This work was supported by grant 13IRG14560023 from the American Heart Association and NIH grants AI078972 and HL108054 to CJO. Support for AOB was from the NIH National Center for Advancing Translational Sciences NIH ULTR001120, and F31 A110417701.

NOTA: Tutti gli esperimenti del mouse sono stati esaminati e approvati dalla cura degli animali e Istituzionale Usa Comitati presso l&#39;Università del Texas Health Science Center a San Antonio (protocollo # 13032-34-01C). La cura degli animali e protocolli sperimentali aderito Diritto Pubblico 89-544 (Animal Welfare Act) e successivi emendamenti, Servizi pubblici Salute linee guida, e la Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio (US Department of Health &amp; Human Services). 1. Infezione <ol><li> Ottenere topi BALB / c di entrambi i sessi di età compresa tra 10-12 settimane di età tra. GLI APPUNTI. pneumoniae sierotipo 4 ceppo TIGR4 è un isolato clinico virulenta che è stato sequenziato 16. </li><li> Grow TIGR4 in Todd-Hewitt brodo a 37 ° C in 5% CO 2 fino a raggiungere una densità ottica (OD) 620 0,5 (corrispondente a 1,0 x 10 8 unità formanti colonie [CFU] / ml). Pellet cultura pneumococcica mediante centrifugazione per 10 min a 3, 500 xg e rimuovere il supernatante utilizzando una linea del vuoto. Sospendere e diluire batteri con PBS sterile (PBS) ad una concentrazione finale di 1,0 x 10 4 CFU / ml. </li><li> Usando una camera di induzione, anestetizzare topi con 2,5% isoflurano vaporizzato in ossigeno. Confermare stato anestetizzato dal pizzico punta dolce con le pinzette smussate. <ol><li> Tenendo il mouse anestetizzato dal suo nuca e verticale con una mano, iniettare ciascun topo per via intraperitoneale (ip) con 100 microlitri della S. sospensione pneumoniae usando una siringa con un ago calibro 27-30 (corrispondente ad una dose di 1,0 x 10 3 CFU). Posizionare la parte posteriore del mouse nella sua gabbia. I topi in genere risvegliano 30-40 secondi dopo l&#39;iniezione. </li></ol></li><li> Lasciare che l&#39;infezione di procedere per almeno 24 (presto) o 30 (avanzato) h. <ol><li> Euthanize i topi da CO 2 asfissia. Eseguire dislocazione cervicale per garantire il mouse è deceduto. L&#39;eutanasia è ulteriormente confermata dalla rimozionedel cuore nel passo 1.6. </li></ol></li><li> Disinfettare la coda con un batuffolo imbevuto di alcool e tagliare una sezione di 2-3 mm. Raccogliere 2 ml di sangue e serialmente diluire il sangue 10 volte in PBS contenente eparina sodica 1 U / ml cinque volte. Diluizioni seriali piastra su un piatto trittico di agar sangue soia e incubare una notte a 37 ° C in 5% CO 2. Il giorno successivo estrapolare dalla colonia conta il livello di batteriemia. </li><li> Immobilizzare il mouse in posizione supina su una piattaforma chirurgica. Spruzzare il petto con il 70% di etanolo e asciugare. Utilizzando forbici chirurgiche e pinze aprire la cavità toracica, rimuovere la gabbia toracica, e transetto il diaframma per esporre il cuore ei polmoni. Utilizzando forbici tagliare i vasi sanguigni collegati al cuore e alle accise delicatamente cuore con cura per evitare lividi con una pinza. </li><li> Sciacquare il cuore con PBS e poi mettere in campioni di tessuto cassette di raccolta di tali sezioni coronali che sarebbero stati ottenuti durante il sezionamento dei tessuti. Per embedding di paraffina, plaCe le cassette in soluzione al 10% di formalina tamponata-e il giorno successivo invio per paraffina. <ol><li> In alternativa freeze flash utilizzando ottobre Compound entro un cryomold che è stato immesso sul ghiaccio secco. </li></ol></li></ol> 2. Visualizzazione cardiache lesioni e pneumococchi all&#39;interno lesioni <ol><li> Ridurre le sezioni cardiache in paraffina tale che i 4 camere del cuore sono visibili in ogni sezione di tessuto. Tagliare vetrini a spessore di 5 micron. </li><li> Deparaffinare e macchia diapositive con ematossilina e eosina (H &amp; E) usando metodi standard 17. </li><li> Vista H &amp; E macchiato sezioni cardiache utilizzando un microscopio ottico a bassa (100X, 200X) e alta (immersione in olio: 400X, 1,000X) ingrandimenti. Caratterizzare cuori per la presenza di microlesioni nel miocardio. Qui, l&#39;acquisizione di H &amp; E le immagini utilizzando un microscopio Zeiss Axioskop 2 dotato di 100X 1.3 numerica obiettivo dell&#39;apertura Plan-Neofluar. NOTA: nelle fasi iniziali l cardiacoesions sono discriminati per il loro aspetto colorato differenziale e in alcuni casi la presenza di cellule immunitarie (monociti e granulociti) che sembrano essere monociti. In lesioni avanzate, in particolare quelli visti a 30 ore, le cellule immunitarie sono lesioni vacuolo come assenti e grandi sono stati osservati nel loro posto. È importante notare che, mentre afflusso cellule immunitarie durante le prime fasi di sviluppo lesione cardiaca può verificarsi non risulta essere un requisito. </li></ol> 3. immunofluorescente Microscopia per pneumococchi all&#39;interno microlesioni <ol><li> Cuore Sezione in cryomolds con microtomo ad uno spessore di 5 sezioni micron e posto su vetrino carica positiva. Consenti sezioni cardiache decongelamento e aria secca. Fissare sezioni per 10 min a 10% formalina tamponata neutra (pH 6.8-7.2 a 25 ° C). </li><li> Lavare slitte (3x) in PBS per 5 min, permeabilize per 15 min in 0,2% Triton X-100 in PBS, poi lavare di nuovo in PBS. </li><li> Secti tessuto Block<html> su su vetrini con siero di capra 10% in PBS per 1 ora. </li><li> Sciacquare i vetrini con PBS, coperchio e incubare sezioni cardiache con coniglio anti-pneumococco sierotipo 4 antisiero a 1: 1000 in PBS con siero di capra 10% per 2 ore a 37 ° C. NOTA: Per i controlli negativi investigatori dovrebbero utilizzare antisiero di coniglio ingenuo </li><li> Dopo lavaggio con PBS, coperchio e incubare sezioni con 10% di siero di capra-PBS con capra anti-coniglio FITC anticorpo coniugato a 1: 2.000 per 30 min a 37 ° C. </li><li> Seguendo le istruzioni del produttore, utilizzare DAPI (4 &#39;, 6 Diamidino-2-fenilindolo) a 5 mg / ml per la visualizzazione dei nuclei eucariotiche. Lavare e montare sezioni di tessuto con FluorSave. </li><li> Acquisire le immagini fluorescenti utilizzando un sistema di microscopio confocale sia a bassa che ad alta ingrandimento. Regolare l&#39;apertura numerica di conseguenza per ottenere risultati ottimali. Qui, acquisire immagini fluorescenti utilizzando un sistema confocale con un obiettivo 60X apertura numerica 1.42. </li></ol>&quot;&gt; 4. Antibiotica Salvataggio di Mice Septic <ol><li> Inizia con i topi infettati con ip 1.0 x 10 3 CFU di TIGR4 come precedentemente indicato al punto 1. </li><li> Con inizio alle 30 ore dopo l&#39;infezione, amministrare grado farmaceutico ampicillina ip (80 mg / kg di peso corporeo) in 100 ml di soluzione salina ogni 12 ore per 36 ore. Raccogliere i cuori al punto desiderato e di processo come descritto al punto 1.6 per paraffina e il tessuto, il sezionamento. </li></ol> 5. deposizione di collagene Detection <ol><li> Utilizzando xilene e lavaggi alcol classificati con acqua, Deparaffinare e idratare le sezioni di tessuto deionizzata utilizzando metodi standard 17. Trattare sezioni con acquosa 0,2% di acido fosfomolibdico per 5 minuti e risciacquare con acqua deionizzata per 5 min. </li><li> Sezioni Macchia con 0,1% di Sirius Red in acido picrico per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le sezioni in 0,01 N acido cloridrico per 3 minuti e risciacquare con etanolo al 70% per 1 min. </li><li> DisidratazioneTE sezioni con l&#39;identico ma l&#39;ordine di lavaggi a quello delineato in 5.1 invertire, disidratare le sezioni cardiache in aumento e graduale delle concentrazioni di etanolo poi xilene. </li><li> Sezioni di Monte di tessuto con una soluzione di montaggio per la valutazione microscopica. </li><li> Per identificare le regioni di deposizione di collagene, esaminare sezioni di tessuto colorate per le zone di profonda colorazione lettura in condizioni di scarsa e alto ingrandimento con un microscopio ottico. Ogni area all&#39;interno dei ventricoli del cuore che è il rosso è un settore in cui il collagene è stato depositato. Aree senza questa macchia rosso sono siti di tessuto sano privi deposizione di collagene. Qui, acquisire Picro Sirius Red immagini colorate utilizzando un microscopio equipaggiato con un obiettivo apertura numerica 20X 0.5. NOTA: Le macchie rosse Atrium in tessuti sani. </li></ol>

