Este trabalho é suportado por concessões do NCI 1R01CA154656, NIAID 1R21AI092299, Cancer Research Institute, da Fundação St. Baldrick, a Fundação Dana, Gabrielle Angel Foundation, e Hyundai Motors da América &quot;esperança sobre rodas&quot; Programa.

1. Assembléia Titular do mouse <ol><li> Sobrepor a tampa de um 100-mm placa de Petri de vidro no topo de uma tampa prato de 100 mm de plástico Petri virado para baixo. O vidro deve ser quase sem tocar no ponto central do prato de plástico. Usar o vidro como um estêncil, traçar uma marca para o prato de plástico. </li><li> Usar uma broca de mão (isto é, Dremel) para remover uma porção de uma tampa prato de 100 mm de plástico para criar uma plataforma em forma de crescente. Esta tampa de plástico em forma de crescente irá servir como um suporte para a parte superior do tronco do rato (Figura 1a). Faça dois furos na tampa em forma de crescente para garantir a máscara de gás com um laço de torção metal. Fixar a tampa de plástico para a borda da placa de Petri de vidro usando super cola ou um adesivo equivalentemente forte (Figura 1b). </li><li> Cole as tampas de duas abobadado-tampão de PCR tubos (cortado na dobradiça) 1 cm de distância do centro do prato de fundo para o propósito de ancoragem retalhos poplíteos. </li></ol> 2. Preparação do mouse <strong&gt; Nota: Com a prática, deve ser capaz de realizar a preparação do mouse e passos cirúrgicos em 20-30 minutos. <ol><li> Anestesiar o rato com isoflurano (2 a 2,5% para a indução, 1,5 a 2% para a cirurgia / imaging) misturado em 1:1 O 2: mistura de ar com um caudal de 1l/min usando um procedimento IACUC-aprovado. Uma vez que o mouse está anestesiado, garantir uma máscara de gás sobre o nariz com fita adesiva. Determinar se o mouse está totalmente anestesiado pela falta de resposta aos pés e / ou pitadas de cauda. O nível de isoflurano pode ser ajustada em conformidade para assegurar que o animal está totalmente sedado, com uma constante, não-trabalhado taxa respiratória entre 60-80 respirações / min. </li><li> Use um cortador elétrico para remover os pêlos na perna traseira direita e região inguinal do rato. </li><li> Escove o cabelo solto longe e suavemente aplique uma camada de loção Nair modesto para a área raspada com um cotonete. Após um minuto de aplicação inicial, remover o Nair e limpar a pele exposta com uma humidadetoalha de papel. Verifique se o mouse está limpa e seca antes de prosseguir. </li><li> Fazer uma incisão milímetros de pequenas dimensões 2 a 3, com uma tesoura no joelho direito para expor o tendão extensor. </li><li> Aplicar Vetbond ao longo do centro do titular do rato em que o corpo do rato e da perna será posicionado. Cuidadosamente garantir o mouse sobre o titular, com o joelho direito para baixo, para expor a fossa poplítea direita. Fixe o tendão do joelho direito com Vetbond entre os 2 suportes de retalhos cutâneos para ajudar a estabilizar o campo de imagem. </li><li> Estiramento ea fita dos braços e das pernas esquerda para a plataforma superior do suporte. </li><li> Use um laço de torção para garantir a máscara de gás no local. </li><li> Coloque o suporte sob o microscópio de dissecção. O LN deve permanecer absolutamente imóvel, independente do movimento de respiração do mouse. Por conseguinte, devem ser tomadas precauções durante a realização da cirurgia, para optimizar a estabilidade da perna. Determinar a posição da cauda (tipicamente acima da cabeça), que vai contribuir para a maiorestabilidade para a perna direita e fita a cauda para baixo. </li></ol> 3. Cirurgia <ol><li> Enquanto no âmbito dissecção, manter a temperatura do mouse corpo usando um aquecedor ou uma almofada de aquecimento. Para imagem bem sucedida da LN poplítea, é crítico para sustentar a temperatura do corpo adequada em toda a cirurgia, bem como para preservar a humidade do tecido através da aplicação constante de PBS morno para o tecido exposto. </li><li> Esterilizar a pele com Betadine. Utilizando uma tesoura estéreis, fazer uma incisão na linha média através da pele à direita meados de vitelo, e continuar o corte verticalmente para cima para a porção superior da coxa direita. </li><li> Faça duas incisões na pele horizontal na parte superior da linha de incisão vertical para criar as abas de pele de cada lado. </li><li> Recolha e cola abaixo de ambos os retalhos cutâneos com Vetbond. Puxar a pele esticada antes de aplicar Vetbond continuará a promover a estabilidade da perna, no entanto, certifique-se que a tensão da pele não obstruir o fluxo de sangue (ou seja, alterações na vessëcor l ou diâmetro). Continuar