Estamos gratos ao Sr. Roger Ackroyd, o Sr. Andrew Wyman eo Sr. Chris Stoddard, Consultor Cirurgiões no Sheffield Teaching Hospitals NHS Foundation Trust, por sua ajuda na aquisição de amostras de tecido do esôfago e seu apoio de nosso trabalho. Agradecemos Ashraful Haque por sua ajuda incorporando linhas de células tumorais no modelo. Estamos gratos pela assistência financeira para este estudo por concessões do Bardhan Pesquisa e Ensino Trust (BRET) e Yorkshire Cancer Research (YCR).

Células do esôfago humanos são obtidos a partir de pacientes submetidos à cirurgia gástrica ou esofágica. O consentimento informado é obtido para o tecido a ser usado para fins de pesquisa, eo tecido usado de forma anônima sob as aprovações éticas adequadas (SSREC 165/03, Tissue Research Humano Banco Licence 12179). 1. Isolamento de esôfago humano células epiteliais <ol><li> Trabalhando em fluxo laminar capuz de cultura de tecidos e utilizando uma técnica estéril, preparar o meio de cultura epitelial através da mistura de meio de Eagle modificado por Dulbecco (MEMD) e F12 de Ham na proporção de 3: 1 (v: v). Adiciona-se 10% (v / v) de FCS, factor de crescimento epidermal 10 ng / ml, 0,4 ug / ml de hidrocortisona, 1,8 x 10 ~ 4 M de adenina, 5 ug / ml de insulina, 5 ug / ml de transferrina, 2 x 10 -7 M tri-iodotironina, 1 x 10 -10 M a toxina da cólera, 2 x 10 -3 M glutamina, 100 UI / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 0,625 ug / ml de anfotericina B. </li><li> Usando padrãotécnicas estéreis, colocar 11 ml de DMEM, 10% FCS, 2 x 10 -3 M de L-glutamina, 100 UI / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 0,625 ug / ml de anfotericina B num balão de cultura de tecidos T75. Adicionar 1 x 10 6 letalmente irradiados fibroblastos 3T3 de ratinho 12 em 1 ml do mesmo meio e incubar durante a noite a 37 ° C num CO 2, atmosfera humidificada de 5%. Isto produzirá uma camada alimentadora para a cultura subsequente de células epiteliais. </li><li> Usando um bisturi e seguindo as recomendações de um histopathologist, dissecar um aproximadamente 2 cm2 amostra de tecido da região fundo livre de doença de mucosa epidermóide de esôfago obtidas a partir de pacientes submetidos à cirurgia gástrica ou esofágica. O transporte para o laboratório num recipiente de 50 ml de meio de transporte estéril (PBS 100 UI / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e 0,625 ug / ml de anfotericina B) à temperatura ambiente. </li><li> Neste ponto, armazenar o tecido no transportemédio de até 12 horas (durante a noite) a 4 ° C, por conveniência; no entanto, não usar períodos de armazenamento de mais tal como resultam da viabilidade celular reduzida. </li><li> Trabalhando em fluxo laminar capuz de cultura de tecidos e utilizando uma técnica estéril, esterilizar uma lâmina de bisturi por imersão em etanol a 70% durante 5 min. Enxágüe em PBS estéril. </li><li> Colocar o tecido de uma placa de Petri estéril e usar o bisturi para cortar em tiras de 0,5 centímetros. Adicionar 5 ml de 0,1% (w / v) de tripsina em PBS para a placa de Petri, colocar a tampa no prato e incubar durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Adicionar 5 ml de FCS para o tecido no prato de Petri para inibir a tripsina. Segurando a tira de tecido com uma pinça estéril, raspe a superfície epitelial com a lâmina de bisturi para 1-2 min por tira para remover as células epiteliais para o meio circundante. Remover o tecido raspada e reserve. Repetir o processo para todas as tiras do tecido. </li><li> Recolhe-se o meio contendo as células epiteliais desacopladas em um tubo de centrífuga de 15 mle centrifuga-se (5 min, 200 x g). Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 12 ml de meio epitelial (descrito no passo 1.1). </li><li> Decantar e rejeitar o meio a partir da camada de células de alimentação no frasco T75 preparado no passo 1.2. Usar uma pipeta estéril para adicionar a suspensão de células contendo as células epiteliais isolada de fresco ao frasco e incubar a 37 ° C em 5% de CO 2, atmosfera humidificada. </li><li> Após 24 h, deitar fora e deite fora o meio de cultura, que também irá conter os detritos celulares, e substituir com 12 ml de meio fresco epitelial. Continuar a incubação a 37 ° C num CO 2, atmosfera humidificada de 5%. Colônias vão começar a aparecer nos próximos 24 a 48 h e pode ser visto colocando o frasco de cultura sob um microscópio de luz padrão. Decantar o meio de cultura gasto e substitua com um volume igual de meio fresco a cada 2 a 3 dias. </li><li> Uma