Este trabalho é suportado por concessões do NCI 1R01CA154656, NIAID 1R21AI092299, Cancer Research Institute, da Fundação St. Baldrick, a Fundação Dana, Gabrielle Angel Foundation, e Hyundai Motors da América &quot;esperança sobre rodas&quot; Programa.

1. Assembléia Titular do mouse <ol><li> Sobrepor a tampa de um 100-mm placa de Petri de vidro no topo de uma tampa prato de 100 mm de plástico Petri virado para baixo. O vidro deve ser quase sem tocar no ponto central do prato de plástico. Usar o vidro como um estêncil, traçar uma marca para o prato de plástico. </li><li> Usar uma broca de mão (isto é, Dremel) para remover uma porção de uma tampa prato de 100 mm de plástico para criar uma plataforma em forma de crescente. Esta tampa de plástico em forma de crescente irá servir como um suporte para a parte superior do tronco do rato (Figura 1a). Faça dois furos na tampa em forma de crescente para garantir a máscara de gás com um laço de torção metal. Fixar a tampa de plástico para a borda da placa de Petri de vidro usando super cola ou um adesivo equivalentemente forte (Figura 1b). </li><li> Cole as tampas de duas abobadado-tampão de PCR tubos (cortado na dobradiça) 1 cm de distância do centro do prato de fundo para o propósito de ancoragem retalhos poplíteos. </li></ol> 2. Preparação do mouse <strong&gt; Nota: Com a prática, deve ser capaz de realizar a preparação do mouse e passos cirúrgicos em 20-30 minutos. <ol><li> Anestesiar o rato com isoflurano (2 a 2,5% para a indução, 1,5 a 2% para a cirurgia / imaging) misturado em 1:1 O 2: mistura de ar com um caudal de 1l/min usando um procedimento IACUC-aprovado. Uma vez que o mouse está anestesiado, garantir uma máscara de gás sobre o nariz com fita adesiva. Determinar se o mouse está totalmente anestesiado pela falta de resposta aos pés e / ou pitadas de cauda. O nível de isoflurano pode ser ajustada em conformidade para assegurar que o animal está totalmente sedado, com uma constante, não-trabalhado taxa respiratória entre 60-80 respirações / min. </li><li> Use um cortador elétrico para remover os pêlos na perna traseira direita e região inguinal do rato. </li><li> Escove o cabelo solto longe e suavemente aplique uma camada de loção Nair modesto para a área raspada com um cotonete. Após um minuto de aplicação inicial, remover o Nair e limpar a pele exposta com uma humidadetoalha de papel. Verifique se o mouse está limpa e seca antes de prosseguir. </li><li> Fazer uma incisão milímetros de pequenas dimensões 2 a 3, com uma tesoura no joelho direito para expor o tendão extensor. </li><li> Aplicar Vetbond ao longo do centro do titular do rato em que o corpo do rato e da perna será posicionado. Cuidadosamente garantir o mouse sobre o titular, com o joelho direito para baixo, para expor a fossa poplítea direita. Fixe o tendão do joelho direito com Vetbond entre os 2 suportes de retalhos cutâneos para ajudar a estabilizar o campo de imagem. </li><li> Estiramento ea fita dos braços e das pernas esquerda para a plataforma superior do suporte. </li><li> Use um laço de torção para garantir a máscara de gás no local. </li><li> Coloque o suporte sob o microscópio de dissecção. O LN deve permanecer absolutamente imóvel, independente do movimento de respiração do mouse. Por conseguinte, devem ser tomadas precauções durante a realização da cirurgia, para optimizar a estabilidade da perna. Determinar a posição da cauda (tipicamente acima da cabeça), que vai contribuir para a maiorestabilidade para a perna direita e fita a cauda para baixo. </li></ol> 3. Cirurgia <ol><li> Enquanto no âmbito dissecção, manter a temperatura do mouse corpo usando um aquecedor ou uma almofada de aquecimento. Para imagem bem sucedida da LN poplítea, é crítico para sustentar a temperatura do corpo adequada em toda a cirurgia, bem como para preservar a humidade do tecido através da aplicação constante de PBS morno para o tecido exposto. </li><li> Esterilizar a pele com Betadine. Utilizando uma tesoura estéreis, fazer uma incisão na linha média através da pele à direita meados de vitelo, e continuar o corte verticalmente para cima para a porção superior da coxa direita. </li><li> Faça duas incisões na pele horizontal na parte