This work was supported by grant 13IRG14560023 from the American Heart Association and NIH grants AI078972 and HL108054 to CJO. Support for AOB was from the NIH National Center for Advancing Translational Sciences NIH ULTR001120, and F31 A110417701.

注：すべてのマウス実験は、サンアントニオ（プロトコル＃の13032-34-01C）でのテキサス大学健康科学センターで施設内動物管理使用委員会によって審査され、承認された。動物のケアと公法89から544（動物福祉法）とその改正、公衆衛生サービスガイドライン、および実験動物の管理と使用に関する指針（ヘルス＆ヒューマンサービスの米国務省）に付着した実験プロトコル。 1.感染<ol><li>生後10〜12週齢の間に男女両方のBALB / cマウスを入手します。 注：S. ·ニューモニエ血清型4株をTIGR4は16を配列決定されている毒性の臨床分離株である。 </li><li>光学密度（OD）0.5の620に達するまで、5％CO 2中37℃でトッド-ヒューイットブロス中TIGR4を成長（1.0×10 8コロニー形成単位[CFU] / mlに相当する）。 3で10分間遠心分離することにより肺炎球菌文化をペレット、500 XG及び真空ラインを用いて上清を除去します。サスペンドおよび1.0×10 4 CFU / mlの最終濃度に滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細菌を希釈する。 </li><li>誘導チャンバーを用いて、酸素中の2.5％イソフルラン気化を有するマウスを麻酔。鈍ピンセットで穏やかな足指のピンチで麻酔状態を確認してください。 <ol><li>その首筋により麻酔マウスを保持し、片手で直立、Sの100μlの腹腔内（IP）を各マウスを注入ニューモニエ懸濁液 （1.0×10 3 CFUのチャレンジ用量に相当する）27〜30ゲージ針で注射器を使用して。バックそのケージにマウスを置きます。マウスは、通常、注射後30〜40秒を目覚めさせる。 </li></ol></li><li>感染が少なくとも24（早期）または30（高度な）時間進行させる。 <ol><li> CO 2窒息によりマウスを安楽死させる。マウスが死亡していることを確認するために頸椎脱臼を行います。安楽死は、さらに除去することによって確認されるステップ1.6で心の。 </li></ol></li><li>アルコール綿棒で尾を消毒2-3 mmのセクションを切り取る。血の2μlのを収集し、連続的に1 U / mlの5回ヘパリンナトリウムを含むPBS中の血液10倍に希釈する。トリプシン大豆血液寒天プレート上にプレート連続希釈し、5％、37℃で一晩インキュベートするコロニーから次の日の外挿2. COは菌血症のレベルをカウントします。 </li><li>外科プラットフォーム上で仰臥位でマウスを固定化。 70％エタノールとパットの乾燥と胸をスプレーしてください。外科用ハサミとピンセットを使用すると、胸腔を開き、胸郭を削除し、心臓や肺を露出するダイアフラムを横断する。ハサミを使用すると、心臓に接続され、血管をカットし、静かにピンセットであざないように注意して心を切り出す。 </li><li> PBSで心を洗い流してから冠状切片が組織切片中に得られるであろうような組織検体採取カセットに入れる。パラフィン包埋、ナンプラーのためにCE 10％緩衝ホルマリン液と次の日におけるカセットは、パラフィン包埋のために送る。 <ol><li>あるいは、ドライアイス上に置かれたクリオモールド内のOCT化合物を用いたフラッシュ凍結。 </li></ol></li></ol>心臓病変および病変内の肺炎球菌の2可視化<ol><li>心臓の4室はそれぞれの組織切片に表示されているようなパラフィン包埋心臓切片を切り倒し。 5μmの厚さでスライドをカット。 </li><li>標準的な方法17を用いて、ヘマトキシリン＆エオシン（H＆E）を用いて脱パラフィン化し、染色スライド。 </li><li>倍率：ビューH＆Eは、低（100X、200X）と高（400X、1,000倍油浸）で光顕微鏡を用いて心臓の部分を染色した。