela intervenção antimicrobiana é demonstrada. O objetivo deste artigo é o de facilitate a pesquisa de outros pesquisadores sobre esta patologia pneumocócica importante e romance.

<table><tbody><tr><td>Todd-Hewitt broth&amp;nbsp;</td><td>Neogen</td><td>7161A</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T Compound&amp;nbsp;</td><td>Tissue-Tek (Sakura Finetek)&amp;nbsp;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific (Acros)</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td></td></tr><tr><td>anti-serotype 4 pneumococcus antiserum&amp;nbsp;</td><td>Statens Serum Institut</td><td>16747</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-rabbit FITC conjugated antibody&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-096-144</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Fluorsave</td><td>Millipore</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>S70104</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9393</td><td></td></tr><tr><td>phosphomolybdic acid 0.2%&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>26357-01</td><td></td></tr><tr><td>0.1% Sirius Red in picric acid&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>26357-02</td><td></td></tr><tr><td>0.01 N hydrochloric acid&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>26357-03</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tack Microscope Slides</td><td>Polysciences, Inc</td><td>24216</td><td></td></tr><tr><td>Paralube Vet Ointment</td><td>Dechra</td><td>12920060</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin and Eosin Staining Kit</td><td>unspeciified&amp;nbsp;</td><td></td><td>Standard</td></tr></tbody></table>

visualization of streptococcus pneumoniae within cardiac microlesions and subsequent cardiac remodeling

Durante a bacteremia Streptococcus pneumoniae pode translocar através do endotélio vascular para o miocárdio e formar bactérias cheios de lesões microscópicas discretas (microlesões) que são notáveis ​​devido à ausência de infiltrado de células imunitárias. Devido a sua liberação de produtos cardiotóxicos, S. pneumoniae dentro microlesões são pensados ​​para contribuir para a insuficiência cardíaca que é freqüentemente observado durante a doença pneumocócica invasiva fulminate em adultos. Nisto é demonstrado um protocolo para a infecção experimental do rato que leva à formação reprodutíveis microlesion cardíaca dentro de 30 horas. Instrução é fornecida na identificação microlesion em hematoxilina &amp; eosina seções coração manchado e as distinções morfológicas entre microlesões precoces e tardias são realçados. Instrução é fornecida em um protocolo de verificação de S. pneumoniae dentro microlesões usando anticorpos contra polissacarídeo capsular e pneumocócicaA microscopia de imunofluorescência. Por último, um protocolo para a intervenção antibiótico que resgata ratinhos infectados e para a detecção e avaliação da formação de cicatriz no coração dos ratos convalescentes é fornecido. Juntos, esses protocolos irá facilitar a investigação dos mecanismos moleculares subjacentes invasão cardíaca pneumocócica, a morte de cardiomiócitos, remodelação cardíaca como resultado da exposição a S. pneumoniae, e a resposta imune para o pneumococos no coração.

Visualização de microlesões por H &amp; E Microlesões cardíacas foram observadas nos ventrículos de H &amp; E coradas secções cardíacas de ratos com IPD seguintes seu desafio ip com TIGR4. A Figura 1 demonstra o aumento no tamanho das lesões entre 24 e 30 horas pós-infecção (hpi), com maior número de hematoxilina -stained (ie, azul-púrpura) pneumococos visível no interior da lesão. Microle- foram caracterizadas por uma morfologia semelhante...

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Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals.

Visualização de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Dentro Microle- cardíacas e remodelação cardíaca Subsequente

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

visualization-streptococcus-pneumoniae-within-cardiac-microlesions

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Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

8.9K visualizações.  The University of Texas Health Science Center at San Antonio. Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals. 