a cola para baixo outras áreas da pele para assegurar a estabilidade da perna antes de expor o LN. O tamanho do mouse irá determinar o quanto a pele extra é necessário para cola para baixo. Tipicamente, os ratinhos maiores irá exigir mais pele para ser colada ao titular. </li><li> O LN deve estar dentro da fossa poplítea, quer para a direita ou esquerda da veia poplítea, dependendo do posicionamento do mouse sobre o titular. Separe cuidadosamente a LN dos tecidos adiposos e dos músculos que cercam usando micro-dissecção pinças e pinças. Para minimizar a hemorragia e trauma, utilizar as técnicas de espalhamento com micro-dissecando pinças para tecidos separados. Cuidadosamente expor o LN poplítea sem comprometer a integridade dos vasos sanguíneos aferentes e eferentes e os vasos linfáticos aferentes. </li><li> Para a estabilidade do tecido adicionada, uma tampa de vidro quadrada pode ser posicionada sobre o LN molhada, quase sem tocar o LN evitando ao mesmo tempo de oclusão do vaso. A tampa de vidro pode ser secured com a modelagem de argila em ambos os lados do rato. </li><li> Corantes fluorescentes vasos de vários tamanhos (por exemplo, TRITC-dextrano, mínimo de 70kDa) pode ser introduzido por via intravenosa, neste ponto para ajudar a realçar a relação estrutural e integridade da LN durante imagem. </li></ol> 4. 2-Photon Aquisição de imagem ** <ol><li> Uma vez que o LN é adequadamente exposto e para a estabilidade é conseguida, prontamente transferir todo o conjunto de porta do rato para a fase microscópio equipado com uma temperatura de almofada de feedback programável de aquecimento controlado, em uma câmara de microscópio ambiental mantida a 37 ° C. Adicionar o suficiente estéril quente (37 ° C) ou PBS HBSS para submergir o LN. O volume irá mudar, dependendo do tamanho e da colocação do rato. Alternativamente, PBS morno ou HBSS pode ser aplicado directamente ao LN dissecados através de uma pipeta de vidro fino equipado a uma bomba peristáltica e colada à coluna da lente objectiva de imersão. O fluxo do líquido deve ser tal que umacoluna de água estável pode ser mantida entre a lente eo tecido. </li><li> Manter a temperatura PBS ou HBSS a 37 ° C utilizando uma almofada de aquecimento com uma sonda de realimentação. Uma sonda de temperatura separado deve ser colocado no suporte do rato para confirmar a temperatura da PBS na gama de 36,5-37,5 ° C. Uma sonda rectal podem também ser utilizados para monitorizar a temperatura corporal do rato ao longo da sessão experimental de imagem. </li><li> Use uma lâmpada epi-fluorescente para ajudar a orientar a colocação LN no âmbito do objectivo. Adquira pilhas de imagens fluorescentes usando intervalos de tempo que são apropriados para a interação desejada celular (tipicamente minutos 10 segundos a 1 entre cada pilha imagem xyz). </li><li> Monitorizar o estado do animal na câmara de microscópio com frequência por inspecção visual ou usando um sistema de monitorização animal. Determinar se o mouse está totalmente anestesiado pela falta de resposta aos pés e / ou pitadas de unha, e uma constante, a taxa de não-trabalhado respiratória entre 60-80 breaths / min. O nível de isoflurano pode ser ajustada em conformidade para assegurar que o animal está totalmente sedado. Com acompanhamento adequado e hidratação, os animais podem ser visualizados por 4-6 horas, ou possivelmente mais. </li><li> Após a experiência de imagem, euthanize do animal em uma câmara de 2 CO usando IACUC-aprovado protocolo eutanásia. O animal não deve ser autorizado a sair da anestesia antes da eutanásia. </li></ol> ** Este procedimento cirúrgico pode também ser útil para outras formas de imagiologia intravital com excepção 2P-LSM. 5. Os resultados representativos Várias células imunológicas circulantes são recrutados para o LN em taxas diferentes após a transferência adotiva. Para T CD4 + e CD8 +, estas células começam a chegar no LN através das altas endoteliais vénula (HEV) minutos após iv de transferência com números substanciais que chegam à LN poplítea após 2 a 4 horas 6,17-18. Para B cells, um número substancial irá acumular-se depois de 8 a 24 horas 19. DCs ativadas devem começar a aparecer nos drenagem poplítea LN 8 a 16 horas após a injeção pata 3,11,16-17. Figura 2a mostra que, mesmo sem outros marcos, estruturas como folículos de células B pode ser percebido facilmente pelo acúmulo de células redondas esférico visível sob 2P-LSM 19. Usando um repórter fluorescente endógeno, tais como os esplenócitos ubiquitina-GFP (Figura 2, videos Suplementar 1 e 2), pode-se controlar estas migrações