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NOTA: Todos os procedimentos que envolvam a utilização de animais são realizados de acordo com a legislação local. Nosso trabalho é aprovado pela Comissão Distrital de Saúde Bem-Estar Animal da Sydney Local. Os procedimentos autorizados estão descritas na documentação da licença do projeto e seguir as orientações que garantam o bem-estar do animal em todos os momentos. Assegurar o cumprimento da legislação sobre experimentação animal do país onde o trabalho é realizado. 1. Protocolo para Preparando EM Fixative <ol><li> Para 100 ml de fixador, preparar paraformaldeído por adição de 2 g de paraformaldeído em pó a 25 ml de água destilada em um balão de Erlenmeyer de calor, a 65 ° C, agitando constantemente com um agitador magnético. NOTA: O glutaraldeído, paraformaldeído e tampão cacodilato de sódio são todas as substâncias perigosas e devem sempre ser manuseados em fumehood. </li><li> Aquece-se a 65 ºC durante 2 min, em seguida, deixa-se arrefecer. Se necessário, adicionar solução de hidróxido de sódio dropwise agitando para limpar solução completamente. NOTA: hidróxido de sódio é perigoso, manusear com cuidado. </li><li> Adicionar 10 ml de estoque de glutaraldeído grau EM, 50 ml de tampão de cacodilato de sódio 0,2 M e 2 g de sacarose e agita-se com um agitador magnético. Adicionar 2 ml de 1,0 M de CaCl2. </li><li> Ajustar a pH 7,4 antes da solução até perfazer 100 ml com água destilada. O fixador final contém de 2,5% de glutaraldeído, paraformaldeído a 2%, 2 mmol CaCl2, 2% de sacarose em tampão de cacodilato 0,1 M. Certifique-se de que a osmolaridade total é de 440 mOsmol / L. Use dentro de 24 horas de preparação. </li></ol> 2. Fixação de Perfusão do Fígado <ol><li> Tampão de perfusão quente e fixador de 35-37 ºC. A temperatura correcta do tampão exsanguinação e fixador ajuda a assegurar a integridade do tecido. </li><li> Anestesiar o animal com uma injecção intraperitoneal única de 50 mg / kg de cetamina e 5 mg / kg de xilazina. </li><li> Uma vez que o animal está sobanestesia profunda, avaliada pela retirada da pata traseira e cauda pitada, uma incisão Y é feito com uma tesoura sem corte terminou em abdômen do animal para expor a veia hepática e portal. NOTA: Certifique-se de que o equipamento está limpo para evitar a contaminação das amostras com microorganismos e detritos geral que será facilmente visto em SEM. </li><li> Amarrar duas suturas muito soltas em torno da veia porta proximal para o fígado, o outro mais distalmente para o fígado. </li><li> Canular a veia porta com uma cânula de tamanho apropriado IV (18 G para ratos, 22 G para ratos) suturas .Aperte para garantir cânula. </li><li> Começar a perfusão com solução salina tamponada com fosfato aquecido a 37 ° C, e a uma pressão de 10 cm de H 2 0. Entre 5 e 20 ml de PBS, é geralmente necessária para desangrar o fígado. NOTA: Não para permitir que as bolhas de ar a entrar no fígado através dos tubos ligados à cânula, como eles induzem artefactos secundárias a embolização e pressão; Danos nos hepatócitos, sinusoids e fenestrações LSEC ocorre se a pressão de perfusão é demasiado elevada. </li><li> Cortar a veia cava abdominal e torácica para permitir que o tampão para sair livremente a partir do fígado. Isso evita danos alta contra-pressão para LSECs. </li><li> Uma vez que o fígado é livre de sangue, substitua com PBS EM fixador e perfundir durante aproximadamente 5 minutos, até que o fígado é endurecido e muito pálido. </li><li> Descontinuar a perfusão e cortar o fígado fixado em 1-2 mm3 blocos usando um bisturi afiado. </li><li> Tecido pós-fix em EM fixador para 24-72 horas a 4 ºC. NOTA: Em geral, underfixation causa mais artefatos do que com excessiva fixação. </li><li> Mudar fixador seguinte período pós-correção para tampão cacodilato de sódio 0,1 M para armazenamento a 4 ºC. NOTA: As amostras armazenadas desta forma será preservado por um período significativo de tempo (até 12 meses), a fixação secundária no entanto oportuno e exame é recomendado para melhores resultados. </li></ol> 3. Agulha Perfusion NOTA: fixação da agulha é uma variante da fixação de perfusão que envolve a injecção de fixador directamente no tecido do fígado