Acessar interações de alvo de microRNA neural com funções de MicroRNA é fundamental para entender como as MicroRNAs regulam vários processos biológicos em estados saudáveis e doentes. Este protocolo descreve a reprodução através da estratégia para identificar alvos de microRNA e as microRNAs funcionais como a validação do alvo direto das microRNAs é desafiadora. Nosso protocolo pode fornecer insights sobre a função das microRNAs individuais e a implicação de um microRNA na terapia do câncer.
O cálculo da concentração inibitória semi-máxima é um método importante, não apenas para estudos de microRNA, mas para a avaliação eficaz de outras drogas anticâncer. Nosso protocolo será útil para novos pesquisadores, uma vez que descrevemos o método fundamental para entender o nível de microRNAs em uma célula. Para começar o protocolo, conte as células com o contador de células.
Coloque as células em uma placa de 96 poços. No dia seguinte, prepare um conjunto de misturas de transfecção para transfetar as células em várias concentrações finais de mímica de controle de microRNA, e imitação de microRNA-107. A partir de um estoque de 25 micromolars de controle microRNA mimic, ou microRNA-107 imitar, diluir e adicionar controle imitar ou microRNA-107 imitar na mídia soro reduzida, juntamente com o reagente de transfecção em tubos de microcentrifuuge.
Misture delicadamente as misturas que contêm oligo usando uma micropipette. Após uma incubação de 10 minutos na capa de cultura celular, misture suavemente as misturas contendo oligo novamente e, em seguida, adicione 50 microliters das misturas em cada poço. Mantenha as células transfeinadas em uma incubadora de cultura celular.
Aspire cuidadosamente a mídia de cultura celular em cada poço da placa e preencha prontamente 100 microliters de ácido 10% tricloroacético, ou TCA, em cada poço. Mantenha a placa contendo 10% TCA a quatro graus Celsius por uma hora. Em seguida, lave a placa várias vezes submergindo-a em uma banheira com água da torneira.
Retire o excesso de água de dentro dos poços tocando na placa até que não haja mais água e seque a placa. Pipette 50 microliters de solução 0,4% SRB em cada poço, incluindo os poços em branco. Agite suavemente a placa até que a solução de 0,4% SRB cubra uniformemente a parte inferior dos poços.
Em seguida, incubar a placa por 40 a 60 minutos. Após a incubação, lave a placa com ácido 1%acético até que o corante não ligado seja totalmente lavado. Pipette 100 microliters de 10 mililitros de solução base Tris nos poços correspondentes, incluindo poços em branco.
Mantenha a placa em um shaker por 10 minutos. Meça a absorvância em 492 nanômetros. Calcule a porcentagem de absorção média e o desvio padrão de cada grupo utilizando valores de absorção do ensaio SRB.
Importe os dados brutos, incluindo concentrações de tratamento, absorvância média e desvio padrão no software, alinhando verticalmente os dados. Clique na guia Criar gráficos e escolha as barras de erro de dispersão simples. Selecione colunas de planilhas como valores de símbolo e clique em seguida.
No painel Formato de dados, selecione pares X-Y e clique em seguida. Selecione as colunas de dados correspondentes no painel Selecionar dados. Clique em terminar para criar o plot.
Clique duas vezes no eixo X para modificar o tipo de escala na escala do eixo. Altere o tipo de escala de linear para log. Modifique o número da faixa inicial e final para 0,01 e 200, respectivamente.
Clique com o botão direito do mouse em qualquer plot de dispersão, escolha Curve Fit e vá para a subcategoria Definida pelo usuário. Selecione a curva de resposta da dose. Clique nos próximos botões e clique em terminar.
Vá para a guia de relatório e, em seguida, verifique os valores n, k e R. Execute o PCR conforme detalhado no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, passe para a digestão dupla combinando as misturas de reação, incluindo as enzimas de restrição Exo1 e Not1 em um tubo.