superior da linha de incisão vertical para criar as abas de pele de cada lado. </li><li> Recolha e cola abaixo de ambos os retalhos cutâneos com Vetbond. Puxar a pele esticada antes de aplicar Vetbond continuará a promover a estabilidade da perna, no entanto, certifique-se que a tensão da pele não obstruir o fluxo de sangue (ou seja, alterações na vessëcor l ou diâmetro). Continuar a cola para baixo outras áreas da pele para assegurar a estabilidade da perna antes de expor o LN. O tamanho do mouse irá determinar o quanto a pele extra é necessário para cola para baixo. Tipicamente, os ratinhos maiores irá exigir mais pele para ser colada ao titular. </li><li> O LN deve estar dentro da fossa poplítea, quer para a direita ou esquerda da veia poplítea, dependendo do posicionamento do mouse sobre o titular. Separe cuidadosamente a LN dos tecidos adiposos e dos músculos que cercam usando micro-dissecção pinças e pinças. Para minimizar a hemorragia e trauma, utilizar as técnicas de espalhamento com micro-dissecando pinças para tecidos separados. Cuidadosamente expor o LN poplítea sem comprometer a integridade dos vasos sanguíneos aferentes e eferentes e os vasos linfáticos aferentes. </li><li> Para a estabilidade do tecido adicionada, uma tampa de vidro quadrada pode ser posicionada sobre o LN molhada, quase sem tocar o LN evitando ao mesmo tempo de oclusão do vaso. A tampa de vidro pode ser secured com a modelagem de argila em ambos os lados do rato. </li><li> Corantes fluorescentes vasos de vários tamanhos (por exemplo, TRITC-dextrano, mínimo de 70kDa) pode ser introduzido por via intravenosa, neste ponto para ajudar a realçar a relação estrutural e integridade da LN durante imagem. </li></ol> 4. 2-Photon Aquisição de imagem ** <ol><li> Uma vez que o LN é adequadamente exposto e para a estabilidade é conseguida, prontamente transferir todo o conjunto de porta do rato para a fase microscópio equipado com uma temperatura de almofada de feedback programável de aquecimento controlado, em uma câmara de microscópio ambiental mantida a 37 ° C. Adicionar o suficiente estéril quente (37 ° C) ou PBS HBSS para submergir o LN. O volume irá mudar, dependendo do tamanho e da colocação do rato. Alternativamente, PBS morno ou HBSS pode ser aplicado directamente ao LN dissecados através de uma pipeta de vidro fino equipado a uma bomba peristáltica e colada à coluna da lente objectiva de imersão. O fluxo do líquido deve ser tal que umacoluna de água estável pode ser mantida entre a lente eo tecido. </li><li> Manter a temperatura PBS ou HBSS a 37 ° C utilizando uma almofada de aquecimento com uma sonda de realimentação. Uma sonda de temperatura separado deve ser colocado no suporte do rato para confirmar a temperatura da PBS na gama de 36,5-37,5 ° C. Uma sonda rectal podem também ser utilizados para monitorizar a temperatura corporal do rato ao longo da sessão experimental de imagem. </li><li> Use uma lâmpada epi-fluorescente para ajudar a orientar a colocação LN no âmbito do objectivo. Adquira pilhas de imagens fluorescentes usando intervalos de tempo que são apropriados para a interação desejada celular (tipicamente minutos 10 segundos a 1 entre cada pilha imagem xyz). </li><li> Monitorizar o estado do animal na câmara de microscópio com frequência por inspecção visual ou usando um sistema de monitorização animal. Determinar se o mouse está totalmente anestesiado pela falta de resposta aos pés e / ou pitadas de unha, e uma constante, a taxa de não-trabalhado respiratória entre 60-80 breaths / min. O nível de isoflurano pode ser ajustada em conformidade para assegurar que o animal está totalmente sedado. Com acompanhamento adequado e hidratação, os animais podem ser visualizados por 4-6 horas, ou possivelmente mais. </li><li> Após a experiência de imagem, euthanize do animal em uma câmara de 2 CO usando IACUC-aprovado protocolo eutanásia. O animal não deve ser autorizado a sair da anestesia antes da eutanásia. </li></ol> ** Este procedimento cirúrgico pode também ser útil para outras formas de imagiologia intravital com excepção 2P-LSM. 5. Os resultados representativos Várias células imunológicas circulantes são recrutados para o LN em taxas diferentes após