de linfócitos e comportamentos de dias até uma semana sob-estimulatórias não condições fisiológicas. Com multi-canal detectores de alta sensibilidade, é possível adquirir um conjunto de dados de imagem multiplex que engloba informações estruturais, bem como a dinâmica de interação entre os vários parceiros celulares 17,19. Quando as técnicas cirúrgicas estão devidamente executadas e as condições ambientais cuidadosamente monitorizados lymphocy,TES deve exibir velocidade de migração característica, como demonstrado na Figura 2c, 2d e noutros locais 13-14,16. Os linfócitos também podem apresentar diferenças na velocidade de migração em função das sub-regiões da imagem LN passando, assim marcos adicionais, tais como vasos sanguíneos (como destaque para a apresentação de corantes de navios) vai ajudar a determinar a qualidade de imagem global (ou seja, controle de temperatura adequada , um mínimo de trauma para LN, etc) 3,6,20. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3720/3720fig1.jpg" /> Figura 1. Construção de um titular do mouse para mouse poplítea LN imagem a) Esquema de montagem titular rato;. B) Representante de preparação do mouse intravital; c) montagem titular Concluído mouse; d) Close-up vista para o LN poplítea após a exposição cirúrgica. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3720/3720fig2.jpg" /> Figura 2. Análise de migração de GFP + linfócitosno LN poplítea. (a) instantâneo 3D tomadas a partir de 2P-LSM sequência de imagens da LN poplítea em um rato receptor C57BL / 6 adotivamente transferida com 1x10 GFP + 7 linfócitos 1 dia antes da criação de imagens. Linha traço indica a fronteira de folículos das células B, (b) Faixas de migração de linfócitos durante 1 hora de imagiologia contínua; Distribuição c) da velocidade de migração global de linfócitos. Velocidade média = 10,04 ± 4,26 mM / min (total de 15,125 faixas analisadas), d) Diferencial de distribuição velocidade celular migração de células encontradas no folículo de células B (bares abertos; velocidade média = 8,79 ± 3,90 mM / min; total de 1.525 faixas analisadas ) e células T de zona (bares fechados, a velocidade média = 13,77 ± 5,93 mM / min; total de 1.250 faixas analisadas). Barra de escala = 50 mM. Suplementar vídeo 1. Tempo-lapso intravital imagiologia 2P-LSM de um rato LN poplítea como descrito na Figura 2. Um total de 1x10 7 linfócitos foram isolados from um ubiquitina-GFP do rato dador + e adotivamente transferido por via intravenosa em um rato receptor C57BL / 6 24 horas antes de imagem. Uma série de xy (750 uM x 750 mm) imagens de fluorescência foram tomadas através fixo z pilhas (5 passos mM, 13 passos) para se obter um xyz pilha de imagem (750 uM x 750 uM x 65 mm), que foi repetido a cada 20 segundos para um total de 60 minutos, resultando numa sequência de imagens xyzt para análise de velocidade (Figuras 2c, 2d). Reprodução = velocidade 450X. Barra de escala = 50 mM. Carimbo de tempo = min: seg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video1.avi" target="_blank">Clique aqui para assistir vídeo suplementar</a> . Suplementar vídeo 2 Zoomed-, tendo em conta a sequência de imagens de vídeo em suplementar 1 no folículo célula B -. T fronteira da zona de célula. Reprodução = velocidade 450X. Barra de escala = 25 mM. Carimbo de tempo = min:. Seg <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video2.avi" target="_blank">C</a>lamber aqui para assistir ao vídeo suplementar.

<ol>
	<li>Bousso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cell+activation+by+dendritic+cells+in+the+lymph+node:+lessons+from+the+movies.">T-Cell activation by dendritic cells in the lymph node: lessons from the movies.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 675-684 (2008).</li><li>Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+friends+in+out-of-the-way+places:+how+cells+of+the+immune+system+get+together+and+how+they+conduct+their+business+as+revealed+by+intravital+imaging.">Making friends in out-of-the-way places: how cells of the immune system get together and how they conduct their business as revealed by intravital imaging.</a> Immunol. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues.">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).</li><li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+T+cell+trafficking+examined+in+vivo+with+intravital+two-photon+microscopy.">Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).</li><li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. 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Os autores não têm nada para revelar.