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Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

Visualização Quantitativa de Infiltrado de Leucócitos em um Modelo Murino de Miocardite Fulminante por Microscopia de Folha de Luz

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Medicina

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ventricular stiffness with altered cardiac function. This increase in cardiac ventricular fibrosis is due to activation of resident fibroblasts, although how these cells operate within the 3-dimensional (3-D) heart, at baseline or after activation, is not well understood. To examine how fibroblasts contribute to heart disease and their dynamics in the 3-D heart, a refined CLARITY-based tissue clearing and imaging method was developed that shows fluorescently labeled cardiac fibroblasts within the entire mouse heart. Tissue resident fibroblasts were genetically labeled using Rosa26-loxP-eGFP florescent reporter mice crossed with the cardiac fibroblast expressing Tcf21-MerCreMer knock-in line. This technique was used to observe fibroblast localization dynamics throughout the entire adult left ventricle in healthy mice and in fibrotic mouse models of heart disease. Interestingly, in one injury model, unique patterns of cardiac fibroblasts were observed in the injured mouse heart that followed bands of wrapped fibers in the contractile direction. In ischemic injury models, fibroblast death occurred, followed by repopulation from the infarct border zone. Collectively, this refined cardiac tissue clarifying technique and digitized imaging system allows for 3-D visualization of cardiac fibroblasts in the heart without the limitations of antibody penetration failure or previous issues surrounding lost fluorescence due to tissue processing.

A refined method of tissue clearing was developed and applied to the adult mouse heart. This method was designed to clear dense, autofluorescent cardiac tissue, while maintaining labeled fibroblast fluorescence attributed to a genetic reporter strategy.

Clareza refinada baseada em clareza para organização de fibroblasto tridimensional em corações de rato saudáveis e feridos

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to induce myocardial injury). The majority of pre-clinical myocardial infarction models require the disruption of pericardial integrity with loss of the homeostatic cellular milieu. However, recently a methodology has been developed by us to induce myocardial infarction, which minimizes pericardial damage and retains the heart&#39;s resident immune cell population. An improved cardiac functional recovery in mice with an intact pericardial space following coronary ligation has been observed. This method provides an opportunity to study inflammatory responses in the pericardial space following myocardial infarction. Further development of the labeling techniques can be combined with this model to understand the fate and function of pericardial immune cells in regulating the inflammatory mechanisms that drive remodeling in the heart, including fibrosis.

This protocol outlines the steps for inducing myocardial infarction in mice while preserving the pericardium and its contents.

Um modelo de roedor isquêmico de pericárdio intacto

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to ...

Tissue Preparation Techniques for Contrast-Enhanced Micro Computed Tomography Imaging of Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease

Structural remodeling is a common consequence of chronic pathological stresses imposed on the heart. Understanding the architectural and compositional properties of diseased tissue is critical to determine their interactions with arrhythmic behavior. Microscale tissue remodeling, below the clinical resolution, is emerging as an important source of lethal arrhythmia, with high prevalence in young adults. Challenges remain in obtaining high imaging contrast at sufficient microscale resolution for preclinical models, such as large mammalian whole hearts. Moreover, tissue composition-selective contrast enhancement for three-dimensional high-resolution imaging is still lacking. Non-destructive imaging using micro-computed tomography shows promise for high-resolution imaging. The objective was to alleviate sufferance from X-ray over attenuation in large biological samples. Hearts were extracted from healthy pigs (N = 2), and sheep (N = 2) with either induced chronic myocardial infarction and fibrotic scar formation or induced chronic atrial fibrillation. Excised hearts were perfused with: a saline solution supplemented with a calcium ion quenching agent and a vasodilator, ethanol in serial dehydration, and hexamethyldisilizane under vacuum. The latter reinforced the heart structure during air-drying for 1 week. Collagen-dominant tissue was selectively bound by an X-ray contrast-enhancing agent, phosphomolybdic acid. Tissue conformation was stable in air, permitting long-duration microcomputed tomography acquisitions to obtain high-resolution (isotropic 20.7 &#181;m) images. Optimal contrast agent loading by diffusion showed selective contrast enhancement of the epithelial layer and sub-endocardial Purkinje fibers in healthy pig ventricles. Atrial fibrillation (AF) hearts showed enhanced contrast accumulation in the posterior walls and appendages of the atria, attributed to greater collagen content. Myocardial infarction hearts showed increased contrast selectively in regions of cardiac fibrosis, which enabled the identification of interweaving surviving myocardial muscle fibers. Contrast-enhanced air-dried tissue preparations enabled microscale imaging of the intact large mammalian heart and selective contrast enhancement of underlying disease constituents.