vez que o balão tenha atingido 80% de confluência, as células de passagem 13. Dividir o cells em uma proporção de 1: 5 a aumentar o número de células utilizadas no modelo. Siga passo 1.2 para estabelecer camadas alimentadoras de células 3T3 irradiadas em cada balão que vai receber células epiteliais 24 h antes da passagem das células. Nota: Utilize as células epiteliais no modelo de esôfago descrito abaixo entre as passagens 1 e apenas 4. </li></ol> 2. Isolamento de esofágicas fibroblastos humanos <ol><li> Trabalhando em uma câmara de fluxo laminar e usando técnica estéril, tomar o tecido retiradas no passo 1.7. Coloque em uma placa de Petri estéril e pique finamente por cortar com uma lâmina de bisturi estéril. Adicionar 10 ml de 0,5% (w / v) de colagenase A solução e colocar a tampa no prato de Petri e incubar a 37 ° C durante a noite num CO 2, atmosfera humidificada de 5%. </li><li> Transferir a digest para um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugar (10 min, 200 x g), cuidadosamente, deitar fora e deite fora o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 ml de meio de cultura de fibroblastos (DMEM 10% de FCS, 2 x 10 -3 M de L-glutamina, 100 UI / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 0,625 ug / ml de anfotericina B). </li><li> Colocar a suspensão para um frasco T75 e incubar a 37 ° C num CO 2, atmosfera humidificada de 5%. Após 24 h, deitar fora o suporte, que vai conter os detritos e substituir por 12 ml de meio fresco de fibroblastos. Substituir o meio de cultura a cada 2 a 3 dias e as células de passagem, uma vez que tenham atingido 80% de confluência 13, dividindo as células numa proporção de 1: 5 para aumentar os números de células. Nota: Utilize as células de fibroblastos no modelo descrito a seguir entre as passagens 4 e apenas 10. </li></ol> 3. Preparação do De-celularizado esofágico Andaime <ol><li> Obter esófagos suína intacta em um abatedouro de suínos da raça Landrace recém abatidos que são utilizados para a produção de alimentos. Uma esôfago único irá fornecer andaimes suficientes para cerca de 30 construções separadas. Nota: Devido à extensa e hora consuming protocolo de esterilização necessário, é normalmente vale obtenção e processamento de um mínimo de 10 esófagos de uma só vez. </li><li> Colocar imediatamente o esófago recentemente excisada para um vaso estéril de 180 ml contendo aproximadamente 150 ml de solução de povidona-iodo a 10% durante 5 minutos para reduzir a carga microbiana de qualquer contaminação. Transferir o esófago para um segundo vaso contendo aproximadamente 100 ml de PBS estéril contendo 200 UI / ml de penicilina, 200 ug / ml de estreptomicina, e 1,25 ug / ml de anfotericina B. <ol><li> Colocar a tampa sobre o recipiente e transportar o esófagos de volta ao laboratório à temperatura ambiente. Dois ou três esófagos pode ser transportado em cada recipiente, em função do seu tamanho. </li></ol></li><li> Uma vez no laboratório, tratar o tecido de uma câmara de fluxo laminar utilizando uma técnica asséptica para minimizar a contaminação microbiana. Esterilizar pinças, tesouras e lâminas de bisturi por imersão durante 5 min em etanol a 70%, e lavagem em PBS estéril. </li><li> Lidar com as esophagus usando uma pinça estéreis. Usando a tesoura, corte o esôfago aberto longitudinalmente. Lavar o tecido, colocando o esôfago em um pote estéril de 180 ml contendo aproximadamente 100 ml de PBS estéril e balançando suavemente para remover quaisquer detritos. </li><li> Limpe uma placa de dissecção cortiça pulverizando generosamente com etanol 70% e deixe secar. </li><li> Remover o esôfago do PBS, e utilizando agulhas estéreis, o pino para fora do esôfago em cima da prancha, mais elevada superfície da mucosa. Agarrar a superfície da mucosa, numa extremidade do esófago com pinças estéreis e puxar para fora da placa. Isto irá separar a mucosa da submucosa subjacente. <ol><li> Em seguida, use uma lâmina de bisturi estéril para dissecar o esôfago longitudinalmente ao longo da lâmina própria, remoção de pinos como a dissecção progride para permitir que a mucosa a ser levantada. </li></ol></li><li> Reter a mucosa dissecada e descartar a submucosa subjacente. </li><li> Cortar e descartar as mais proximais e distais dois centímetros de tele mucosa, há um maior número de glândulas submucosas e uma lâmina mais espessa nas zonas, respectivamente 7. </li><li> Usar um bisturi para cortar o tecido restante em de 5 cm2. Colocar todo o tecido cortado em um vaso estéril de 