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	<li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+complications+in+patients+with+community-acquired+pneumonia:+incidence,+timing,+risk+factors,+and+association+with+short-term+mortality.">Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: incidence, timing, risk factors, and association with short-term mortality.</a> Circulation. 125, 773-781 (2012).</li><li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+bacterial+pneumonia+is+associated+with+the+occurrence+of+acute+coronary+syndromes.">Acute bacterial pneumonia is associated with the occurrence of acute coronary syndromes.</a> Medicine (Baltimore). 88, 154-159 (2009).</li><li>Corrales-Medina, V. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+receptor+initiates+bacterial+contact+with+the+blood+brain+barrier+in+experimental+meningitis+models.">Laminin receptor initiates bacterial contact with the blood brain barrier in experimental meningitis models.</a> The Journal of Clinical Investigation. 119, 1638-1646 (2009).</li><li>Flick, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+elimination+of+the+binding+motif+on+fibrinogen+for+the+S.+aureus+virulence+factor+ClfA+improves+host+survival+in+septicemia.">Genetic elimination of the binding motif on fibrinogen for the S. aureus virulence factor ClfA improves host survival in septicemia.</a> Blood. 121, 1783-1794 (2013).</li><li>Cheng, A. G., DeDent, A. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+risk+for+ventricular+tachyarrhythmias+and+sudden+cardiac+death:+is+there+a+role+for+cardiac+MRI.">Assessing risk for ventricular tachyarrhythmias and sudden cardiac death: is there a role for cardiac MRI.</a> Circ Cardiovasc Imaging. 5, 2-5 (2012).</li><li>Tettelin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+a+virulent+isolate+of+Streptococcus+pneumoniae.">Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae.</a> Science. 293, 498-506 (2001).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections.">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li></ol>

The authors declare no conflict of interest in this study.

In questo rapporto, un metodo altamente riproducibile per indurre S. pneumoniae mediata microlesioni cardiaci nei topi durante IPD e le tecniche per la loro visualizzazione è dimostrata. I topi sono infettati con una dose di batteri che supera la soglia del sistema immunitario di attestazione, portando a batteriemia alta qualità, simile a quella che si verifica durante la sepsi umana, e conduce ad eventuali traslocazione batterica nel miocardio. Per ragioni ancora sconosciute, S. pneumoniae nel cuore...