心筋におけるmicrolesionsの存在を心を特徴づける。ここでは、100X 1.3の開口数を計画-NEOFLUARの目標を装備したツァイスAxioskopを2顕微鏡を用いて、H＆E画像を取得する。 注：初期の段階では、心臓のLesionsは、免疫細胞、単球のように見えるもの（単球および顆粒球）の存在下でそれらの差に着色外観によって、場合によっては区別される。進行した病変、30時間で見られる特にでは、免疫細胞が存在せず、大液胞様病変は、その場所で観察されているされている。これは、心臓の病変発生の初期段階での免疫細胞の流入が起こることができるが、それは必要条件ではないように注意することが重要である。 </li></ol> Microlesions内肺炎球菌3.免疫蛍光顕微鏡<ol><li>正に荷電したガラススライド上に5μmのと場所セクションの厚さにミクロトームとcryomoldsのセクション心。凍結された心臓の項では、解凍し、空気乾燥することができます。 10％中性緩衝ホルマリン（25℃でのpHは6.8〜7.2）で10分間のセクションを修正。 </li><li> PBS中0.2％トリトンX-100で15分間透過化、5分間、PBS中のスライド（3×）で洗浄し、次にPBSで再び洗浄する。 </li><li>ブロック組織secti<html> 1時間、PBS中10％ヤギ血清を含むスライド上に。 </li><li> PBSでスライドをすすぎ、カバーと1でウサギ抗血清型4肺炎球菌抗血清を用いて心臓のセクションをインキュベート：PBS中で千37℃で2時間、10％ヤギ血清で。 注：ネガティブコントロールのために研究者らは、ナイーブウサギ抗血清を使用する必要があります</li><li> 37℃で30分間、2000：1で、ヤギ抗ウサギFITCコンジュゲート抗体を、10％ヤギ血清をPBSで切片をPBS、カバーで洗浄し、インキュベートした。 </li><li>製造業者の指示に続いて、真核生物の核の​​可視化のために5mg / mlのDAPI（4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）を使用する。 FluorSaveで組織切片を洗浄し、マウントします。 </li><li>低及び高の両方の倍率で共焦点顕微鏡システムを用いた蛍光画像を取得する。最適な結果を得るために、それに応じて開口数を調整します。ここでは、60X 1.42開口数の対物レンズで共焦点システムを用いた蛍光画像を取得する。 </li></ol>敗血症のマウスの &quot;&gt; 4。抗生物質レスキュー<ol><li>マウスで始まる以前に、ステップ1で示したようにTIGR4の1.0×10 3 CFU を腹腔に感染。 </li><li> 30時間感染後で開始し、100μlの生理食塩水に36時間ごとに12時間を医薬品グレードのアンピシリンIP（80 mg / kg体重）を管理。パラフィン包埋組織、切片のためのステップ1.6で説明したように所望の時点とプロセスでの心を収集します。 </li></ol> 5.コラーゲン沈着の検出<ol><li>キシレンを使用して、標準的な方法17を使用して、脱イオン水、脱パラフィンおよび水和物組織切片をアルコールでの洗浄を段階的。 5分間、水、0.2％リンモリブデン酸とのセクションを治療し、5分間脱イオン水ですすいでください。 </li><li>室温で2時間、ピクリン酸中の0.1％シリウスレッドによる染色切片。 </li><li> 3分間の0.01 N塩酸のセクションを洗浄し、1分間、70％エタノールを用いてすすぐ。 </li><li> Dehydra次いで、キシレンを使用して、同一のセクションをteのが、5.1に概説されたものに洗浄の順序を逆にする、エタノールの濃度を増加させ、段階的に、心臓切片を脱水する。 </li><li>顕微鏡的評価のためのマウントソリューションでマウント組織切片。 </li><li>コラーゲン沈着の領域を同定するために、光学顕微鏡を用いて、低域と高倍率で深い読み取り染色の領域について染色した組織切片を調べる。赤である心臓の心室内の任意の領域は、コラーゲンが堆積された領域である。この赤い染みのない領域はコラーゲン沈着を欠いている健康な組織のサイトです。本明細書において、Picroシリウスレッドを取得するには、20X 0.5開口数の対物レンズを備えた顕微鏡を用いて画像を染色した。 注：健常組織における赤アトリウムの汚れ。 </li></ol>