de biópsia. O objectivo é que o fixador para ser liberado através dos vasos sanguíneos, a fim de desangrar-los e expor todo o bloco de tecido para fixador. Cuidados devem ser tomados para manter a pressão de injecção de baixa pressão para evitar ferimentos 18,19. <ol><li> Remover um pequeno pedaço de fígado do animal ou objecto e enxaguar em solução salina para remover o sangue e detritos. </li><li> Desenhar a solução salina normal para a seringa equipada com uma agulha de calibre fino (tipicamente uma seringa de insulina). </li><li> Injectar a solução salina muito lentamente para o fígado até que o sangue é empurrado para fora do tecido. As injecções múltiplas pode ser necessária. </li><li> Desenhar o fixador EM de outra seringa equipada com uma agulha de calibre fino (tipicamente uma seringa de insulina). </li><li> Injectar o fixador muito lentamente para o fígado até que se torne difícil e tan na cor. Injecção múltiplas pode ser necessária. </li><li> Corte o fígado fixado em 1-2 mm3 blocos usando um bisturi afiado. Incubar em fixador EM para 24 - 72 h a 4 ° C. Lavar 3 vezes em tampão cacodilato de sódio 0,1 M antes de iniciar a fixação secundário. </li></ol> 4. Preparação para Microscopia Eletrônica de Varredura <ol><li> Lavar amostra 3 vezes em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M. Para corrigir lipídios, pós fixar a amostra em 2% de tetróxido de ósmio em tampão cacodilato de sódio 0,1 M durante 2 h. NOTA: Completo de lavar roupa é muito importante como cross glutaraldeído e tetróxido de ósmio reagir e gerar artefatos em SEM. </li><li> Lavar as amostras em concentrações crescentes de etanol, para se iniciar a desidratação. Primeira lavagem em etanol a 50% durante 5 minutos; em seguida, 3 vezes durante 5 min com 70% de etanol; lavar três vezes durante 5 min com 90% de etanol; lavar duas vezes durante 5 min em etanol a 100%; e finalmente lavar duas vezes durante 10 min em etanol a 100% (crivo molecular). </li><li> Remover todo o etanol a partir das amostras<html> e substituir com hexametildissilazano (HMDS) em fumehood e deixe por 10 min. Remover HMDS a partir das amostras de tecidos e deixa-se evaporar. NOTA: HMDS é altamente higroscópico quando frio, portanto, permitir atingir a TA antes de usar pela etapa final desidratação. </li><li> Opcionalmente, montar as amostras imediatamente ou colocá-los em um dessecador até que esteja pronto para montar para SEM. </li></ol> 5. Montagem NOTA: montagem exemplar correto irá maximizar o número de sinusoids claramente delineados disponíveis para análise em MEV. <ol><li> Rotular a base dos metais tocos SEM e aplicar fita de carbono condutora dupla face para o topo da tocos. </li><li> Visualizar amostras usando um microscópio de dissecação para identificar a superfície com as melhores sinusóides para subsequente SEM. Coloque a superfície para cima sobre a superfície da fita de carbono do topo. </li><li> Espécimes da vara firmemente ao topo, as amostras estão agora prontas para revestimento por pulverização. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 6. Revestimento NOTA: O revestimento da peça com uma fina película de metal condutor (ouro ou platina) em um recinto sputter coater o modelo e protege contra danos provenientes de um feixe de elétrons. Se o revestimento é muito grosso estruturas de interesse pode ser obscurecida. <ol><li> Coloque tocos na câmara de vácuo automática de revestidor por crepitação fina, para o modo de rotação e de revestimento por pulverização automático definido para 45 segundos. Use revestimento de platina para mais fino detalhamento, no entanto ouro também é adequado. </li><li> Aplicar uma fina camada de tinta de carbono para as superfícies externas das amostras de fígado montados, tomando cuidado para não revestir as superfícies sinusoidais. </li><li> Uma vez que as amostras são revestidas com platina e carbono tinta ter secado eles estão prontos para a observação sobre o SEM. As amostras podem ser armazenadas num exsicador. </li></ol> 7. Usando o Microscópio Eletrônico de Varredura <ol><li> Lugar espécimes em microscópio eletrônico de varredura e microscópio para retornar vácuo. &lt;/ Li&gt; <li> Usando procedimentos operacionais padrão microscópio