Here, we present a protocol to obtain high resolution micro computed tomography images of healthy and pathological large mammalian whole hearts with collagen-selective contrast enhancement.

Técnicas de preparação de tecidos para imagens de tomografia microcomputante aprimorada de contraste de grandes modelos cardíacos de mamíferos com doença crônica

Structural remodeling is a common consequence of chronic pathological stresses imposed on the heart. Understanding the architectural and compositional ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix biology, there are still major gaps related to how the matrix is formed, how physiological and pathological remodeling differ, and most importantly how matrix dynamics might be manipulated to promote healing and inhibit fibrosis. There is currently no treatment option for controlling, preventing, or reversing cardiac fibrosis. Part of the reason is likely the sheer complexity of cardiac scar formation, such as occurs after myocardial infarction to immediately replace dead or dying cardiomyocytes. The extracellular matrix itself participates in remodeling by activating resident cells and also by helping to guide infiltrating cells to the defunct lesion. The matrix is also a storage locker of sorts for matricellular proteins that are crucial to normal matrix turnover, as well as fibrotic signaling. The matrix has additionally been demonstrated to play an electromechanical role in cardiac tissue. Most techniques for assessing fibrosis are not qualitative in nature, but rather provide quantitative results that are useful for comparing two groups but that do not provide information related to the underlying matrix structure. Highlighted here is a technique for visualizing cardiac matrix ultrastructure. Scanning electron microscopy of decellularized heart tissue reveals striking differences in structure that might otherwise be missed using traditional quantitative research methods.

Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

Microscopia Eletrônica de Varredura do Tecido macerado para visualizar a matriz extracelular

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Biologia

Ultrasound-Guided Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Implantation in Myocardial Infarcted Mice

The key objective of cell therapy after myocardial infarction (MI) is to effectively enhance the cell grafted rate, and human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are a promising cell source for cardiac repair after ischemic damage. However, a low grafted rate is a significant obstacle for effective cardiac tissue regeneration after transplantation. This protocol shows that multiple hiPSC-CM ultrasound-guided percutaneous injections into an MI area effectively increase cell transplantation rates. The study also describes the entire hiPSC-CM culture process, pretreatment, and ultrasound-guided percutaneous delivery methods. In addition, the use of human mitochondrial DNA help detect the absence of hiPSC-CMs in other mouse organs. Lastly, this paper describes the changes in cardiac function, angiogenesis, cell size, and apoptosis at the infarcted border zone in mice 4 weeks after cell delivery. It can be concluded that echocardiography-guided percutaneous injection of the left ventricular myocardium is a feasible, relatively invasive, satisfactory, repeatable, and effective cellular therapy.

Ultrasound-guided cell delivery around the site of myocardial infarction in mice is a safe, effective, and convenient way of cell transplantation.

Implante de Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos por Ultrassom em Camundongos Infartados do Miocárdio

The key objective of cell therapy after myocardial infarction (MI) is to effectively enhance the cell grafted rate, and human induced pluripotent stem ...

An Experimental Model of Myocardial Infarction for Studying Cardiac Repair and Remodeling in Knockout Mice