180 ml contendo aproximadamente 150 ml de PBS estéril e agitar suavemente para enxaguar o tecido. Se o processamento de mais de cinco esôfago em um tempo que pode ser necessário usar vários vasos para esta e as três etapas seguintes. </li><li> Usando pinças estéreis, transferir o tecido cortado em um vaso de 180 ml contendo 150 ml de 1 M estéril de NaCl, 200 UI / ml de penicilina, 200 ug / ml de estreptomicina e 1,25 ng / ml de anfotericina B. incubar durante 72 horas a 37 ° C. </li><li> Coloque o tecido em um pote de 180 ml fresco contendo 150 ml de PBS estéril. O epitélio terá começado a separar visivelmente a partir do tecido subjacente. Descascar delicadamente o epitélio desanexação do esôfago porco usando uma pinça estéril e descarte. <ol><li> Inserir o restante tquestão em uma jarra de 180 ml e adicionar 150 ml de PBS estéril. Agitar suavemente durante 5 minutos para lavar. Deitar fora o PBS e repetir mais duas vezes com PBS fresco. </li></ol></li><li> Colocar todo o tecido dentro de uma garrafa de vidro de 500 ml contendo 400 ml de estéril 80% (v / v) de solução de glicerol durante 24 horas à temperatura ambiente. Transferir para 400 ml de estéril 90% (v / v) de solução de glicerol durante mais 24 h. </li><li> Armazenar em 400 ml de solução de glicerol a 100% estéril à temperatura ambiente durante um mínimo de 4 meses para desidratar e esterilizar o tecido ao mesmo tempo preservando a integridade da membrana basal. </li></ol> 4. Produção da Cultura Mídia <ol><li> Prepare quelado de soro de vitelo recém-nascido para a utilização no meio de cultura. <ol><li> Despeje 100 g de Chelex 100 em uma garrafa de vidro de 1 L e adicionar água de-ionizada. O volume exacto não é crítica, mas deve ser suficiente água adicionada para cobrir o pó Chelex. Adicionar um agitador magnético e esterilizar em autoclave (121 ° C durante15 min). </li><li> Deixar a garrafa arrefecer e o Chelex a assentar. Em uma câmara de fluxo laminar, deitar fora o excesso de água, adicionar 500 ml de soro de vitelo recém-nascido (NCS) e deixar a agitar durante a noite a 4 ° C. </li><li> Pare de mexer e deixe o Chelex para resolver, isso pode levar até 30 min. Em uma câmara de fluxo laminar, decanta-se o soro quelada utilizando uma pipeta estéril, tendo cuidado para não perturbar o Chelex, e armazenar em 10 mL de alíquotas a -20 ° C. </li></ol></li><li> Prepare três meios diferentes numa câmara de fluxo laminar, começando com pró-proliferativa e terminando com formulações de pró-diferenciativas. <ol><li> Prepare Composição Meio I composto de Hams F12 e DMEM numa razão 3: 1 (v: v), 4 x 10 -3 M de L-glutamina, 0,5 ug / ml de hidrocortisona, 1 x 10 ~ 4 M O -phosphorylethanolamine, 2 x 10 -12 M triiodotironina, 1,8 x 10 ~ 4 M de adenina, 1,88 x 10 -3 M de CaCl2, 4 x 10 -12 M progesterona, 10? g / ml emsulin, 10 ug / ml de transferrina, 10 ng / ml de selénio, 1 x 10 -3 M de etanolamina e 0,1% (v / v) quelatado NCS. </li><li> Prepare Composite Médio II como Composite Médio Eu exceto substituir soro quelatados com 0,1% (v / v) não-quelado NCS. </li><li> Prepare Composite Médio III como Composite Médio II, excepto omitir progesterona e aumento sérico de 2% (v / v) não-quelado NCS. </li></ol></li></ol> 5. Produção da Mucosa Modelo de esôfago humano <ol><li> Executar todo o trabalho em uma capela de fluxo laminar, utilizando uma técnica asséptica para manter um ambiente estéril. Esterilizar todas as ferramentas por imersão em etanol a 70% durante 5 min, antes da lavagem em PBS estéril. </li><li> Um dia antes de ele é necessário, hidratar o andaime de esôfago suína acelular. Um pedaço de andaime é necessário para cada constructo a ser preparado. <ol><li> Para reidratar o lugar tecido peças suficientes de andaime suína em um pote contendo 100 ml de PBS estéril, agite e deixe de molho por 10 min. Decant o PBS e substituir com PBS fresco. Repetir o processo de lavagem cinco vezes para assegurar a remoção de todos os vestígios de glicerol. </li></ol></li><li> Testar a esterilidade andaime por incubação durante a noite o tecido re-hidratado em 100 ml de DMEM a 37 ° C. Se não houver mudança de cor ou a turvação do meio de cultura no final do período de incubação, o andaime é assumido ser estéril. Uma vez que a esterilidade foi confirmada, colocar de 5 cm 2 acelular andaime em uma placa de 6 poços, com o lado superior da submucosa. </li><li> Coloque um anel estéril de grau médico de aço inoxidável (diâmetro interno 10 mm, 20 mm de diâmetro externo) para o centro de cada um andaime