para visualização de espécimes dando início a uma ampliação baixa, aumentando gradualmente a ampliação. </li><li> Certifique-se o microscópio é ajustado apropriadamente para trabalhar a distância, tamanho de ponto e astigmatismo. </li><li> Verifique se há integridade fixação. Se o LSEC é na maior parte livre de lacunas e contém fenestrations medição 30-250 nm de diâmetro isso geralmente indicam que a preparação de amostras foi bem sucedida. </li><li> Se os sinusoids estão cheios de lacunas ou desprovido de fenestrações a preparação da amostra não foi bem sucedida ou se houver patologia significativa. Neste caso, cortar a amostra com uma lâmina de barbear muito fina, e as superfícies de corte recoberto e analisados ​​por sinusóides fixos com sucesso. </li><li> Em aproximadamente 15.000-20.000 × ampliação seleccionar LSEC superfícies planas que estão livres de detritos com boa fixação e onde as fenestrações são claramente visíveis (contendo tipicamente pelo menos 10 fenestrações). </li><li> Excepto imagens de pelo menos 10 por sinusóides do fígado, a partir de diferentes áreas dos blocos, utilizando, pelo menos, dois blocos por fígado. Amostragem 10 micrografias a 15.000 - 20.000 × ampliação por animal é geralmente suficiente para a quantificação de fenestrações para ser representativa de todo o fígado. </li></ol> 8. Análise NOTA: O software ImageJ, que pode ser baixado gratuitamente a partir do NIH é utilizada para quantificar diâmetro fenestration e frequência ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij">www.imagej.nih.gov/ij</a> ). <ol><li> Abrir imagem J e definir a escala usando a barra de escala embutido na imagem (Screen shot 1). </li><li> Usando a ferramenta de polígono em ImageJ, traço em torno de toda a área plana do LSEC incluindo áreas fenestrados e defenestrado. Não basta traçar os pratos perfurados, pois isso vai falsamente inflacionar porosidade. Excluir qualquer grandes peças de detritos que estão na superfície celular, que pode ser obscurifenestrations GN. </li><li> Para medir o diâmetro fenestration, traçar uma linha através do maior diâmetro de cada fenestration selecionando a ferramenta de linha, e pressionar &quot;m&quot; para medir a linha, e &quot;d&quot; (empate) para desenhar de forma permanente a linha na imagem. Esta linha é definido como o diâmetro fenestraï¿½o. O comprimento da linha de agora estará disponível na caixa de ImageJ de resultados (Screen shot 2). </li><li> Medir todos os espaços que são furos maiores no citoplasma LSEC superior a 250 nm, assim como fenestrações. As lacunas são muitas vezes artefatos que refletem má perfusão ou fixação, no entanto lacunas também pode ocorrer como resultado de uma doença e toxicidade. Os dados para as lacunas serão excluídos do cálculo dos parâmetros fenestration mais tarde na análise. </li><li> A área de lacunas que não são circulares deve ser calculada pelo traçado em torno das lacunas e calcular sua área em ImageJ. </li><li> Cole os dados da caixa de resultados em ImageJ em uma planilha do Excel para furtheanálise r. </li></ol> 9. Cálculos <ol><li> Média fenestration diâmetro = média de todos os diâmetros fenestration (não incluindo as lacunas, onde as lacunas são ≥ 250 nm). </li><li> Área Fenestração = πr 2, onde r, o raio, é calculado a partir do diâmetro fenestrações indivíduo (R = d / 2), não incluindo lacunas. </li><li> Porosidade (%) = (Σ (πr 2) Área total analisado / - Σ (área de hiatos =)) (2 ^ M)) x 100. </li><li> Frequência Fenestration = número total de fenestrações / (área total analisado-Σ (área de lacunas) (mm 2). </li></ol> 10. Apresentação de Dados Fenestration NOTA: Sempre que possível, publicações, incluindo a quantificação de dados fenestration deve incluir as seguintes informações <ol><li> Fenestration diâmetro, com uma declaração confirmando o que diâmetros de fronteira onde usado para definir fenestrations (tipicamenteentre 50-250 nm), Fenestração frequência (número / uM 2) e a porosidade (%). </li><li> Uma indicação que confirma se lacunas foram incluídos na análise, gráfico de distribuição de frequências de diâmetro fenestraï¿½o e o número de blocos, os fígados, imagens e fenestrações devem ser incluídos na análise. </li></ol>