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	<li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+complications+in+patients+with+community-acquired+pneumonia:+incidence,+timing,+risk+factors,+and+association+with+short-term+mortality.">Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: incidence, timing, risk factors, and association with short-term mortality.</a> Circulation. 125, 773-781 (2012).</li><li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+bacterial+pneumonia+is+associated+with+the+occurrence+of+acute+coronary+syndromes.">Acute bacterial pneumonia is associated with the occurrence of acute coronary syndromes.</a> Medicine (Baltimore). 88, 154-159 (2009).</li><li>Corrales-Medina, V. 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Mayo Clin.</a> Proc. 89, 60-68 (2014).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+11+common+viral+and+bacterial+pathogens+causing+community-acquired+pneumonia+or+sepsis+in+asymptomatic+patients+by+using+a+multiplex+reverse+transcription-PCR+assay+with+manual+(enzyme+hybridization)+or+automated+(electronic+microarray)+detection.">Detection of 11 common viral and bacterial pathogens causing community-acquired pneumonia or sepsis in asymptomatic patients by using a multiplex reverse transcription-PCR assay with manual (enzyme hybridization) or automated (electronic microarray) detection.</a> Journal Of Clinical Microbiology. 46, 3063-3072 (2008).</li><li>Musher, D. M., Rueda, A. M., Kaka, A. S., Mapara, S. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+receptor+initiates+bacterial+contact+with+the+blood+brain+barrier+in+experimental+meningitis+models.">Laminin receptor initiates bacterial contact with the blood brain barrier in experimental meningitis models.</a> The Journal of Clinical Investigation. 119, 1638-1646 (2009).</li><li>Flick, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+elimination+of+the+binding+motif+on+fibrinogen+for+the+S.+aureus+virulence+factor+ClfA+improves+host+survival+in+septicemia.">Genetic elimination of the binding motif on fibrinogen for the S. aureus virulence factor ClfA improves host survival in septicemia.</a> Blood. 121, 1783-1794 (2013).</li><li>Cheng, A. G., DeDent, A. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reentry+as+a+cause+of+ventricular+tachycardia+in+patients+with+chronic+ischemic+heart+disease:+electrophysiologic+and+anatomic+correlation.">Reentry as a cause of ventricular tachycardia in patients with chronic ischemic heart disease: electrophysiologic and anatomic correlation.</a> Circulation. 77, 589-606 (1988).</li><li>Verma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+successful+ablation+sites+and+the+scar+border+zone+defined+by+substrate+mapping+for+ventricular+tachycardia+post-myocardial+infarction.">Relationship between successful ablation sites and the scar border zone defined by substrate mapping for ventricular tachycardia post-myocardial infarction.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 465-471 (2005).</li><li>Wu, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+risk+for+ventricular+tachyarrhythmias+and+sudden+cardiac+death:+is+there+a+role+for+cardiac+MRI.">Assessing risk for ventricular tachyarrhythmias and sudden cardiac death: is there a role for cardiac MRI.</a> Circ Cardiovasc Imaging. 5, 2-5 (2012).</li><li>Tettelin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+a+virulent+isolate+of+Streptococcus+pneumoniae.">Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae.</a> Science. 293, 498-506 (2001).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections.">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li></ol>