a transferência adotiva. Para T CD4 + e CD8 +, estas células começam a chegar no LN através das altas endoteliais vénula (HEV) minutos após iv de transferência com números substanciais que chegam à LN poplítea após 2 a 4 horas 6,17-18. Para B cells, um número substancial irá acumular-se depois de 8 a 24 horas 19. DCs ativadas devem começar a aparecer nos drenagem poplítea LN 8 a 16 horas após a injeção pata 3,11,16-17. Figura 2a mostra que, mesmo sem outros marcos, estruturas como folículos de células B pode ser percebido facilmente pelo acúmulo de células redondas esférico visível sob 2P-LSM 19. Usando um repórter fluorescente endógeno, tais como os esplenócitos ubiquitina-GFP (Figura 2, videos Suplementar 1 e 2), pode-se controlar estas migrações de linfócitos e comportamentos de dias até uma semana sob-estimulatórias não condições fisiológicas. Com multi-canal detectores de alta sensibilidade, é possível adquirir um conjunto de dados de imagem multiplex que engloba informações estruturais, bem como a dinâmica de interação entre os vários parceiros celulares 17,19. Quando as técnicas cirúrgicas estão devidamente executadas e as condições ambientais cuidadosamente monitorizados lymphocy,TES deve exibir velocidade de migração característica, como demonstrado na Figura 2c, 2d e noutros locais 13-14,16. Os linfócitos também podem apresentar diferenças na velocidade de migração em função das sub-regiões da imagem LN passando, assim marcos adicionais, tais como vasos sanguíneos (como destaque para a apresentação de corantes de navios) vai ajudar a determinar a qualidade de imagem global (ou seja, controle de temperatura adequada , um mínimo de trauma para LN, etc) 3,6,20. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3720/3720fig1.jpg" /> Figura 1. Construção de um titular do mouse para mouse poplítea LN imagem a) Esquema de montagem titular rato;. B) Representante de preparação do mouse intravital; c) montagem titular Concluído mouse; d) Close-up vista para o LN poplítea após a exposição cirúrgica. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3720/3720fig2.jpg" /> Figura 2. Análise de migração de GFP + linfócitosno LN poplítea. (a) instantâneo 3D tomadas a partir de 2P-LSM sequência de imagens da LN poplítea em um rato receptor C57BL / 6 adotivamente transferida com 1x10 GFP + 7 linfócitos 1 dia antes da criação de imagens. Linha traço indica a fronteira de folículos das células B, (b) Faixas de migração de linfócitos durante 1 hora de imagiologia contínua; Distribuição c) da velocidade de migração global de linfócitos. Velocidade média = 10,04 ± 4,26 mM / min (total de 15,125 faixas analisadas), d) Diferencial de distribuição velocidade celular migração de células encontradas no folículo de células B (bares abertos; velocidade média = 8,79 ± 3,90 mM / min; total de 1.525 faixas analisadas ) e células T de zona (bares fechados, a velocidade média = 13,77 ± 5,93 mM / min; total de 1.250 faixas analisadas). Barra de escala = 50 mM. Suplementar vídeo 1. Tempo-lapso intravital imagiologia 2P-LSM de um rato LN poplítea como descrito na Figura 2. Um total de 1x10 7 linfócitos foram isolados from um ubiquitina-GFP do rato dador + e adotivamente transferido por via intravenosa em um rato receptor C57BL / 6 24 horas antes de imagem. Uma série de xy (750 uM x 750 mm) imagens de fluorescência foram tomadas através fixo z pilhas (5 passos mM, 13 passos) para se obter um xyz pilha de imagem (750 uM x 750 uM x 65 mm), que foi repetido a cada 20 segundos para um total de 60 minutos, resultando numa sequência de imagens xyzt para análise de velocidade (Figuras 2c, 2d). Reprodução = velocidade 450X. Barra de escala = 50 mM. Carimbo de tempo = min: seg. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video1.avi" target="_blank">Clique aqui para assistir vídeo suplementar</a> . Suplementar vídeo 2 Zoomed-, tendo em conta a sequência de imagens de vídeo em suplementar 1 no folículo célula B -. T fronteira da zona de célula. Reprodução = velocidade 450X. Barra de escala = 25 mM. Carimbo de tempo = min:. Seg <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video2.avi" target="_blank">C</a>lamber aqui para assistir ao vídeo suplementar.