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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+oxidative+stress+on+the+liver+sieve.">The effects of oxidative stress on the liver sieve.</a> J Hepatol. 41 (3), 370-376 (2004).</li><li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrations.">Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations.</a> J Struct Biol. 171 (3), 382-388 (2010).</li><li>Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+atomic+force+microscopy+study+on+living+skin+fibroblasts+and+liver+endothelial+cells.">A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells.</a> J Electron Microsc. 50 (4), 283-290 (2001).</li><li>Monkemoller, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+fenestrations+in+liver+sinusoidal+endothelial+cells+by+optical+localization+microscopy.">Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy.</a> Phys Chem Chem Phys. 16 (24), 12576-12581 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

A capacidade de medir de forma precisa e reprodutivelmente o estado do endotélio sinusoidal fígado é um passo importante na compreensão da biologia destas células altamente especializadas. Novas técnicas, como a microscopia de iluminação estruturada 32, microscopia de força atômica e 33 d-STORM (direto Stochastic Optical Reconstrucion Microscopia) 34 irá transmitir informações importantes sobre a morfologia destas células in vitro, mas SEM continua a ser a principa...

As células endoteliais sinusoidais hepáticas (LSECs) são altamente diferenciadas, células endoteliais que revestem a parede da sinusóide hepática. LSECs são perfuradas com fenestrações que são não-diaphragmed, transcelular poros de 50-250 nm de diâmetro. Até 20% da superfície é coberta por LSECs fenestrações, que são geralmente em grupos de dezenas a centenas chamadas placas de peneira 1-3 (Figura 1). Fenestrações permitir a transferência de plasma e nanosubstrates entre o sangue e hepatócitos, a criação de um sistema de ultrafiltração é altamente eficiente. Fenestrações são estruturas dinâmicas - tanto o seu tamanho e / ou o número pode ser alterado em resposta a vários estados fisiológicos, de drogas, e doença. Por exemplo, fenestrations são maiores no jejum do que no estado alimentado 4; 2-di-iodoamphetamine aumenta número fenestration; 5,6 e uma redução no tamanho e número de fenestrações por célula ocorre em envelhecimento e muitos estados doença 13/7 </sup&gt;. A medição precisa do tamanho e número de fenestrações é importante para a compreensão de como LSEC morfologia é influenciado por várias doenças, tóxicos e estados fisiológicos; o seu impacto sobre a função hepática; e para o desenvolvimento de moduladores fenestraï¿½o intervenções terapêuticas 1. O estudo de fenestrações é difícil. O diâmetro das fenestrações se encontra abaixo da resolução da microscopia óptica convencional, de modo que anteriormente apenas a observação por microscopia de electrões, tanto em tecido do fígado ou cultivadas LSECs intactos tem sido possível. O microscópio eletrônico de varredura (SEM) tem sido mais frequentemente utilizado para estudar tamanho fenestration, a frequência ea porosidade (a percentagem de membrana LSEC que é perfurado por fenestrations) porque SEM permite a observação de grandes áreas de superfície endotelial e medição de milhares, se não dezenas de milhares de fenestrações. Apesar de sua utilidade, os resultados que são relatados a partir de estudos baseados SEM-paraLSEC parâmetros como o tamanho fenestraï¿½o, número, frequência e a porosidade pode variar amplamente na literatura (Quadro 1). Fenestrações e pratos perfurados são estruturas frágeis que contrato, quebram, dilatam ou se aglutinam durante a preparação de amostras, processamento, assim, o cuidado é necessário para preservar a sua integridade. A pressão de perfusão elevada 14; osmolaridade incorreto do fixador e buffers 15; fixação inadequada ou fixação do tempo; e velocidade de desidratação pós-fixação e secagem são todas as áreas de processamento para SEM que podem produzir produtos manufacturados que interferem com a preservação da ultraestrutura (Figura 2). Perda de fenestrações (&#39;defenestration&#39;) e fenestraï¿½o encolhimento pode ocorrer como resultado de má fixação, resultando na redução de diâmetro e porosidade fenestraï¿½o célula. Métodos para melhorar a conservação de amostras para análise em MEV foram descritos anteriormente 15-17 e será discutidoaqui com dicas adicionais sobre como melhorar a preservação da amostra. Os principais objectivos da preservação espécime são para remover o sangue dos sinusóides, de modo que a superfície do LSEC pode ser visualizado e para evitar danos ou