e pressionar suavemente para baixo usando fórceps estéreis, para assegurar uma vedação adequada com o tecido. </li><li> Colher as fibroblastos utilizando tripsina-EDTA 13 para produzir uma suspensão de células. Contar as células usando um hemocitómetro 14. Centrifugar a suspensão de células (10 minutos, 200 x g). Ressuspender o sedimento de células em um appropriate o volume do meio de fibroblastos para produzir uma contagem celular final de 2,5 x 10 6 culas por ml. </li><li> Adicionar 0,2 ml de meio de fibroblastos, contendo 5 x 10 5 fibroblastos humanos esôfago, dentro de cada anel. Inundar a área em torno do exterior do anel, com cerca de 2 ml de meio de fibroblastos. Incubar a 37 ° C num CO 2, atmosfera humidificada de 5%. </li><li> Após 24 horas remover a anéis e fibroblastos meio e adicionar, pelo menos, 5 ml de meio de fibroblastos fresco a cada poço, assegurando que o andaime está totalmente imerso no meio. Cultura de uma semana, a 37 ° C em 5% de CO 2, atmosfera humidificada substituindo o meio a cada 2 a 3 dias. </li><li> Depois de uma semana remover as placas de 6 poços contendo os andaimes para uma inundação capa laminar, remova a médio e inverter cada andaime usando uma pinça estéril, colocar a superfície da mucosa superior. Este ponto de tempo é referido como o dia 0. </li><li> Colocar os anéis de aço sobre a superfície da mucosa no centro deo tecido como no passo 5.4. </li><li> Preparar os balões T75 de células epiteliais para tripsinizaï¿½o 13. Após a lavagem com PBS, e antes da adição de uma solução de tripsina-EDTA, adiciona-se 2 ml de solução estéril de 0,02% (w / v) de solução de EDTA a cada frasco. Incubar durante 2 min a 37 ° C. Toque suavemente o frasco para separar selectivamente a camada alimentadora i3T3 enquanto deixando as células epiteliais em anexo. Nota: Geralmente, não é prático ou necessário para paciente corresponder as células epiteliais para os fibroblastos já incorporados no modelo da semana anterior. </li><li> Decantar a solução de EDTA contendo a camada de alimentação e adicionar solução de tripsina-EDTA a colheita das células epiteliais 13. Contar as células usando um hemocitómetro 14. Centrifugar a suspensão de células (10 minutos, 200 x g). Ressuspender o sedimento de células em um volume apropriado de composto Meio 1 para produzir uma contagem celular final de 5 x 10 6 culas por ml. </li><li> Adicionar 0,2 ml de Meio I Composição, contendo 1 x 10 6 células epiteliais, dentro do anel. Inundar a área em torno do exterior do anel, com cerca de 2 ml de Meio I Composição e colocar as construções na incubadora a 37 ° C em 5% de CO 2, atmosfera humidificada. </li><li> Após 24 h (Dia 1) remover os anéis e o meio e adicionar, pelo menos, 5 ml de fresco Composição Meio I, assegurando os andaimes são totalmente submersa e retornar para a incubadora. Após mais 24 h (Dia 2) remover o meio e substituída com, pelo menos, 5 ml de meio II Composição, assegurando novamente os andaimes são totalmente submersa e retornar para a incubadora. </li><li> No dia 4 lugar grades de malha de aço inoxidável de grau médico estéril (2 cm de largura x 2 cm de comprimento x 0,5 cm de altura), em novas placas de 6 poços, um por construto. Use pinças estéreis para transferir as construções para o topo das redes de aço, no ponto mais alto da superfície da mucosa. <ol><li> Adicionar suficiente Médio Composto III, de modo que o líquido atinja a parte inferior do compósito, mas a superfície éexposto ao ar, o que garante que a amostra é mantida a uma interface ar-líquido. O volume exacto de meio necessária irá variar, dependendo da espessura do andaime, o volume do poço e a altura exacta da grelha de aço inoxidável. </li></ol></li><li> Manter os compósitos numa interface ar-líquido durante entre 10 e 20 dias (dia 14 ao dia 24), dependendo das necessidades da experiência. Substitua o Composite Médio III por meio fresco cada 2 a 3 dias (segunda-feira, quarta-feira, sexta-feira é um regime user-friendly). Nota: Depois de 5 dias a uma interface ar-líquido (dia 9) as construções têm um epitélio esofágico suficientemente maduro para ser usado em experimentos do impacto dos factores ambientais sobre o epitélio esofágico. </li><li> No final da experiência, fixar as construções para análise histológica e coloração imuno-histoquímica 7, 15 ou extracto de proteína ou ARN 11,16 a partir do epitélio para mais analysé. Se necessário, reter o meio de cultura condicionado para análise de moléculas de sinalização extracelulares 17. </li></ol>