<ol>
	<li>Bousso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cell+activation+by+dendritic+cells+in+the+lymph+node:+lessons+from+the+movies.">T-Cell activation by dendritic cells in the lymph node: lessons from the movies.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 675-684 (2008).</li><li>Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+friends+in+out-of-the-way+places:+how+cells+of+the+immune+system+get+together+and+how+they+conduct+their+business+as+revealed+by+intravital+imaging.">Making friends in out-of-the-way places: how cells of the immune system get together and how they conduct their business as revealed by intravital imaging.</a> Immunol. Rev. 221, 163-181 (2008).</li><li>Huang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+landscape+of+in+vivo+immunity:+insights+from+dynamic+in+situ+imaging+of+secondary+lymphoid+tissues.">Illuminating the landscape of in vivo immunity: insights from dynamic in situ imaging of secondary lymphoid tissues.</a> Immunity. 21, 331-339 (2004).</li><li>Stefanova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-recognition+promotes+the+foreign+antigen+sensitivity+of+naive+T+lymphocytes.">Self-recognition promotes the foreign antigen sensitivity of naive T lymphocytes.</a> Nature. 420, 429-434 (2002).</li><li>Stefanova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+self-recognition+in+T+cell+responses+to+foreign+antigen.">On the role of self-recognition in T cell responses to foreign antigen.</a> Immunol. Rev. 191, 97-106 (2003).</li><li>Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblastic+reticular+cells+guide+T+lymphocyte+entry+into+and+migration+within+the+splenic+T+cell+zone.">Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone.</a> J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).</li><li>Celli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+dynamics+of+T+cell-dendritic+cell+interactions+in+vivo.">Decoding the dynamics of T cell-dendritic cell interactions in vivo.</a> Immunol. Rev. 221, 182-187 (2008).</li><li>Mempel, T. R., Junt, T., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rulers+over+randomness:+stroma+cells+guide+lymphocyte+migration+in+lymph+nodes.">Rulers over randomness: stroma cells guide lymphocyte migration in lymph nodes.</a> Immunity. 25, 867-869 (2006).</li><li>Worbs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+ligands+stimulate+the+intranodal+motility+of+T+lymphocytes+in+vivo.">CCR7 ligands stimulate the intranodal motility of T lymphocytes in vivo.</a> J. Exp. Med. 204 (3), 489-495 (2007).</li><li>Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=byways+and+breadcrumbs:+directing+lymphocyte+traffic+in+the+lymph+node.">byways and breadcrumbs: directing lymphocyte traffic in the lymph node.</a> Trends Immunol. 28, 346-352 (2007).</li><li>Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li><li>Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues.">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).</li><li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+T+cell+trafficking+examined+in+vivo+with+intravital+two-photon+microscopy.">Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).</li><li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+visualizing+immunity+in+context.">Intravital microscopy: visualizing immunity in context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>von Andrian, U. H., Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homing+and+cellular+traffic+in+lymph+nodes.">Homing and cellular traffic in lymph nodes.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 867-878 (2003).</li><li>Bousso, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+CD8++T+cell+priming+by+dendritic+cells+in+intact+lymph+nodes.">Dynamics of CD8+ T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes.</a> Nat. Immunol. 4, 579-585 (2003).</li><li>Castellino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+enhance+immunity+by+guiding+naive+CD8++T+cells+to+sites+of+CD4++T+cell-dendritic+cell+interaction.">Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction.</a> Nature. 440, 890-895 (2006).</li><li>Halin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+lymphocyte+trafficking.">In vivo imaging of lymphocyte trafficking.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 581-603 (2005).</li><li>Qi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrafollicular+activation+of+lymph+node+B+cells+by+antigen-bearing+dendritic+cells.">Extrafollicular activation of lymph node B cells by antigen-bearing dendritic cells.</a> Science. 312, 1672-1676 (2006).</li><li>Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extended+vision+for+dynamic+high-resolution+intravital+immune+imaging.">An extended vision for dynamic high-resolution intravital immune imaging.</a> Semin. Immunol. 17, 431-441 (2005).</li></ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Recentes avanços em alta resolução nas técnicas de imagem in situ, em especial 2P-LSM, têm sido acompanhadas por um interesse crescente no estudo do comportamento celular dinâmica in vivo. A técnica de imagem 4D no LN poplítea de um rato vivo permite que tais análises do comportamento dinâmico de células imunes no tecido ininterrupto micro-ambiente. A utilização de 2P-LSM com detectores múltiplos abrangendo todo o espectro visível permite simultânea de imagens de recolha de dados de populações de células múltiplas. Isto pode agora ser alcançado através da utilização de in vivo de células específicas ratinhos repórter fluorescentes (por exemplo, ubiquitina-EGFP,-RFP, ou-eCFP) combinados com a utilização de transferência adoptiva de populações de células diferencialmente rotulados com orgânicos corantes de células fluorescentes (por exemplo, CFSE , Snarf-1, e Cell Rastreador Orange) para examinar os mecanismos celulares e função dentro da LN. Além da observação direta das interações entre c diferencialmente rastreadopopulações ell, o conjunto de dados de imagem multiplex pode sofrer uma análise mais aprofundada com o comercialmente disponíveis programas de processamento de imagem de software (por exemplo Imaris, BitPlane Inc.) para elucidar o comportamento das células e função. Uma ampla gama de possibilidades existe para estudar mecanismos de interação celulares usando estes in vivo e in silico técnicas. A principal limitação da abordagem experimental aqui descrito é a complexidade técnica inerente à abordagem da cirurgia. Esta técnica requer um rigoroso treinamento para se familiarizar com a anatomia relevante e os procedimentos técnicos precisos e habilidades exigidos por este protocolo. Outros factores que complicam incluem a dificuldade em minimizar danos nos tecidos durante a exploração LN, optimizar a estabilidade do tecido durante a imagem, e prevenir a lesão térmica e de laser para o LN antes e durante a experimentação de imagem. Perturbação de qualquer um desses fatores irá resultar em menos do que ideal linfamotilidade ocyte e, portanto, interferir com a correcta interpretação do resultado de análises de dados de imagem.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reagente</strong</td&gt;<td<strong&gt; Empresa</strong</td&gt;<td<strong&gt; Número Catálogo</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; O isoflurano, USP</td&gt;<td&gt; Baxter Healthcare Corporation</td&gt;<td&gt; NDC 10019-773-60</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Vetbond</td&gt;<td&gt; 3M</td&gt;<td&gt; 1469SB</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nair - loção depilação</td&gt;<td&gt; Nair</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PBS, 1X</td&gt;<td&gt; Cellgro</td&gt;<td&gt; 21-040-CV</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Almofada de aquecimento</td&gt;<td&gt; Watlow</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Aquecimento Pad Controlador</td&gt;<td&gt; Watlow</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ar e O<sub&gt; 2</sub</td&gt;<td&gt; Airgas</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sonda de temperatura</td&gt;<td&gt; Harvard Apparatus</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pinças Dumont # 5</td&gt;<td&gt; World Precision Instruments, Inc</td&gt;<td&gt; 14101</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fórceps, Graefe Iris, 7 cm de curvatura</td&gt;<td&gt; World Precision Instruments, Inc</td&gt;<td&gt; 14141</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Tesouras</td&gt;<td&gt; Roboz Surgical Instrument Co., Inc</td&gt;<td&gt; RS-5880</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Capa de 100x20 milímetros placa de cultura de células de vidro</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 70165-102</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Capa de 100x20 milímetros placa de cultura de poliestireno celular</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 430167</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Solução Betadine (10% da solução de iodo-Povidine tópico)</td&gt;<td&gt; Purdue Products, LP</td&gt;<td&gt; NDC 67618-150-08</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