The authors declare no conflict of interest in this study.

本報告書では、再現性の高い方法は、Sを誘導する肺炎連鎖球菌は、IPD中に、マウスにおける心臓microlesionsを媒介し、その可視化するための技術が実証されている。マウスは、ヒトの敗血症の間に生じ、心筋内に最終的に細菌のトランスロケーションをもたらすものと同様の高品位菌血症に至るクリアランス免疫系の閾値を超えた細菌の投与量で感染させる。まだ未知の理由のた...

市中肺炎（CAP）のための大人の入院は死亡率1-4に貢献する有害心イベントのために文書化されたリスクを運ぶ。 、心臓の合併症が関連付けられていることが判明、および/ ​​または肺炎に関連した死亡例3の27％を担当した。コラレス·メディナらによる最近の研究では。 肺炎連鎖球菌 （肺炎球菌）、CAPと敗血症5の最も一般的な原因直接入院成人患者6のような多くの19％ほどで有害心イベントと関連していた。肺炎に関連した有害心イベントは、周波数6を減少させるために、新規または悪化うっ血性心不全、不整脈、および心筋梗塞を含む。 Brown らによる最近のPLoSの病原記事で。、肺炎球菌は myocardiuへの参入、心臓の血管内皮を通じて転座が可能であることが判明したmであり、侵襲性肺炎球菌疾患（IPD）7時の心室中の細菌で満たされた離散非化膿性顕微鏡的病変（microlesions）の形成。心臓の微細病変形成の証拠は、肺炎球菌感染症に屈していたヒト以外の霊長類および個人からの心臓の試料で観察された。同様に、実験的に感染させたマウスは、再現性の心臓microlesionsを開発しました。マウスでは、微細病変の大きさと数は積極的に持続し、菌血症、血清中の心筋トロポニンのレベルの重症度、および異常な心臓電気生理学と相関していた。心臓への細菌転移は、血液脳関門および肺炎球菌性髄膜炎の発症、ラミニン受容体および血小板の血管内皮細胞の、すなわち 、コリン結合タンパク質A媒介浸潤横切る肺炎球菌の転座に関与する同じメカニズムを介して起こることが見出された-activating因子受容体依存的に8。 Microlesイオン形成はまた心筋細胞7を殺すことが判明した肺炎球菌孔形成毒素ニューモリシンを必要とした。 肺炎球菌心臓microlesionsは、 黄色ブドウ球菌を含む、他のグラム陽性菌によって引き起こされる化膿性軟部組織および心膿瘍とは区別される。これらは、好中球およびフィブリン沈着9,10により囲まれた細菌の単一の病巣によって特徴付けられる。 S.によって形成されたMicrolesions 肺炎連鎖球菌は 、サイズが小さく、影響を受けた心臓全体に分散、および免疫細胞浸潤を欠いている。感染の初期段階で、microlesionsはS.によって引き起こさ肺炎心筋症の病理学的徴候を彷彿とさせる、損傷または炎症を起こした組織の領域として表示されます。いくつかの単球が、この期間中に観察することができると同時にグラムを継続しながら、しかし、それらの存在は短命であり、病変は急速に外観壊死および細菌で満たさ動物または抗菌介入の死までのサイズでOW。重要なことには、抗生物質の介入の3日以内に、多量の免疫細胞の浸潤は、前者損傷部位で観察され、これは強固なコラーゲン沈着を伴う。同様心臓リモデリングは、心臓機能11-15上の永続的な影響に加えて、以下の梗塞を発生することが報告されています。したがって、microlesionsはIPD中に発生する有害心イベント、おそらく病気のエピソードを生き残った回復期の個体における心臓関連の死亡の発生率の増加のための潜在的な説明である。 ここで、命令は、感染の初期および後期段階でIPD心臓病変形成および心臓microlesionsの可視化の実験的マウスモデルに設けられている。抗菌介入によって保存された動物におけるコラーゲン沈着の検出のためのプロトコルが示されている。この記事の目的は、Fにあるこの重要かつ新規な肺炎球菌病理上の他の研究者の研究をacilitate。

<table><tbody><tr><td>Todd-Hewitt broth&amp;nbsp;</td><td>Neogen</td><td>7161A</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T Compound&amp;nbsp;</td><td>Tissue-Tek (Sakura Finetek)&amp;nbsp;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific (Acros)</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td></td></tr><tr><td>anti-serotype 4 pneumococcus antiserum&amp;nbsp;</td><td>Statens Serum Institut</td><td>16747</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-rabbit FITC conjugated antibody&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-096-144</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Fluorsave</td><td>Millipore</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>S70104</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9393</td><td></td></tr><tr><td>phosphomolybdic acid 0.2%&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>26357-01</td><td></td></tr><tr><td>0.1% Sirius Red in picric acid&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>26357-02</td><td></td></tr><tr><td>0.01 N hydrochloric acid&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>26357-03</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tack Microscope Slides</td><td>Polysciences, Inc</td><td>24216</td><td></td></tr><tr><td>Paralube Vet Ointment</td><td>Dechra</td><td>12920060</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin and Eosin Staining Kit</td><td>unspeciified&amp;nbsp;</td><td></td><td>Standard</td></tr></tbody></table>

visualization of streptococcus pneumoniae within cardiac microlesions and subsequent cardiac remodeling