Ricovero di adulti per polmonite acquisita in comunità (CAP) comporta un rischio documentato per eventi avversi cardiaci che contribuisce alla mortalità 1-4. In un recente studio condotto da Corrales-Medina et al. Sono risultati associati con e / o responsabile del 27% dei decessi polmonite associata 3 complicazioni cardiache. Streptococcus pneumoniae (pneumococco), la causa più comune di PAC e sepsi 5, è stata direttamente associata ad eventi avversi cardiaci a ben il 19% dei pazienti adulti ricoverati 6. Eventi cardiaci avversi associati con polmonite includono insufficienza nuovo o peggiorata cardiaco congestizio, aritmie, infarto del miocardio e in ordine decrescente di frequenza 6. In un recente articolo PLoS Pathogens da Brown et al., S. pneumoniae è risultata capace di traslocazione attraverso l&#39;endotelio vascolare cardiaca, l&#39;ingresso nel myocardium, e la formazione di discrete lesioni microscopiche non purulente (microlesioni) pieni di batteri nei ventricoli durante la malattia pneumococcica invasiva (IPD) 7. Prove di formazione microlesion cardiaca è stata osservata in campioni cardiaci dai primati non umani e gli individui che avevano ceduto alle infezioni da pneumococco. Allo stesso modo, i topi infettati sperimentalmente riproducibile sviluppato microlesioni cardiaci. Nei topi, le dimensioni e il numero microlesion stata positivamente correlata con la durata e la gravità di batteriemia, livelli di troponina cardiaca nel siero, e aberrante elettrofisiologia cardiaca. Traslocazione batterica nel cuore è stato trovato per avvenire attraverso gli stessi meccanismi responsabili traslocazione del pneumococco attraverso la barriera emato-encefalica e lo sviluppo della meningite pneumococcica, vale a dire, la proteina-Colina legame Un&#39;invasione mediata delle cellule endoteliali vascolari in un recettore laminina e piastrine modo dipendente recettore del fattore di -activating 8. Microlesformazione di ioni richiesto anche il pneumococco formano pori tossina pneumolysin che è stato trovato per uccidere cardiomiociti 7. Microlesioni cardiaci pneumococco sono distinti dal purulenta dei tessuti molli e ascessi cardiaci che sono causate da altri batteri Gram-positivi, tra cui Staphylococcus aureus. Questi sono caratterizzati da un unico foci di batteri circondato da neutrofili e deposizione di fibrina 9,10. Microlesioni formata da S. pneumoniae sono di dimensioni più piccole, distribuiti su tutto il cuore colpito, e la mancanza di infiltrati di cellule immunitarie. Durante le prime fasi dell&#39;infezione, microlesioni causate da S. pneumoniae appaiono come aree di tessuto danneggiato o infiammato ricorda i segni patologici di cardiomiopatia. Alcuni monociti possono essere osservati durante questo tempo, ma la loro presenza è di breve durata e lesioni rapidamente diventa necrotico nell&#39;aspetto e riempito con batteri contemporaneamente continuando a grow dimensioni fino alla morte dell&#39;animale o interventi antimicrobica. È importante sottolineare che, entro 3 giorni di intervento antibiotico, profusa infiltrazione di cellule immunitarie si osserva presso l&#39;ex sede della lesione e questo è accompagnato da una robusta deposizione di collagene. Simile rimodellamento cardiaco è stato riscontrato dopo infarto insieme con conseguenze permanenti sulla funzione cardiaca 11-15. Così, microlesioni sono una potenziale spiegazione per gli eventi avversi cardiaci che si verificano durante IPD e forse la maggiore incidenza di mortalità cardiaca correlata in individui di convalescenza che sono sopravvissuti l&#39;episodio di malattia. Qui, l&#39;istruzione è disponibile sul modello sperimentale murino di IPD e formazione della lesione cardiaca e la visualizzazione delle microlesioni cardiaci a precoci e tardive fasi dell&#39;infezione. Il protocollo per la rilevazione di deposizione di collagene in animali che sono stati salvati da un intervento antimicrobico è dimostrata. L&#39;obiettivo di questo articolo è quello di facilitate ricerca di altri investigatori su questo importante e nuova patologia pneumococcica.

