As aplicações clínicas da traqueia projetada por tecidos foram limitadas devido à estenose do enxerto e à epitelialização retardada. Um modelo de rato de substituição traqueal ortotópica permite o estudo dos mecanismos celulares que conduzem a regeneração. Defeitos de longo segmento das vias aéreas podem exceder o que as terapias atuais são capazes de curar.
A traqueia de tecido oferece o potencial de criar um órgão de substituição para essas condições. Este modelo pode ser aplicado a animais com propriedades transgênicas e de rastreamento de linhagem. Podemos então modular os fatores hospedeiros que contribuem para a regeneração do enxerto.
Um dos principais desafios na produção dos andaimes será medir e determinar que os parâmetros de eletropinning são os mesmos de cada vez. Assim, toda vez que você produz um andaime, você precisa medir a distância de ponta a coletor, a umidade e a temperatura para garantir que os andaimes sejam os mesmos de cada vez. Fundamental para o sucesso deste modelo é o refinamento das técnicas microcirúrgicas e a manutenção do plano correto da anestesia para permitir ventilação espontânea durante todo o procedimento.
Uma vez que a traqueia hospedeira tem um diâmetro interno de cerca de um milímetro, o manuseio de enxerto e tecido nativo e a colocação da sutura são importantes e melhor demonstrados visualmente. Comece dissolvendo oito por cento de peso de tereftalato de polietileno, ou PET, em hexafluoroisopropanol e aquecendo a solução resultante a 60 graus Celsius. Enquanto a solução está sendo aquecida, dissolva três por cento de poliuretano, ou PU, em hexafluoroisopropanol, combinando as soluções uma vez que a solução PET tenha esfriado.
Carregue uma seringa de 60 mililitros equipada com uma agulha de ponta cega de 20 calibres com a mistura de polímero. Use a seringa e uma fonte de alimentação DC de alta tensão definida para 14 kilovolts positivos na agulha, outra fonte de alimentação DC de alta tensão definida para menos três quilovolts, uma taxa de fluxo de cinco milímetros por hora, e uma distância de ponta a substrato de 20 centímetros para eletrospintar o polímero em uma haste de aço inoxidável de um milímetro de diâmetro sendo girada a 350 rotações por minuto. Continue eletropinning até que uma espessura da parede do andaime de 300 micrômetros seja alcançada.
Em seguida, deslize o andaime da haste, coloque o andaime sob vácuo durante a noite para remover qualquer solvente residual e esterilize o andaime com uma dosagem de luz ultravioleta de 350 milímetros por centímetro quadrado por cerca de 15 minutos. Sob condições estéreis, remova a pele dos membros traseiros de um rato de seis a oito semanas de idade, fêmea, C57-Black/6 com tesoura fina e fórceps micro-Adson, e use dumont número cinco fórceps e pedóps dumont número 5/45 para remover a fáscia e os tendões. Separe os ossos para permitir que cada um deles seja cortado em ambas as extremidades, e use uma seringa de cinco mililitros equipada com uma agulha de calibre 25 para lavar a medula óssea em uma placa de Petri contendo 30 mililitros de meio RPMI.
Quando todos os ossos tiverem sido lavados, filtre a medula óssea através de um coador de células de nylon de 70 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros, e transfira o tubo para um armário de biossegurança. Adicione suavemente a solução de célula mononuclear filtrada ao lado de um tubo de 15 mililitros contendo cinco mililitros de polisucrose e diatrizoato de sódio sem misturar as camadas, e separe o plasma das células brancas e vermelhas do sangue por separação gradiente de densidade. No final da centrifugação, colete a camada limpa média composta pelas células mononucleares da medula óssea e lave as células mononucleares da medula óssea em uma proporção de um para um na PBS por centrifugação.
Resuspend a pelota em cinco mililitros de PBS para uma segunda lavagem, seguido de resuspensão em 10 mililitros de meio RPMI fresco para contagem. Em seguida, colete as células com uma centrifugação adicional, e dilua as células para uma vezes 10 para as sete células por cinco microliters de concentração de RPMI fresco. Antes de semear o andaime, corte o polímero para um comprimento de cinco milímetros, conforme necessário, e molhe o andaime com cinco microliters de meio RPMI por cinco minutos.