菌血症の間、 肺炎球菌は、心筋に血管内皮間で移行して起因する免疫細胞浸潤が存在しない場合に顕著である離散細菌で満たされた顕微鏡的病変（microlesions）を形成することができる。心臓毒性製品の彼らのリリース、Sに起因するmicrolesions内ニューモニエは、しばしば成人における劇症侵襲性肺炎球菌疾患の間に観察される心不全に寄与すると考えられる。本明細書中に30時間以内に心臓の微細病変形成の再現性につながる実験的マウス感染のためのプロトコルを示している。命令はヘマトキシリン​​＆エオシン染色心臓切片で微細病変の同定に提供され、初期および後期microlesions間の形態学的な区別が強調表示されます。命令はSの検証のためのプロトコル上に設けられている肺炎球菌莢膜多糖に対する抗体を用いてmicrolesions内ニューモニエ及び免疫蛍光顕微鏡。最後に、感染したマウスの検出および回復期のマウスの心臓における瘢痕形成を評価するために救助抗生物質の介入のためのプロトコルが提供される。一緒に、これらのプロトコルは、Sへの曝露の結果として肺炎球菌心臓侵略、心筋細胞死、心臓リモデリングの基礎となる分子メカニズムの研究を促進する、肺炎 、心臓における肺炎球菌に対する免疫応答。

H＆EでMicrolesionsの可視化心臓microlesionsはTIGR4との腹腔内チャレンジ以下IPDを有するマウスからの心臓の切片をH＆E染色の心室で観察された。 図1は、ヘマトキシリンより多くて、24及び30時間感染後（hpiの）との間のこれらの病変の大きさの増加を示している病変内に見える-stained（ すなわち 、紫-青）肺炎球菌。 Microlesionsは液胞様の形態、密度の...

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Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals.

の可視化<em&gt;肺炎球菌</em&gt;心臓Microlesionsとその後の心臓リモデリングの中

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

visualization-streptococcus-pneumoniae-within-cardiac-microlesions

Research

JoVE Journal

Medicine

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

9.0K ビュー.  The University of Texas Health Science Center at San Antonio. Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals. 

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Ultrasonic Assessment of Myocardial Microstructure

Echocardiography is a widely accessible imaging modality that is commonly used to noninvasively characterize and quantify changes in cardiac structure and function. Ultrasonic assessments of cardiac tissue can include analyses of backscatter signal intensity within a given region of interest. Previously established techniques have relied predominantly on the integrated or mean value of backscatter signal intensities, which may be susceptible to variability from aliased data from low frame rates and time delays for algorithms based on cyclic variation. Herein, we describe an ultrasound-based imaging algorithm that extends from previous methods, can be applied to a single image frame&#160;and accounts for the full distribution of signal intensity values derived from a given myocardial sample. When applied to representative mouse and human imaging data, the algorithm distinguishes between subjects with and without exposure to chronic afterload resistance. The algorithm offers an enhanced surrogate measure of myocardial microstructure and can be performed using open-access image analysis software.

Echocardiography is commonly used to noninvasively characterize and quantify changes in cardiac structure and function. We describe an ultrasound-based imaging algorithm that offers an enhanced surrogate measure of myocardial microstructure and can be performed using open-access image analysis software.

心筋微細構造の超音波評価

Echocardiography is a widely accessible imaging modality that is commonly used to noninvasively characterize and quantify changes in cardiac structure and ...

医学

3D Whole-heart Myocardial Tissue Analysis

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other biologicals that enhance angio- or vasculogenesis into the infarct border zone (IBZ), tissue perfusion is improved, and the myocardium can be protected from further damage. For maximum therapeutic effect, it is hypothesized that the regenerative substance is best delivered to the IBZ. This requires accurate injections and has led to the development of new injection techniques. To validate these new techniques, we have designed a validation protocol based on myocardial tissue analysis. This protocol includes whole-heart myocardial tissue processing that enables detailed two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) analysis of the cardiac anatomy and intramyocardial injections. In a pig, myocardial infarction was created by a 90-min occlusion of the left anterior descending coronary artery. Four weeks later, a mixture of a hydrogel with superparamagnetic iron oxide particles (SPIOs) and fluorescent beads was injected in the IBZ using a minimally-invasive endocardial approach. 1 h after the injection procedure, the pig was euthanized, and the heart was excised and embedded in agarose (agar). After the solidification of the agar, magnetic resonance imaging (MRI), slicing of the heart, and fluorescence imaging were performed. After image post-processing, 3D analysis was performed to assess the IBZ targeting accuracy. This protocol provides a structured and reproducible method for the assessment of the targeting accuracy of intramyocardial injections into the IBZ. The protocol can be easily used when the processing of scar tissue and/or validation of the injection accuracy of the whole heart is desired.

This protocol describes a novel method for the 3D comparison of whole-heart myocardial tissue with MRI. This is designed for the accurate assessment of intramyocardial injections in the infarct border zone of a chronic porcine model of myocardial infarction.