intravital imaging of the mouse popliteal lymph node

Os gânglios linfáticos (LNS) são órgãos linfóides secundários, os quais são estrategicamente localizados ao longo do corpo para permitir a captura e apresentação de antigénios estranhos dos tecidos periféricos para prime a resposta imunitária adaptativa. Justapostos entre inata e adaptativa respostas imunes, a LN é um local ideal para estudar células imunes 1,2 interações. Linfócitos (células T, células B e células NK), células dendríticas (DCS), e macrófagos compreendem a maior parte das derivadas da medula óssea elementos celulares do LN. Estas células estão estrategicamente posicionados na LN para permitir uma eficiente fiscalização antígenos próprios e potenciais antígenos estranhos 3-5. O processo pelo qual os linfócitos com sucesso encontrar antígenos cognatas é um assunto de investigação intensa nos últimos anos, e envolve uma integração de contactos moleculares, incluindo receptores de antigénios, moléculas de adesão, quimiocinas, e estruturas do estroma, tais como a rede de fibro-reticular 2,6-12 . </p&gt; Antes do desenvolvimento de alta resolução em tempo real fluorescente in vivo de imagens, os pesquisadores contavam com imagem estática, que só oferece respostas sobre morfologia, posição e arquitetura. Enquanto essas questões são fundamentais na nossa compreensão do comportamento de células imunes, as limitações intrínsecas com esta técnica não permite uma análise de decifrar o tráfico de linfócitos e pistas ambientais que afetam o comportamento dinâmico da célula. Recentemente, o desenvolvimento de intravital dois fótons de microscopia de varredura a laser (2P-LSM) permitiu que os investigadores para ver os movimentos dinâmicos e interações de células individuais dentro LNs ao vivo em 12-16 situ. Em particular, nós e outros têm aplicado esta técnica para o comportamento da imagem celular e interacções dentro do LN poplítea, onde a sua natureza, compacto denso oferece a vantagem de aquisição de dados multiplex ao longo de um grande área de tecido com o tecido diversas sub-estruturas 11,17-18 . É iÉ importante notar que esta técnica oferece benefícios adicionais sobre as técnicas tecido explantado de imagem, as quais requerem a interrupção do sangue, fluxo linfático, e, finalmente, a dinâmica celulares do sistema. Além disso, os tecidos explantados têm uma janela de tempo muito limitado em que o tecido permanece viável para geração de imagens após explante. Com a hidratação adequada e monitoramento das condições ambientais do animal, o tempo de imagens pode ser significativamente ampliado com esta técnica intravital. Aqui, apresentamos um método detalhado de preparação LN rato poplítea com a finalidade de realizar imagens intravital.