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. This paper describes a protocol for studying the role of galectin 3 (Gal-3) in the temporal evolution of cardiac healing and remodeling in an experimental animal model of MI. 
The procedures described include an experimental model of MI with a permanent coronary ligature in male C57BL/6J (control) and Gal-3 knockout (KO) mice, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and systolic function in vivo, a histological evaluation of interstitial myocardial fibrosis with picrosirius red-stained and rhodamine-conjugated lectin-stained sections for studying myocyte hypertrophy by the cross-sectional area (MCSA), and the quantification of infarct size and cardiac remodeling (scar thinning, septum thickness, and expansion index) by planimetry in slices stained with Masson's trichrome and triphenyl tetrazolium chloride. Gal-3 KO mice with MI showed disrupted cardiac remodeling and an increase in the scar thinning ratio and the expansion index. At the onset of MI, myocardial function and cardiac remodeling were also severely affected. At 4 weeks post MI, the natural evolution of fibrosis in infarcted Gal-3 KO mice was also affected. 
In summary, the experimental model of MI is a suitable model for studying the temporal evolution of cardiac repair and remodeling in mice with the genetic deletion of Gal-3 and other animal models. The lack of Gal-3 affects the dynamics of cardiac repair and disrupts the evolution of cardiac remodeling and function after MI.

Here, we describe an experimental model of myocardial infarction, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and function, and procedures for quantifying fibrosis and hypertrophy in picrosirius red-stained and rhodamine-stained sections, as well as the infarct size and expansion index in slices stained with Masson's trichrome.

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. ...

Revelando a arquitetura miocárdica das veias pulmonares murinas

Microdissection and Immunofluorescence Staining of Myocardial Sleeves in Murine Pulmonary Veins

Pulmonary veins (PVs) are the major source of ectopic beats in atrial arrhythmias and play a crucial role in the development and progression of atrial fibrillation (AF). PVs contain myocardial sleeves (MS) composed of cardiomyocytes. MS are implicated in the initiation and maintenance of AF, as they preserve similarities to the cardiac working myocardium, including the ability to generate ectopic electrical impulses. Rodents are widely used and may represent excellent animal models to study the pulmonary vein myocardium since cardiomyocytes are widely present all over the vessel wall. However, precise microdissection and preparation of murine PVs is challenging due to the small organ size and intricate anatomy.
We demonstrate a microscopy-guided microdissection protocol for isolating the murine left atrium (LA) together with the PVs. Immunofluorescence staining using cardiac Troponin-T (cTNT) and connexin 43 (Cx43) antibodies is performed to visualize the LA and PVs in full length. Imaging at 10x and 40x magnification provides a comprehensive view of the PV structure as well as detailed insights into the myocardial architecture, particularly highlighting the presence of connexin 43 within the MS.

Autor em destaque: Desenvolvendo um modelo translacional para pesquisa de fibrilação atrial entre espécies 

This protocol demonstrates microscopy-guided isolation and immunofluorescence staining of murine pulmonary veins. We prepare tissue samples containing the left atrium, pulmonary veins, and the corresponding lungs and stain them for cardiac Troponin T and Connexin 43.

Microdissecção e Coloração por Imunofluorescência de Mangas Miocárdicas em Veias Pulmonares Murinas

Pulmonary veins (PVs) are the major source of ectopic beats in atrial arrhythmias and play a crucial role in the development and progression of atrial ...

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Visualização Quantitativa de Infiltrado de Leucócitos em um Modelo Murino de Miocardite Fulminante por Microscopia de Folha de Luz

Clareza refinada baseada em clareza para organização de fibroblasto tridimensional em corações de rato saudáveis e feridos

Um modelo de roedor isquêmico de pericárdio intacto

Técnicas de preparação de tecidos para imagens de tomografia microcomputante aprimorada de contraste de grandes modelos cardíacos de mamíferos com doença crônica

Microscopia Eletrônica de Varredura do Tecido macerado para visualizar a matriz extracelular

Implante de Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos por Ultrassom em Camundongos Infartados do Miocárdio

An Experimental Model of Myocardial Infarction for Studying Cardiac Repair and Remodeling in Knockout Mice

Microdissecção e Coloração por Imunofluorescência de Mangas Miocárdicas em Veias Pulmonares Murinas

Microdissecção e Coloração por Imunofluorescência de Mangas Miocárdicas em Veias Pulmonares Murinas

Microdissecção e Coloração por Imunofluorescência de Mangas Miocárdicas em Veias Pulmonares Murinas