LSEC de alta pressão ou fixação retardada. Perfusão do fígado inteiro de fixador através da veia portal é o método preferido para a fixação hepática. Tal como descrito em pormenor noutro 16,18 perfusão deve ser efectuada a baixa pressão (por exemplo, 10 cm de H 2 0) para evitar artefactos relacionados com a pressão de perfusão e os danos para a LSEC, tipicamente manifestada como grandes lacunas dentro da membrana celular. No entanto, muitas vezes fixação razoável pode ser obtido utilizando a agulha de perfusão de biópsias de fígado de seres humanos e animais, tal como descrito em detalhe noutro local 19. Esta técnica envolve a injeção diretamente fixador para o tecido até que o sangue é liberado para fora da amostra eo tecido é firme e fixo. Fixação de amostras para a microscopia de electrões tem de ser perfORMED tão rapidamente quanto possível a seguir à interrupção do fluxo de sangue para evitar alterações ultra-estruturais que ocorrem como resultado dos processos fígados autoliticas extremamente rápidas. Nós também apresentamos um método de análise de imagem que minimiza a inclusão de artefactos, e padroniza a medição das fenestrações. Variação na seleção de senóides para micrografias, análise de imagens de artefatos, e medição de área celular para porosidade e fenestration frequência levaram a grandes discrepâncias nos resultados publicados. A abordagem padronizada de avaliação e medida de fenestrações e os requisitos mínimos para a apresentação dos dados não tenham sido claramente abordada na literatura anteriormente 4,10,20-31.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="658">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Name of material</td>
			<td style="width:100px;">Company</td>
			<td style="width:93px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:311px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:155px;">EM grade Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:100px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:93px;">C001</td>
			<td style="width:311px;">Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:155px;">Paraformaldehyde powder</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td style="width:311px;">Always prepare Paraformaldehyde fresh</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:155px;">Sodium Cacodylate powder</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">C0250</td>
			<td style="width:311px;">Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:155px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">C1016</td>
			<td style="width:311px;">Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:155px;">Osmium tretroxide</td>
			<td style="width:100px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:93px;">C011</td>
			<td style="width:311px;">Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:155px;">Ethanol- Absolute</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>459836&#160;</td>
			<td style="width:311px;">100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Other grades of Ethanol</td>
			<td style="width:100px;">Labtech</td>
			<td style="width:93px;">EL5</td>
			<td style="width:311px;">Prepare graded Ethanols with dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:155px;">Hexamethyldisilazane</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>52619&#160;</td>
			<td style="width:311px;">Allow to reach room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:155px;">Cannulas</td>
			<td style="width:100px;">Terumo</td>
			<td style="width:93px;">TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C</td>
			<td style="width:311px;">18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:155px;">Conductive Carbon tape</td>
			<td style="width:100px;">ProSciTech</td>
			<td>IA0201</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:155px;">Carbon Paint</td>
			<td style="width:100px;">ProSciTech</td>
			<td>I003</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">Ketamine</td>
			<td style="width:100px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:311px;">Must be optained under licence</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">Xylazine</td>
			<td style="width:100px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:311px;">Must be obtained under licence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:155px;">Molecular Sieve</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">208647</td>
			<td style="width:311px;">Removes water from the 100 % Ethanol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a standardized method for the analysis of liver sinusoidal endothelial cells and their fenestrations by scanning electron microscopy