<table><tbody><tr><td>Todd-Hewitt broth&amp;nbsp;</td><td>Neogen</td><td>7161A</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T Compound&amp;nbsp;</td><td>Tissue-Tek (Sakura Finetek)&amp;nbsp;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific (Acros)</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td></td></tr><tr><td>anti-serotype 4 pneumococcus antiserum&amp;nbsp;</td><td>Statens Serum Institut</td><td>16747</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-rabbit FITC conjugated antibody&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-096-144</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Fluorsave</td><td>Millipore</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>S70104</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9393</td><td></td></tr><tr><td>phosphomolybdic acid 0.2%&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>26357-01</td><td></td></tr><tr><td>0.1% Sirius Red in picric acid&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>26357-02</td><td></td></tr><tr><td>0.01 N hydrochloric acid&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>26357-03</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tack Microscope Slides</td><td>Polysciences, Inc</td><td>24216</td><td></td></tr><tr><td>Paralube Vet Ointment</td><td>Dechra</td><td>12920060</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin and Eosin Staining Kit</td><td>unspeciified&amp;nbsp;</td><td></td><td>Standard</td></tr></tbody></table>

visualization of streptococcus pneumoniae within cardiac microlesions and subsequent cardiac remodeling

Durante batteriemia Streptococcus pneumoniae può traslocare attraverso l&#39;endotelio vascolare nel miocardio e formare batteri-riempite discrete lesioni microscopiche (microlesioni) che sono notevoli per l&#39;assenza di infiltrarsi cellule immunitarie. Grazie alla loro rilascio di prodotti cardiotossici, S. pneumoniae entro microlesioni si pensa di contribuire allo scompenso cardiaco che è spesso osservato durante fulminato malattia pneumococcica invasiva negli adulti. Qui è dimostrato un protocollo per infezione sperimentale del mouse che porta alla formazione di riproducibili microlesion cardiaco entro 30 ore. L&#39;istruzione è fornita sull&#39;identificazione microlesion in ematossilina e eosina sezioni cuore colorato e le distinzioni morfologiche tra inizio e fine microlesioni sono evidenziati. L&#39;istruzione è fornita su un protocollo per la verifica di S. pneumoniae entro microlesioni utilizzando anticorpi contro pneumococco polisaccaride della capsula emicroscopia a immunofluorescenza. Infine, è previsto un protocollo di intervento antibiotico che salva i topi infetti e per l&#39;individuazione e la valutazione di formazione della cicatrice nel cuore dei topi convalescente. Insieme, questi protocolli faciliteranno lo studio dei meccanismi molecolari alla base dell&#39;invasione cardiaco pneumococco, la morte dei cardiomiociti, rimodellamento cardiaco a seguito di esposizione a S. pneumoniae, e la risposta immunitaria al pneumococchi nel cuore.

Visualizzazione di microlesioni da H &amp; E Microlesioni cardiaci sono stati osservati nei ventricoli di H &amp; E macchiato sezioni cardiache di topo con IPD seguenti la loro sfida ip con TIGR4. Figura 1 dimostra l&#39;aumento delle dimensioni di queste lesioni tra 24 e 30 ore dopo l&#39;infezione (HPI), con maggior numero di ematossilina -stained (cioè, viola-blu) pneumococchi visibile all&#39;interno della lesione. Microlesioni sono stati caratterizzat...

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Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals.

Visualizzazione<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Entro cardiache microlesioni e successive rimodellamento cardiaco

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

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Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

8.9K Views.  The University of Texas Health Science Center at San Antonio. Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals. 