Ao final da incubação, remova o meio em excesso e carregue o lúmen do andaime com cinco microliters da solução de célula mononuclear de medula óssea por 10 minutos. Em seguida, insira uma agulha de calibre 21 através do lúmen do andaime, e coloque o enxerto em um mililitro de meio RPMI durante a noite em uma incubadora Celsius de 37 graus. Após a indução da anestesia geral, confirme a falta de resposta ao beliscão do dedo do dedo no animal receptor, e aplique pomada aos olhos do animal.
Corte o cabelo no local cirúrgico do queixo às clavículas, e coloque o animal em uma almofada cirúrgica em uma posição dorsal reclinável. Usando técnica asséptica, desinfete o local cirúrgico com um povidone-iodo sequencial, 70% etanol, série de limpeza de povidona-iodo, e mova o rato sob um microscópio dissecando com a cabeça às 12 horas. Use tesouras finas e fórceps micro-Adson para fazer uma incisão midline das clavículas para o osso hioide, e use dumont número cinco e número sete fórceps finos e um cotonete de algodão estéril para limpar a fáscia antes de inserir um retrátil colibri auto-retentor na incisão.
Use os fórceps para abrir os músculos da correia para expor a cartilagem tireoide, cartilagem cricoide e traqueia, e separar sem rodeios a traqueia dos nervos laríngeos recorrentes que correm paralelamente em ambos os lados do tecido, seguidos pela separação circunferencial da traqueia do esôfago. Usando uma agulha de calibre 20 e marcador cirúrgico, colora a porção anterior da traqueia. Faça uma incisão abaixo do terceiro anel de cartilagem traqueal usando um par de tesouras de mola Vannas-Tubingen e um par de fórceps finos Dumont número sete para ressecar uma seção de três anéis de traqueia.
Segurando a traqueia com as fórceps curvas finas, use uma sutura estéril de nylon 9-0 para fixar a extremidade distal da traqueia ao esterno para criar uma traqueostomia temporária, e use a agulha de calibre 20 e marcador cirúrgico para manchar a porção anterior do enxerto. Para implantar o enxerto, utilize uma sutura de nylon 9-0 estéril, Dumont número sete fórceps finos, e um suporte de agulha para inserir os pontos proximal-posterior, proximal-lateral e proximal-anterior, e girar o animal 180 graus. Quando o rato estiver em posição, solte a traqueostomia temporária e faça uma incisão lateral a cinco milímetros da porção anterior do enxerto para facilitar a anastomose distal.
Para completar a anastomose distal, coloque as suturas de forma semelhante à anastomose proximal, e se aproxime da posição do enxerto e dos músculos da correia. Em seguida, feche a incisão com suturas de nylon estéreis 9-0 em um padrão de corrida, e coloque o animal sozinho em uma gaiola de recuperação colocada em uma almofada de aquecimento com monitoramento até a recuperação completa. Duas semanas após a implantação, algumas células epiteliais basais podem ser observadas por queratina de células basais cinco e 14 manchas em seções de tecido de tecido projetados para enxerto traqueal.
Células basais também são detectadas na superfície luminal do enxerto aos sete dias após a implantação. Após a explantação e análise histológica, a estenose do enxerto tem sido identificada como o principal fator contribuinte em camundongos implantados com enxerto demonstrando sinais de dificuldade respiratória e estridor. Note-se que o telescoping do enxerto e da traqueia nativa é um achado comum como resultado da técnica cirúrgica.
A coloração para F4/80 revela macrófagos hospedeiros dentro da região estenórica do enxerto em conjunto com a presença das células epiteliais basais. Evite a manipulação dos nervos laríngeos recorrentes e certifique-se de que as suturas proximais e distais estejam no lugar para permitir uma vedação hermética na anastomose. Como este protocolo trata de células mononucleares de medula óssea derivadas de camundongos de agente de nível um de biossegurança, é importante usar equipamentos de proteção individual adequados para evitar contaminação.