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H., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+in+human+epidermal+cells+of+a+soluble+protein+precursor+of+the+cross-linked+envelope:+activation+of+the+cross-linking+by+calcium+ions.">Presence in human epidermal cells of a soluble protein precursor of the cross-linked envelope: activation of the cross-linking by calcium ions.</a> Cell. 18 (3), 681-694 (1979).</li><li>Eves, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+invasion+in+reconstructed+human+skin+is+influenced+by+skin+cells+-+investigation+of+the+role+of+proteolytic+enzymes.">Melanoma invasion in reconstructed human skin is influenced by skin cells - investigation of the role of proteolytic enzymes.</a> Clin. Exp. Metastasis. 20 (8), 685-700 (2003).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este manuscrito descreve a produção e caracterização de um modelo biologicamente relevante da mucosa esofágica humana adequada para utilização como uma plataforma experimental para estudar o impacto da exposição a factores de stress ambientais sobre o epitélio esofágico. Os passos mais críticos para o sucesso da produção de um modelo da mucosa esofágica humano são: assegurando que a maior parte das células epiteliais permanecem proliferativa e não ter já começado a difere...

A mucosa esofágica compreende um epitélio estratificado, escamoso acima de uma camada de tecido conjuntivo, a lâmina, e é um dos primeiros locais para encontrar factores de stress ambientais ingeridos. A exposição a toxinas dieta está implicada no desenvolvimento de carcinoma escamoso esofágico, enquanto o refluxo duodenogastro-esofágica é um factor crítico na patogénese de metaplasia de Barrett, o qual está associado com um maior risco de progressão para adenocarcinoma esofágico. Carcinomas de esôfago são o 8º tumor maligno mais comum no Reino Unido machos e adenocarcinoma de esôfago está a aumentar rapidamente no mundo ocidental 1. Além disso, houve pouca melhora no prognóstico da doença, com uma taxa de sobrevida global em 5 anos de cerca de 15%. Consequentemente, há uma necessidade de plataformas experimentais para investigar o impacto da exposição a estressores ambientais sobre este epitélio esofágico e seu potencial envolvimento no desenvolvimento de metaplasia ou neoplasia. Embora as linhas de células imortalizadas ou de tumor permitir que os investigadores a estudar a resposta de células epiteliais para estes factores de stress in vitro, eles permanecem proliferativa e não conseguem diferenciar-se em células epiteliais maduras encontradas nas camadas superiores da mucosa esofágica. Além disso, linhas de células que já tenham sido submetidos a tumorigénese pode fornecer informação limitada sobre as respostas iniciais de células normais dentro do epitélio a factores ambientais; e esta é a fase em que o potencial para intervenção terapêutica pode ser mais elevada. Finalmente, sistemas de cultura celular convencionais não conseguem capturar as interacções potencialmente importantes entre as células epiteliais e mesenquimais e entre estas células e a matriz circundante que ocorrem dentro de tecidos in vivo. Modelos animais proporcionam um microambiente mais realista para estudar as respostas do epitheli esofágicahum e pode incorporar a indução artificial da doença do refluxo gastro-esofágico 2. No entanto, pode ser mais difícil de manipular os estressores ambientais nesses modelos e eles podem não representar plenamente a resposta dentro do esôfago humano. Outros modelos experimentais esofágicas humanos têm sido desenvolvidos que utilizam células primárias imortalizadas, células ou linhas celulares de tumor em um colagénio, ou combinado colagénio / Matrigel, andaime contendo fibroblastos 3,4. É menos trabalho intensivo para gerar estes andaimes do que o andaime esofágica acelular descrito neste manuscrito, e estes modelos organotípicas proporcionam uma ferramenta útil, especialmente no estudo de invasão tumoral 5,6, onde a infiltração de células tumorais no gel de colagénio pode ser prontamente observado. Contudo, estes géis de colagénio tem propriedades mecânicas não nativas e não têm certas características do tecido original, incluindo uma membrana basal específico e o appropriate superfície topografia. Este pode influenciar o comportamento das células, resultando em, por exemplo, adesão pobre entre o epitélio e andaime quando utilizando um gel de colagénio 7 andaime. Como consequência, o andaime esofágica porcino acelular foi desenvolvido, com a vantagem de ser um andaime biologicamente mais realista e, portanto, mais adequada para o uso como uma plataforma experimental. Também tem sido demonstrado que é melhor para incorporar células primárias para as construções esofágicas do que as linhas celulares imortalizadas esofágicas epiteliais, tais como Het-1A, uma vez que estas células formam um epitélio de múltiplas camadas, mas não conseguem diferenciar ou estratificar 4,7,8 . Por conseguinte, este protocolo foi adaptado a partir de um método já em uso no laboratório MacNeil para fazer o tecido da pele e mucosa oral engenharia 9,10 e incorpora um andaime de esôfago porcino de-celularizado combinado com células humanas primárias do esôfago epiteliais e fibroblastos. This protocolo produz, um epitélio estratificado maduro, semelhante ao do esófago humano normal como demonstrado por CK4, CK14, Ki67 e involucrina coloração. O modelo resultante proporciona uma plataforma experimental para estudar as respostas a factores de stress ambientais, e tem sido utilizada eficazmente para estudar alterações na expressão do gene no epitélio esofágico em resposta ao material refluído componentes 11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td align="right">215240</td>
			<td>Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilise. Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Labtech</td>
			<td>LM-D1112</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12</td>
			<td>Labtech</td>
			<td>LM-H1236</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Calf Serum</td>
			<td>Labtech</td>
			<td>FB-1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>R+D Systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>Prepare 200 &#181;g/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydorcortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0396</td>
			<td>Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2786</td>
			<td>Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2767</td>
			<td>Prepare 10 mg/ml solution in 0.01M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2036</td>
			<td>Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2752</td>
			<td>Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052</td>
			<td>Prepare stock solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>Brand name Fungizone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>BR0014</td>
			<td>Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilise</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">10103578001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine solution</td>
			<td>Ecolab</td>
			<td>10830E</td>
			<td>Brand name Videne</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">433209</td>
			<td>Prepare 1M solution and autoclave to sterilise before use (121 &#730;C for 15 min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td>Autoclave to sterilise before use (121 &#730;C for 15 min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn calf serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">26010074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td>Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9508</td>
			<td>Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td>Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-phosphorylethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0503</td>
			<td>Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS (insulin, transferrin, selenium)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-838Z</td>
			<td>Used for composite media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3924</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.02% solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 culture flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td align="right">11819650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml universal tube</td>
			<td>SLS</td>
			<td>SLS7504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>180 ml pot</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-2603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>SLS</td>
			<td align="right">150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stainless steel rings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Manufactured in house - medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>steel mesh grids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Manufactured in house - sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2cm (w) x2 cm (d) x 0.5 cm (h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ki67</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>KI67-MM1-L-CE</td>
			<td>Clone MM1 Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9004</td>
			<td>Clone 6B10 Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK14</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>LL002-L-CE</td>
			<td>Clone LL002 Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Involucrin</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>INV</td>
			<td>Clone&#160; SY5 Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OE21</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">96062201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OE33</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">96070808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Het-1A</td>
			<td>ATCC-LGC</td>
			<td>CRL-2692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse 3T3 fibroblasts</td>
			<td>ATCC-LGC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>previously growth arrested by irradiation (60 Gy)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, characterization and potential uses of a 3d tissue-engineered human esophageal mucosal model