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Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

Visualizzazione quantitativa di leucociti infiltrati in un modello di murina della miocardite fulminante mediante microscopia a foglio chiaro

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

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Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ventricular stiffness with altered cardiac function. This increase in cardiac ventricular fibrosis is due to activation of resident fibroblasts, although how these cells operate within the 3-dimensional (3-D) heart, at baseline or after activation, is not well understood. To examine how fibroblasts contribute to heart disease and their dynamics in the 3-D heart, a refined CLARITY-based tissue clearing and imaging method was developed that shows fluorescently labeled cardiac fibroblasts within the entire mouse heart. Tissue resident fibroblasts were genetically labeled using Rosa26-loxP-eGFP florescent reporter mice crossed with the cardiac fibroblast expressing Tcf21-MerCreMer knock-in line. This technique was used to observe fibroblast localization dynamics throughout the entire adult left ventricle in healthy mice and in fibrotic mouse models of heart disease. Interestingly, in one injury model, unique patterns of cardiac fibroblasts were observed in the injured mouse heart that followed bands of wrapped fibers in the contractile direction. In ischemic injury models, fibroblast death occurred, followed by repopulation from the infarct border zone. Collectively, this refined cardiac tissue clarifying technique and digitized imaging system allows for 3-D visualization of cardiac fibroblasts in the heart without the limitations of antibody penetration failure or previous issues surrounding lost fluorescence due to tissue processing.

A refined method of tissue clearing was developed and applied to the adult mouse heart. This method was designed to clear dense, autofluorescent cardiac tissue, while maintaining labeled fibroblast fluorescence attributed to a genetic reporter strategy.

Raffinata compensazione dei tessuti basata su CLARITY per l'organizzazione tridimensionale dei fibroblasti nei cuori di topo sani e feriti

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to induce myocardial injury). The majority of pre-clinical myocardial infarction models require the disruption of pericardial integrity with loss of the homeostatic cellular milieu. However, recently a methodology has been developed by us to induce myocardial infarction, which minimizes pericardial damage and retains the heart&#39;s resident immune cell population. An improved cardiac functional recovery in mice with an intact pericardial space following coronary ligation has been observed. This method provides an opportunity to study inflammatory responses in the pericardial space following myocardial infarction. Further development of the labeling techniques can be combined with this model to understand the fate and function of pericardial immune cells in regulating the inflammatory mechanisms that drive remodeling in the heart, including fibrosis.

This protocol outlines the steps for inducing myocardial infarction in mice while preserving the pericardium and its contents.

Un modello di roditore ischemico del pericardio intatto

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to ...

Tissue Preparation Techniques for Contrast-Enhanced Micro Computed Tomography Imaging of Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease

Structural remodeling is a common consequence of chronic pathological stresses imposed on the heart. Understanding the architectural and compositional properties of diseased tissue is critical to determine their interactions with arrhythmic behavior. Microscale tissue remodeling, below the clinical resolution, is emerging as an important source of lethal arrhythmia, with high prevalence in young adults. Challenges remain in obtaining high imaging contrast at sufficient microscale resolution for preclinical models, such as large mammalian whole hearts. Moreover, tissue composition-selective contrast enhancement for three-dimensional high-resolution imaging is still lacking. Non-destructive imaging using micro-computed tomography shows promise for high-resolution imaging. The objective was to alleviate sufferance from X-ray over attenuation in large biological samples. Hearts were extracted from healthy pigs (N = 2), and sheep (N = 2) with either induced chronic myocardial infarction and fibrotic scar formation or induced chronic atrial fibrillation. Excised hearts were perfused with: a saline solution supplemented with a calcium ion quenching agent and a vasodilator, ethanol in serial dehydration, and hexamethyldisilizane under vacuum. The latter reinforced the heart structure during air-drying for 1 week. Collagen-dominant tissue was selectively bound by an X-ray contrast-enhancing agent, phosphomolybdic acid. Tissue conformation was stable in air, permitting long-duration microcomputed tomography acquisitions to obtain high-resolution (isotropic 20.7 &#181;m) images. Optimal contrast agent loading by diffusion showed selective contrast enhancement of the epithelial layer and sub-endocardial Purkinje fibers in healthy pig ventricles. Atrial fibrillation (AF) hearts showed enhanced contrast accumulation in the posterior walls and appendages of the atria, attributed to greater collagen content. Myocardial infarction hearts showed increased contrast selectively in regions of cardiac fibrosis, which enabled the identification of interweaving surviving myocardial muscle fibers. Contrast-enhanced air-dried tissue preparations enabled microscale imaging of the intact large mammalian heart and selective contrast enhancement of underlying disease constituents.