3Dホール・ハート心筋組織の分析

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

光シート顕微鏡による劇症心筋炎のマウスモデルにおける白血球浸潤の定量的可視化

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to induce myocardial injury). The majority of pre-clinical myocardial infarction models require the disruption of pericardial integrity with loss of the homeostatic cellular milieu. However, recently a methodology has been developed by us to induce myocardial infarction, which minimizes pericardial damage and retains the heart&#39;s resident immune cell population. An improved cardiac functional recovery in mice with an intact pericardial space following coronary ligation has been observed. This method provides an opportunity to study inflammatory responses in the pericardial space following myocardial infarction. Further development of the labeling techniques can be combined with this model to understand the fate and function of pericardial immune cells in regulating the inflammatory mechanisms that drive remodeling in the heart, including fibrosis.

This protocol outlines the steps for inducing myocardial infarction in mice while preserving the pericardium and its contents.

無傷心膜虚血性げっ歯類モデル

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to ...

Tissue Preparation Techniques for Contrast-Enhanced Micro Computed Tomography Imaging of Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease

Structural remodeling is a common consequence of chronic pathological stresses imposed on the heart. Understanding the architectural and compositional properties of diseased tissue is critical to determine their interactions with arrhythmic behavior. Microscale tissue remodeling, below the clinical resolution, is emerging as an important source of lethal arrhythmia, with high prevalence in young adults. Challenges remain in obtaining high imaging contrast at sufficient microscale resolution for preclinical models, such as large mammalian whole hearts. Moreover, tissue composition-selective contrast enhancement for three-dimensional high-resolution imaging is still lacking. Non-destructive imaging using micro-computed tomography shows promise for high-resolution imaging. The objective was to alleviate sufferance from X-ray over attenuation in large biological samples. Hearts were extracted from healthy pigs (N = 2), and sheep (N = 2) with either induced chronic myocardial infarction and fibrotic scar formation or induced chronic atrial fibrillation. Excised hearts were perfused with: a saline solution supplemented with a calcium ion quenching agent and a vasodilator, ethanol in serial dehydration, and hexamethyldisilizane under vacuum. The latter reinforced the heart structure during air-drying for 1 week. Collagen-dominant tissue was selectively bound by an X-ray contrast-enhancing agent, phosphomolybdic acid. Tissue conformation was stable in air, permitting long-duration microcomputed tomography acquisitions to obtain high-resolution (isotropic 20.7 &#181;m) images. Optimal contrast agent loading by diffusion showed selective contrast enhancement of the epithelial layer and sub-endocardial Purkinje fibers in healthy pig ventricles. Atrial fibrillation (AF) hearts showed enhanced contrast accumulation in the posterior walls and appendages of the atria, attributed to greater collagen content. Myocardial infarction hearts showed increased contrast selectively in regions of cardiac fibrosis, which enabled the identification of interweaving surviving myocardial muscle fibers. Contrast-enhanced air-dried tissue preparations enabled microscale imaging of the intact large mammalian heart and selective contrast enhancement of underlying disease constituents.

Here, we present a protocol to obtain high resolution micro computed tomography images of healthy and pathological large mammalian whole hearts with collagen-selective contrast enhancement.

慢性疾患を有する大型哺乳類心臓モデルのコントラスト増強マイクロコンピュータ断層撮影イメージングのための組織調製技術

Structural remodeling is a common consequence of chronic pathological stresses imposed on the heart. Understanding the architectural and compositional ...

Ultrasound-Guided Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Implantation in Myocardial Infarcted Mice

The key objective of cell therapy after myocardial infarction (MI) is to effectively enhance the cell grafted rate, and human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are a promising cell source for cardiac repair after ischemic damage. However, a low grafted rate is a significant obstacle for effective cardiac tissue regeneration after transplantation. This protocol shows that multiple hiPSC-CM ultrasound-guided percutaneous injections into an MI area effectively increase cell transplantation rates. The study also describes the entire hiPSC-CM culture process, pretreatment, and ultrasound-guided percutaneous delivery methods. In addition, the use of human mitochondrial DNA help detect the absence of hiPSC-CMs in other mouse organs. Lastly, this paper describes the changes in cardiac function, angiogenesis, cell size, and apoptosis at the infarcted border zone in mice 4 weeks after cell delivery. It can be concluded that echocardiography-guided percutaneous injection of the left ventricular myocardium is a feasible, relatively invasive, satisfactory, repeatable, and effective cellular therapy.