A incidência de ambos adenocarcinoma de esôfago e seu precursor, metaplasia de Barrett, estão a aumentar rapidamente no mundo ocidental. Adenocarcinoma de esôfago, além disso, geralmente tem um prognóstico pobre, com pouca melhora nas taxas de sobrevivência nos últimos anos. Estas são condições difíceis de estudar e tem havido uma falta de plataformas experimentais adequadas para investigar perturbações da mucosa esofágica. Um modelo da mucosa esofágica humano foi desenvolvido no laboratório MacNeil que, ao contrário dos sistemas convencionais de cultura de células em 2D, recapitula as interacções célula-célula e célula-matriz presentes in vivo e produz, um epitélio estratificado maduro semelhante ao do ser humano normal esófago. Em resumo, o modelo utiliza células não transformadas fibroblastos humanos primários esofágicas epiteliais normais e cultivadas dentro de um andaime esofágica acelular derivada de porcino. Caracterização imuno-histoquímica desse modelopor CK4, CK14, Ki67 e involucrin coloração demonstra recapitulação adequada da histologia da mucosa do esôfago humano normal. Este modelo fornece um modelo experimental robusto, biologicamente relevante da mucosa do esôfago humano. Ele pode ser facilmente manipulado para investigar um certo número de perguntas de investigação, incluindo a eficácia dos agentes farmacológicos e o impacto da exposição a factores ambientais tais como o álcool, toxinas, temperatura elevada ou de componentes do refluxo gastro-esofágico. O modelo também facilita a períodos prolongados de cultura não realizáveis ​​com a cultura de células em 2D convencional, permitindo, nomeadamente, o estudo dos efeitos da exposição repetida de um epitélio madura para o agente de interesse para até 20 dias. Além disso, uma variedade de linhas celulares, tais como as derivadas de tumores esofágicos ou metaplasia de Barrett, pode ser incorporado no modelo para investigar processos tais como a invasão do tumor e droga responsiveness em um ambiente mais biologicamente relevante.