Here, we present a protocol to obtain high resolution micro computed tomography images of healthy and pathological large mammalian whole hearts with collagen-selective contrast enhancement.

Tecniche di preparazione dei tessuti per l'imaging micromografico computerizzato con contrasto di modelli cardiaci di mammiferi di grandi dimensioni con malattia cronica

Structural remodeling is a common consequence of chronic pathological stresses imposed on the heart. Understanding the architectural and compositional ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix biology, there are still major gaps related to how the matrix is formed, how physiological and pathological remodeling differ, and most importantly how matrix dynamics might be manipulated to promote healing and inhibit fibrosis. There is currently no treatment option for controlling, preventing, or reversing cardiac fibrosis. Part of the reason is likely the sheer complexity of cardiac scar formation, such as occurs after myocardial infarction to immediately replace dead or dying cardiomyocytes. The extracellular matrix itself participates in remodeling by activating resident cells and also by helping to guide infiltrating cells to the defunct lesion. The matrix is also a storage locker of sorts for matricellular proteins that are crucial to normal matrix turnover, as well as fibrotic signaling. The matrix has additionally been demonstrated to play an electromechanical role in cardiac tissue. Most techniques for assessing fibrosis are not qualitative in nature, but rather provide quantitative results that are useful for comparing two groups but that do not provide information related to the underlying matrix structure. Highlighted here is a technique for visualizing cardiac matrix ultrastructure. Scanning electron microscopy of decellularized heart tissue reveals striking differences in structure that might otherwise be missed using traditional quantitative research methods.

Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

Scanning Electron Microscopy di tessuto macerato di visualizzare la matrice extracellulare

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Biologia

Ultrasound-Guided Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Implantation in Myocardial Infarcted Mice

The key objective of cell therapy after myocardial infarction (MI) is to effectively enhance the cell grafted rate, and human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are a promising cell source for cardiac repair after ischemic damage. However, a low grafted rate is a significant obstacle for effective cardiac tissue regeneration after transplantation. This protocol shows that multiple hiPSC-CM ultrasound-guided percutaneous injections into an MI area effectively increase cell transplantation rates. The study also describes the entire hiPSC-CM culture process, pretreatment, and ultrasound-guided percutaneous delivery methods. In addition, the use of human mitochondrial DNA help detect the absence of hiPSC-CMs in other mouse organs. Lastly, this paper describes the changes in cardiac function, angiogenesis, cell size, and apoptosis at the infarcted border zone in mice 4 weeks after cell delivery. It can be concluded that echocardiography-guided percutaneous injection of the left ventricular myocardium is a feasible, relatively invasive, satisfactory, repeatable, and effective cellular therapy.

Ultrasound-guided cell delivery around the site of myocardial infarction in mice is a safe, effective, and convenient way of cell transplantation.

Impianto di cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte ecoguidate in topi infartuati miocardici

The key objective of cell therapy after myocardial infarction (MI) is to effectively enhance the cell grafted rate, and human induced pluripotent stem ...

An Experimental Model of Myocardial Infarction for Studying Cardiac Repair and Remodeling in Knockout Mice