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures - both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.

Visualização inicial em baixa ampliação por microscopia eletrônica de varredura revela uma superfície plana da amostra do fígado com uma área exposta grande o suficiente para observar muitas grandes vasos hepáticos e sinusóides (Figura 1A). Assegurar a colocação de bloco de fígado correta na montagem stub é essencial para a obtenção de imagens claras dos sinusóides e cápsula do fígado do Glisson deve ser evitado por este motivo (Figura 1B). O aumento da ampliação pe...

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A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

Um método padronizado para a Análise do fígado sinusoidal células endoteliais e Seus fenestrações por Microscopia Eletrônica de Varredura

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

a-standardized-method-for-analysis-liver-sinusoidal-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K visualizações.  University of Sydney and Concord Hospital. The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

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In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Biologia

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

O isolamento de células endoteliais de Murino Válvula

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix biology, there are still major gaps related to how the matrix is formed, how physiological and pathological remodeling differ, and most importantly how matrix dynamics might be manipulated to promote healing and inhibit fibrosis. There is currently no treatment option for controlling, preventing, or reversing cardiac fibrosis. Part of the reason is likely the sheer complexity of cardiac scar formation, such as occurs after myocardial infarction to immediately replace dead or dying cardiomyocytes. The extracellular matrix itself participates in remodeling by activating resident cells and also by helping to guide infiltrating cells to the defunct lesion. The matrix is also a storage locker of sorts for matricellular proteins that are crucial to normal matrix turnover, as well as fibrotic signaling. The matrix has additionally been demonstrated to play an electromechanical role in cardiac tissue. Most techniques for assessing fibrosis are not qualitative in nature, but rather provide quantitative results that are useful for comparing two groups but that do not provide information related to the underlying matrix structure. Highlighted here is a technique for visualizing cardiac matrix ultrastructure. Scanning electron microscopy of decellularized heart tissue reveals striking differences in structure that might otherwise be missed using traditional quantitative research methods.

Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

Microscopia Eletrônica de Varredura do Tecido macerado para visualizar a matriz extracelular

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we describe a technique for studying the supramolecular organization of photosynthetic (thylakoid) membranes within leaf samples. This is achieved by high-pressure freezing of leaf tissues, freeze-fracturing, double-layer coating and finally cryo-SEM imaging. Use of the double-layer coating method allows acquiring high magnification (&#62;100,000X) images with minimal beam damage to the frozen-hydrated samples as well as minimal charging effects. Using the described procedures we investigated the alterations in supramolecular distribution of photosystem and light-harvesting antenna protein complexes that take place during dehydration of the resurrection plant Craterostigma pumilum, in situ.

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

Estudar a Organização supramolecular de fotossintéticas membranas dentro de tecidos foliares Freeze-fraturados por Cryo-Microscopia Eletrônica de Varredura

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Protocolos para a Problemática da planta, oomiceto e amostras fúngicas

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to cells, tissues, organelles, and even whole organisms. This protocol focuses on two chemical drying methods, hexamethyldisilazane (HMDS) and t-butyl alcohol (TBA), and their application to imaging of both prokaryotic and eukaryotic organisms using SEM. In this article, we describe how to fix, wash, dehydrate, dry, mount, sputter coat, and image three types of organisms: cyanobacteria (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp., and an unknown sp.), two euglenoids from the genus Monomorphina (M. aenigmatica and M. pseudopyrum), and the fruit fly (Drosophila melanogaster). The purpose of this protocol is to describe a fast, inexpensive, and simple method to obtain detailed information about the structure, size, and surface characteristics of specimens that can be broadly applied to a large range of organisms for morphological assessment. Successful completion of this protocol will allow others to use SEM to visualize samples by applying these techniques to their system.

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

SEM analysis is an effective method to aid in species identification or phenotypic discrimination. This protocol describes the methods for examining specific morphological details of three representative types of organisms and would be broadly applicable to examining features of many organismal and tissue types.

Preparação de organismos procariotas e eucariotas, utilizando secagem química para análise morfológica em microscopia eletrônica (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparação de amostras biológicas por congelamento de alta pressão, realce de contraste assistida por microondas e resina mínima incorporação para a imagem latente de Volume