Ultrasound-guided cell delivery around the site of myocardial infarction in mice is a safe, effective, and convenient way of cell transplantation.

心筋梗塞マウスにおける超音波ガイド下多能性幹細胞由来心筋細胞移植術

The key objective of cell therapy after myocardial infarction (MI) is to effectively enhance the cell grafted rate, and human induced pluripotent stem ...

An Experimental Model of Myocardial Infarction for Studying Cardiac Repair and Remodeling in Knockout Mice

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. This paper describes a protocol for studying the role of galectin 3 (Gal-3) in the temporal evolution of cardiac healing and remodeling in an experimental animal model of MI. 
The procedures described include an experimental model of MI with a permanent coronary ligature in male C57BL/6J (control) and Gal-3 knockout (KO) mice, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and systolic function in vivo, a histological evaluation of interstitial myocardial fibrosis with picrosirius red-stained and rhodamine-conjugated lectin-stained sections for studying myocyte hypertrophy by the cross-sectional area (MCSA), and the quantification of infarct size and cardiac remodeling (scar thinning, septum thickness, and expansion index) by planimetry in slices stained with Masson's trichrome and triphenyl tetrazolium chloride. Gal-3 KO mice with MI showed disrupted cardiac remodeling and an increase in the scar thinning ratio and the expansion index. At the onset of MI, myocardial function and cardiac remodeling were also severely affected. At 4 weeks post MI, the natural evolution of fibrosis in infarcted Gal-3 KO mice was also affected. 
In summary, the experimental model of MI is a suitable model for studying the temporal evolution of cardiac repair and remodeling in mice with the genetic deletion of Gal-3 and other animal models. The lack of Gal-3 affects the dynamics of cardiac repair and disrupts the evolution of cardiac remodeling and function after MI.

<meta charset="utf8"></head><body>ノックアウトマウスにおける心臓修復・リモデリング研究のための心筋梗塞の実験モデル

Here, we describe an experimental model of myocardial infarction, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and function, and procedures for quantifying fibrosis and hypertrophy in picrosirius red-stained and rhodamine-stained sections, as well as the infarct size and expansion index in slices stained with Masson's trichrome.

ノックアウトマウスにおける心臓修復・リモデリング研究のための心筋梗塞の実験モデル

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. ...

マウスの肺静脈の心筋構造の解明

Microdissection and Immunofluorescence Staining of Myocardial Sleeves in Murine Pulmonary Veins

Pulmonary veins (PVs) are the major source of ectopic beats in atrial arrhythmias and play a crucial role in the development and progression of atrial fibrillation (AF). PVs contain myocardial sleeves (MS) composed of cardiomyocytes. MS are implicated in the initiation and maintenance of AF, as they preserve similarities to the cardiac working myocardium, including the ability to generate ectopic electrical impulses. Rodents are widely used and may represent excellent animal models to study the pulmonary vein myocardium since cardiomyocytes are widely present all over the vessel wall. However, precise microdissection and preparation of murine PVs is challenging due to the small organ size and intricate anatomy.
We demonstrate a microscopy-guided microdissection protocol for isolating the murine left atrium (LA) together with the PVs. Immunofluorescence staining using cardiac Troponin-T (cTNT) and connexin 43 (Cx43) antibodies is performed to visualize the LA and PVs in full length. Imaging at 10x and 40x magnification provides a comprehensive view of the PV structure as well as detailed insights into the myocardial architecture, particularly highlighting the presence of connexin 43 within the MS.

著者スポットライト:種を超えた心房細動研究のためのトランスレーショナルモデルの開発 

This protocol demonstrates microscopy-guided isolation and immunofluorescence staining of murine pulmonary veins. We prepare tissue samples containing the left atrium, pulmonary veins, and the corresponding lungs and stain them for cardiac Troponin T and Connexin 43.

マウス肺静脈における心筋スリーブの微小解剖および免疫蛍光染色

Pulmonary veins (PVs) are the major source of ectopic beats in atrial arrhythmias and play a crucial role in the development and progression of atrial ...

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心筋微細構造の超音波評価

3Dホール・ハート心筋組織の分析

光シート顕微鏡による劇症心筋炎のマウスモデルにおける白血球浸潤の定量的可視化

無傷心膜虚血性げっ歯類モデル

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マウス肺静脈における心筋スリーブの微小解剖および免疫蛍光染色

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