Este manuscrito descreve o processo necessário, mostrado de forma esquemática na Figura 1, a cultura de modelos em 3D do epitélio humano esofágica com sucesso. Para confirmar a adequação do modelo como uma plataforma experimental histológica e imuno-histoquímica estudos foram realizados comparando com os tecidos cultivados mucosa escamosa esofágica humano normal. A avaliação histológica do epitélio produzida pelo método descrito mostra um, de múltiplas camadas...

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Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Este manuscrito descreve a produção, caracterização e usos potenciais de uma engenharia de tecidos construção de esôfago 3D preparado a partir de fibroblastos de esôfago normais primária humana e células epiteliais escamosas semeadas dentro de um andaime porcino de-celularizado. Os resultados demonstram a formação de um epitélio estratificado maduro semelhante ao esófago humano normal.

Produção, Caracterização e usos potenciais de uma mucosa esofágica Modelo 3D Human Tissue-engenharia

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

production-characterization-potential-uses-3d-tissue-engineered-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.4K visualizações.  University of Sheffield.  Este manuscrito descreve a produção, caracterização e usos potenciais de uma engenharia de tecidos construção de esôfago 3D preparado a partir de fibroblastos de esôfago normais primária humana e células epiteliais escamosas semeadas dentro de um andaime porcino de-celularizado. Os resultados demonstram a formação de um epitélio estratificado maduro semelhante ao esófago humano normal. 