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node at JoVE.com

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Recentes avanços em 2-fotão microscopia permitiram em tempo real<em&gt; Em</em&gt; Imagiologia in situ de tecidos vivos em modelos animais, aumentando assim a nossa capacidade para investigar o comportamento celular em condições fisiológicas e patológicas. Aqui, destacamos os preparativos necessários para realizar imagens intravital do linfonodo poplíteo do rato.

Imagem intravital do Linfonodo Popliteal Rato

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

intravital-imaging-of-the-mouse-popliteal-lymph-node

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

28.0K visualizações.  Case Western Reserve University. Recentes avanços em 2-fotão microscopia permitiram em tempo real Em Imagiologia in situ de tecidos vivos em modelos animais, aumentando assim a nossa capacidade para investigar o comportamento celular em condições fisiológicas e patológicas. Aqui, destacamos os preparativos necessários para realizar imagens intravital do linfonodo poplíteo do rato.

Vídeo: Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Microscopia intravital do linfonodo inguinal

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Imunologia e Infecção

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

Ex vivo de imagens de células T em fatias Node murino linfáticos com Widefield e microscópios confocal

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

Cirurgia Nó murino superficial linfático

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Imagem intravital da Thymus rato usando 2-Photon Microscopia

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Altamente Resolvido Microscopia intravital Striped-iluminação dos centros germinativos

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Isolamento de Murino Linfonodo células estromais

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Microscopia intravital Imagem do Fígado seguinte<em&gt; Leishmania</em&gt; Infecção: Uma Avaliação de hepáticas Hemodinâmica

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

Isolamento de células mielóides de rato Pele e Drenagem Linfonodo Seguindo intradérmica imunização com vivos atenuados<em&gt; Plasmodium</em&gt; Esporozoítos

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are extremely high, no direct treatment or organ-related mechanism has been examined in detail in real time. The liver is the key organ that manages toxins and infections in the human body. Herein, we aimed to perform intravital imaging of mouse liver after induction of endotoxemia in order to track the motility of immune cells, such as neutrophils and liver capsular macrophages (LCMs). Accordingly, we designed a novel surgical method for exposure of the liver with minimally invasive surgery. Mice were intraperitoneally injected with lipopolysaccharide (LPS), a common endotoxin. Using our novel surgical approach for exposure and intravital imaging of the mouse liver, we found that neutrophil recruitment in LPS-treated LysM-green fluorescent protein (GFP) mouse liver was increased compared with that in phosphate-buffered saline-treated liver. After LPS treatment, the number of neutrophils increased significantly with time. Additionally, using CX3Cr1-GFP mice, we successfully visualized liver resident macrophages called LCMs. Therefore, to investigate the efficacy of new reagents to control immune mobility in vivo, determining the motility and morphology of neutrophils and LCMs in the liver may allow us to identify therapeutic effect in organ failure and tissue damage caused by leukocytes activation in sepsis.

We established a novel surgical protocol for two-photon imaging of live mice liver with minimal invasion. With this technique, we identified the detailed structure of the liver during lipopolysaccharide-induced endotoxemia. We anticipate that this method may be utilized to determine the effectiveness of various reagents treatment to hepatic leukocyte migration.

Imagem de Intravital dois fotões de leucócitos durante a resposta imune em fígado de rato lipopolissacarídeo-tratados

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...