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. This paper describes a protocol for studying the role of galectin 3 (Gal-3) in the temporal evolution of cardiac healing and remodeling in an experimental animal model of MI. 
The procedures described include an experimental model of MI with a permanent coronary ligature in male C57BL/6J (control) and Gal-3 knockout (KO) mice, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and systolic function in vivo, a histological evaluation of interstitial myocardial fibrosis with picrosirius red-stained and rhodamine-conjugated lectin-stained sections for studying myocyte hypertrophy by the cross-sectional area (MCSA), and the quantification of infarct size and cardiac remodeling (scar thinning, septum thickness, and expansion index) by planimetry in slices stained with Masson's trichrome and triphenyl tetrazolium chloride. Gal-3 KO mice with MI showed disrupted cardiac remodeling and an increase in the scar thinning ratio and the expansion index. At the onset of MI, myocardial function and cardiac remodeling were also severely affected. At 4 weeks post MI, the natural evolution of fibrosis in infarcted Gal-3 KO mice was also affected. 
In summary, the experimental model of MI is a suitable model for studying the temporal evolution of cardiac repair and remodeling in mice with the genetic deletion of Gal-3 and other animal models. The lack of Gal-3 affects the dynamics of cardiac repair and disrupts the evolution of cardiac remodeling and function after MI.

Here, we describe an experimental model of myocardial infarction, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and function, and procedures for quantifying fibrosis and hypertrophy in picrosirius red-stained and rhodamine-stained sections, as well as the infarct size and expansion index in slices stained with Masson's trichrome.

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. ...

Rivelatore dell'architettura miocardica delle vene polmonari murine

Microdissection and Immunofluorescence Staining of Myocardial Sleeves in Murine Pulmonary Veins

Pulmonary veins (PVs) are the major source of ectopic beats in atrial arrhythmias and play a crucial role in the development and progression of atrial fibrillation (AF). PVs contain myocardial sleeves (MS) composed of cardiomyocytes. MS are implicated in the initiation and maintenance of AF, as they preserve similarities to the cardiac working myocardium, including the ability to generate ectopic electrical impulses. Rodents are widely used and may represent excellent animal models to study the pulmonary vein myocardium since cardiomyocytes are widely present all over the vessel wall. However, precise microdissection and preparation of murine PVs is challenging due to the small organ size and intricate anatomy.
We demonstrate a microscopy-guided microdissection protocol for isolating the murine left atrium (LA) together with the PVs. Immunofluorescence staining using cardiac Troponin-T (cTNT) and connexin 43 (Cx43) antibodies is performed to visualize the LA and PVs in full length. Imaging at 10x and 40x magnification provides a comprehensive view of the PV structure as well as detailed insights into the myocardial architecture, particularly highlighting the presence of connexin 43 within the MS.

Autore in primo piano: Sviluppo di un modello traslazionale per la ricerca sulla fibrillazione atriale in tutte le specie 

This protocol demonstrates microscopy-guided isolation and immunofluorescence staining of murine pulmonary veins. We prepare tissue samples containing the left atrium, pulmonary veins, and the corresponding lungs and stain them for cardiac Troponin T and Connexin 43.

Microdissezione e colorazione in immunofluorescenza di manicotti miocardici nelle vene polmonari murine

Pulmonary veins (PVs) are the major source of ectopic beats in atrial arrhythmias and play a crucial role in the development and progression of atrial ...

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Visualizzazione quantitativa di leucociti infiltrati in un modello di murina della miocardite fulminante mediante microscopia a foglio chiaro

Raffinata compensazione dei tessuti basata su CLARITY per l'organizzazione tridimensionale dei fibroblasti nei cuori di topo sani e feriti

Un modello di roditore ischemico del pericardio intatto

Tecniche di preparazione dei tessuti per l'imaging micromografico computerizzato con contrasto di modelli cardiaci di mammiferi di grandi dimensioni con malattia cronica

Scanning Electron Microscopy di tessuto macerato di visualizzare la matrice extracellulare

Impianto di cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte ecoguidate in topi infartuati miocardici

An Experimental Model of Myocardial Infarction for Studying Cardiac Repair and Remodeling in Knockout Mice

Microdissezione e colorazione in immunofluorescenza di manicotti miocardici nelle vene polmonari murine

Microdissezione e colorazione in immunofluorescenza di manicotti miocardici nelle vene polmonari murine

Microdissezione e colorazione in immunofluorescenza di manicotti miocardici nelle vene polmonari murine