Incubar as misturas por três a quatro horas em um banho de água de 37 graus Celsius. Execute os produtos duplamente digeridos em um gel de 1% de agarose. Em seguida, corte as bandas sob luz UV.
Purificar os produtos PCR duplamente digeridos e vetores de luciferase das bandas excisadas. Continue com a ligadura dos produtos PCR nos vetores da luciferase, preparando 20 microliters de misturas de reação de ligadura, incluindo a liga ligadura de DNA. Centrifufique brevemente o tubo por 10 a 15 segundos.
Incubar a ligadura a 16 graus Celsius durante a noite usando um cicloviário térmico. No dia seguinte, realize a transformação adicionando as misturas de ligadura no tubo contendo células competentes. Bata suavemente no tubo e mantenha-o no gelo por 20 minutos.
Transfira o tubo de forma rápida e suave para um bloco de calor a 42 graus Celsius por 30 segundos a um minuto. Após o choque térmico, coloque o tubo no gelo por 20 minutos. Espalhe células competentes em uma placa de ágar LB.
Cresça células competentes em uma incubadora a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, escolha uma colônia individual e resuspenja E.coli em um dos tubos de 8 tiras contendo água ultrauso, e repita este passo para resuspengar E.coli de quatro a oito colônias selecionadas aleatoriamente. Transfira 25 microliters de suspensão E.coli para outro conjunto de tubos de 8 tiras.
Realize a colônia PCR usando a suspensão E.coli. Prepare o ensaio de luciferase em uma placa de 24 poços. Adicione uma a duas vezes dez às quatro células em uma mídia de cultura de células de 500 microliter para cada poço.
Após a incubação durante a noite, transfete 50 nanogramas de vetores de luciferase nas células com mímica de controle ou uma imitação de microRNA específica usando um reagente de transfecção. No dia seguinte, lave o interior dos poços duas vezes usando soro fisco tamponado fosfato. Aplique 200 microliters de reagente de lise nos poços e realize suficientemente a lise celular antes de medir a atividade da luciferase.
Mantenha a placa tremendo por pelo menos 15 minutos. Transfira de 5 a 10 microlitadores de lise celular para o novo tubo, e adicione 100 microliters de reagente um e misture imediatamente a solução por pipetação. Em seguida, leia a atividade de luciferase de vagalume usando illuminômetro por 10 a 15 segundos.
Adicione 100 microliters de reagente dois no mesmo tubo e misture por pipetar duas vezes. Por fim, leia a atividade de renilla luciferase por 10 a 15 segundos usando illuminômetro. O RTPCR mostra uma redução significativa das células microRNA-107 e PANC-1 e CAPAN-1 em comparação com as células HPNE.
Os níveis de microRNA-301 foram significativamente elevados nas células PANC-1 e CAPAN-1, em comparação com as células HPNE. O ensaio SRB neste estudo demonstra claramente que a proliferação de células PANC-1 diminuiu após uma transfecção de imitação de microRNA-107. A triagem de 11 potenciais alvos previstos de microRNA-107 mostra claramente que apenas a gama de sinucleína, ou SNCG, um regulador positivo do crescimento das células tumorais interage diretamente com células microRNA-107 e PANC-1, indicando que o microRNA-107 pode regular negativamente a proliferação de células PANC-1 modulando a expressão SNCG.
Ensaios de proliferação de células adultas que usam a entidade baseada em tetra hidroleum e CFSE são aplicáveis para rastrear o efeito de como imitações de microRNA, dependendo dos tipos de células. Com base na função validada experimentalmente das microRNAs, é necessária uma revisão sistemática do banco de dados e do programa de previsão de alvos para reduzir a lista de alvos dos candidatos antes dos ensaios da luciferase. Para a avaliação da eficiência combinada das microRNAs com medicamentos anticâncer, é vantajoso calcular valores ajustados de IC com base em nosso protocolo para avaliação do índice de combinação.