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise subcellular localization of proteins is thus important for answering many biological questions. The quest for a robust label to identify protein localization combined with adequate cellular preservation and staining has been historically challenging. Recent advances in electron microscopy (EM) imaging have led to the development of many methods and strategies to increase cellular preservation and label target proteins. A relatively new peroxidase-based genetic tag, APEX2, is a promising leader in cloneable EM-active tags. Sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) has also advanced in recent years with the advent of cryofixation by high pressure freezing (HPF) and low-temperature dehydration and staining via freeze substitution (FS). HPF and FS provide excellent preservation of cellular ultrastructure for TEM imaging, second only to direct cryo-imaging of vitreous samples. Here we present a protocol for the cryoAPEX method, which combines the use of the APEX2 tag with HPF and FS. In this protocol, a protein of interest is tagged with APEX2, followed by chemical fixation and the peroxidase reaction. In place of traditional staining and alcohol dehydration at room temperature, the sample is cryofixed and undergoes dehydration and staining at low temperature via FS. Using cryoAPEX, not only can a protein of interest be identified within subcellular compartments, but also additional information can be resolved with respect to its topology within a structurally preserved membrane. We show that this method can provide high enough resolution to decipher protein distribution patterns within an organelle lumen, and to distinguish the compartmentalization of a protein within one organelle in close proximity to other unlabeled organelles. Further, cryoAPEX is procedurally straightforward and amenable to cells grown in tissue culture. It is no more technically challenging than typical cryofixation and freeze substitution methods. CryoAPEX is widely applicable for TEM analysis of any membrane protein that can be genetically tagged.

This protocol describes the cryoAPEX method, in which an APEX2-tagged membrane protein can be localized by transmission electron microscopy within optimally-preserved cell ultrastructure.

O Método CrioAPEX para Análise de Microscopia Eletrônica da Localização da Proteína da Membrana dentro de células ultraestruturalmente preservadas

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission Electron Microscopy (TEM) provided insight into cell ultrastructure, but in the recent decade, the development of modern Scanning Electron Microscopes (SEM) has changed the way of looking inside the cells. Even though the resolution of TEM is superior when protein-level structural details are needed, SEM-resolution is sufficient for the majority of the organelle-level cell biology-related questions. The advancement in technology enabled automatic volume acquisition solutions such as Serial block-face imaging (SBF-SEM) and Focused ion beam SEM (FIB-SEM). Nevertheless, to this day, these methods remain inefficient when the identification and navigation to areas of interest are crucial. Without the means for precise localization of target areas before imaging, operators need to acquire much more data than they need (in SBF-SEM), or, even worse, prepare many grids and image them all (in TEM). We propose the strategy of "lateral screening" using Array Tomography in SEM, which facilitates the localization of areas of interest, followed by automated imaging of the relevant fraction of the total sample volume. Array tomography samples are conserved during imaging, and they can be arranged into section libraries ready for repeated imaging. Several examples are shown in which lateral screening enables us to analyze structural details that are incredibly challenging to access with any other method.

We describe the preparation of ribbons of serial sections and their collection on large transfer support for use as Array Tomography samples, along with automated imaging procedures in a scanning electron microscope. The protocol allows screening, retrieval, and targeted imaging of local, rare events, and the acquisition of large data volumes.

Fluxo de trabalho de tomografia de array para a aquisição direcionada de informações de volume usando microscopia eletrônica de varredura

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, offering an unprecedented three-dimensional view of tissue microanatomy. While SBF-SEM has seen an exponential increase in use in recent years, technical aspects such as proper tissue preparation and imaging parameters are paramount for the success of this imaging modality. This imaging system benefits from the automated nature of the device, allowing one to leave the microscope unattended during the imaging process, with the automated collection of hundreds of images possible in a single day. However, without appropriate tissue preparation cellular ultrastructure can be altered in such a way that incorrect or misleading conclusions might be drawn. Additionally, images are generated by scanning the block-face of a resin-embedded biological sample and this often presents challenges and considerations that must be addressed. The accumulation of electrons within the block during imaging, known as "tissue charging," can lead to a loss of contrast and an inability to appreciate cellular structure. Moreover, while increasing electron beam intensity/voltage or decreasing beam-scanning speed can increase image resolution, this can also have the unfortunate side effect of damaging the resin block and distorting subsequent images in the imaging series. Here we present a routine protocol for the preparation of biological tissue samples that preserves cellular ultrastructure and diminishes tissue charging. We also provide imaging considerations for the rapid acquisition of high-quality serial-images with minimal damage to the tissue block.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

This protocol outlines a routine method for using serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM), a powerful 3D imaging technique. Successful application of SBF-SEM hinges on proper fixation and tissue staining techniques, as well as careful consideration of imaging settings. This protocol contains practical considerations for the entirety of this process.

Microscopia eletrônica de varredura de blocos de bloco serial (SBF-SEM) de amostras de tecido biológico

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...