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Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of tri-leaflet polymer valve prostheses. However, identification of a protocol for initial assessment of polymer valve hydrodynamic functionality is paramount during the early stages of the design process. Traditional in vitro pulse duplicator systems are not configured to accommodate flexible tri-leaflet materials; in addition, assessment of polymer valve functionality needs to be made in a relative context to native and prosthetic heart valves under identical test conditions so that variability in measurements from different instruments can be avoided. Accordingly, we conducted hydrodynamic assessment of i) native (n = 4, mean diameter, D = 20 mm), ii) bi-leaflet mechanical (n= 2, D = 23 mm) and iii) polymer valves (n = 5, D = 22 mm) via the use of a commercially available pulse duplicator system (ViVitro Labs Inc, Victoria, BC) that was modified to accommodate tri-leaflet valve geometries. Tri-leaflet silicone valves developed at the University of Florida comprised the polymer valve group. A mixture in the ratio of 35:65 glycerin to water was used to mimic blood physical properties. Instantaneous flow rate was measured at the interface of the left ventricle and aortic units while pressure was recorded at the ventricular and aortic positions. Bi-leaflet and native valve data from the literature was used to validate flow and pressure readings. The following hydrodynamic metrics were reported: forward flow pressure drop, aortic root mean square forward flow rate, aortic closing, leakage&#160;and regurgitant volume, transaortic closing, leakage, and total energy losses. Representative results indicated that hydrodynamic metrics from the three valve groups could be successfully obtained by incorporating a custom-built assembly into a commercially available pulse duplicator system and subsequently, objectively compared to provide insights on functional aspects of polymer valve design.

There has been renewed interest in developing polymer valves. Here, the objectives are to demonstrate the feasibility of modifying a commercial pulse duplicator to accommodate tri-leaflet geometries and to define a protocol to present polymer valve hydrodynamic data in comparison to native and prosthetic valve data collected under near-identical conditions.

Protocolo Relativo Avaliação hidrodinâmica de Tri-folheto polímero Válvulas

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Bioengenharia

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

Geração e Alongamento das embarcações da engenharia de tecidos em um modelo de rato

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is limited to cell proliferation and gene expression endpoints. However, in the organism, mammary morphogenesis occurs in a 3D environment. 3D culture systems help bridge the gap between monolayer cell culture (2D) and the complexity of the organism. Herein, we describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action. It uses the commercially available hormone-responsive human breast epithelial cell line, T47D, and rat tail collagen type 1 as a matrix. This 3D culture model responds to the main mammotropic hormones: estradiol, progestins and prolactin. The influence of these hormones on epithelial morphogenesis can be observed after 1- or 2-week treatment according to the endpoint. The 3D cultures can be harvested for analysis of epithelial morphogenesis, cell proliferation and gene expression.

We describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action.

Um modelo de cultura 3D Hormone-responsive da Human glândula mamária Epitélio

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

A Tissue Combinada 3D Engineered<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Modelo de tumor de pulmão para prever a eficácia da droga em fundos específicos de mutação

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

Desenvolvimento de um modelo organotípicas multicelular tridimensional da Mucosa Intestinal Humano cultivadas sob microgravidade

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Engenharia de Tecido Tridimensional de Redes de Astrócitos Alinhadas para Recapitular Mecanismos de Desenvolvimento e Facilitar a Regeneração do Sistema Nervoso

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.

Uma nova técnica de sutura tenorrhaphy com enxerto de colágeno projetado por tecido para reparar defeitos grandes do tendão

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

Produção de elastina, como proteína hidrogel para encapsulamento e imunocoloração de células em 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Deteção da endotoxina em Nano-formulações usando Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) ensaios

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional tissue. Tissue engineering holds great promise as a potential solution with its ability to integrate cells and signaling molecules into a 3-dimensional scaffold. Recent work with tissue engineered tracheal grafts (TETGs) has seen some success but their translation has been limited by graft stenosis, graft collapse, and delayed epithelialization. In order to investigate the mechanisms driving these issues, we have developed a mouse model for tissue engineered tracheal graft implantation. TETGs were constructed using electrospun polymers polyethylene terephthalate (PET) and polyurethane (PU) in a mixture of PET and PU (20:80 percent weight). Scaffolds were then seeded using bone marrow mononuclear cells isolated from 6-8 week-old C57BL/6 mice by gradient centrifugation. Ten million cells per graft were seeded onto the lumen of the scaffold and allowed to incubate overnight before implantation between the third and seventh tracheal rings. These grafts were able to recapitulate the findings of stenosis and delayed epithelialization as demonstrated by histological analysis and lack of Keratin 5 and Keratin 14 basal epithelial cells on immunofluorescence. This model will serve as a tool for investigating cellular and molecular mechanisms involved in host remodeling.

Graft stenosis poses a critical obstacle in tissue engineered airway replacement. To investigate cellular mechanisms underlying stenosis, we utilize a murine model of tissue engineered tracheal replacement with seeded bone marrow mononuclear cells (BM-MNC). Here, we detail our protocol, including scaffold manufacturing, BM-MNC isolation, graft seeding, and implantation.

A propagação e a implantação de um enxerto traqueal biossintética engenharia de tecido em um modelo do rato

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...