Recentes avanços em alta resolução nas técnicas de imagem in situ, em especial 2P-LSM, têm sido acompanhadas por um interesse crescente no estudo do comportamento celular dinâmica in vivo. A técnica de imagem 4D no LN poplítea de um rato vivo permite que tais análises do comportamento dinâmico de células imunes no tecido ininterrupto micro-ambiente. A utilização de 2P-LSM com detectores múltiplos abrangendo todo o espectro visível permite simultânea de imagens de recolha de dados de populações de células múltiplas. Isto pode agora ser alcançado através da utilização de in vivo de células específicas ratinhos repórter fluorescentes (por exemplo, ubiquitina-EGFP,-RFP, ou-eCFP) combinados com a utilização de transferência adoptiva de populações de células diferencialmente rotulados com orgânicos corantes de células fluorescentes (por exemplo, CFSE , Snarf-1, e Cell Rastreador Orange) para examinar os mecanismos celulares e função dentro da LN. Além da observação direta das interações entre c diferencialmente rastreadopopulações ell, o conjunto de dados de imagem multiplex pode sofrer uma análise mais aprofundada com o comercialmente disponíveis programas de processamento de imagem de software (por exemplo Imaris, BitPlane Inc.) para elucidar o comportamento das células e função. Uma ampla gama de possibilidades existe para estudar mecanismos de interação celulares usando estes in vivo e in silico técnicas. A principal limitação da abordagem experimental aqui descrito é a complexidade técnica inerente à abordagem da cirurgia. Esta técnica requer um rigoroso treinamento para se familiarizar com a anatomia relevante e os procedimentos técnicos precisos e habilidades exigidos por este protocolo. Outros factores que complicam incluem a dificuldade em minimizar danos nos tecidos durante a exploração LN, optimizar a estabilidade do tecido durante a imagem, e prevenir a lesão térmica e de laser para o LN antes e durante a experimentação de imagem. Perturbação de qualquer um desses fatores irá resultar em menos do que ideal linfamotilidade ocyte e, portanto, interferir com a correcta interpretação do resultado de análises de dados de imagem.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reagente</strong</td&gt;<td<strong&gt; Empresa</strong</td&gt;<td<strong&gt; Número Catálogo</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; O isoflurano, USP</td&gt;<td&gt; Baxter Healthcare Corporation</td&gt;<td&gt; NDC 10019-773-60</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Vetbond</td&gt;<td&gt; 3M</td&gt;<td&gt; 1469SB</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nair - loção depilação</td&gt;<td&gt; Nair</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PBS, 1X</td&gt;<td&gt; Cellgro</td&gt;<td&gt; 21-040-CV</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Almofada de aquecimento</td&gt;<td&gt; Watlow</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Aquecimento Pad Controlador</td&gt;<td&gt; Watlow</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ar e O<sub&gt; 2</sub</td&gt;<td&gt; Airgas</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sonda de temperatura</td&gt;<td&gt; Harvard Apparatus</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pinças Dumont # 5</td&gt;<td&gt; World Precision Instruments, Inc</td&gt;<td&gt; 14101</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fórceps, Graefe Iris, 7 cm de curvatura</td&gt;<td&gt; World Precision Instruments, Inc</td&gt;<td&gt; 14141</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Tesouras</td&gt;<td&gt; Roboz Surgical Instrument Co., Inc</td&gt;<td&gt; RS-5880</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Capa de 100x20 milímetros placa de cultura de células de vidro</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 70165-102</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Capa de 100x20 milímetros placa de cultura de poliestireno celular</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 430167</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Solução Betadine (10% da solução de iodo-Povidine tópico)</td&gt;<td&gt; Purdue Products, LP</td&gt;<td&gt; NDC 67618-150-08</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

intravital imaging of the mouse popliteal lymph node

Os gânglios linfáticos (LNS) são órgãos linfóides secundários, os quais são estrategicamente localizados ao longo do corpo para permitir a captura e apresentação de antigénios estranhos dos tecidos periféricos para prime a resposta imunitária adaptativa. Justapostos entre inata e adaptativa respostas imunes, a LN é um local ideal para estudar células imunes 1,2 interações. Linfócitos (células T, células B e células NK), células dendríticas (DCS), e macrófagos compreendem a maior parte das derivadas da medula óssea elementos celulares do LN. Estas células estão estrategicamente posicionados na LN para permitir uma eficiente fiscalização antígenos próprios e potenciais antígenos estranhos 3-5. O processo pelo qual os linfócitos com sucesso encontrar antígenos cognatas é um assunto de investigação intensa nos últimos anos, e envolve uma integração de contactos moleculares, incluindo receptores de antigénios, moléculas de adesão, quimiocinas, e estruturas do estroma, tais como a rede de fibro-reticular 2,6-12 . </p&gt; Antes do desenvolvimento de alta resolução em tempo real fluorescente in vivo de imagens, os pesquisadores contavam com imagem estática, que só oferece respostas sobre morfologia, posição e arquitetura. Enquanto essas questões são fundamentais na nossa compreensão do comportamento de células imunes, as limitações intrínsecas com esta técnica não permite uma análise de decifrar o tráfico de linfócitos e pistas ambientais que afetam o comportamento dinâmico da célula. Recentemente, o desenvolvimento de intravital dois fótons de microscopia de varredura a laser (2P-LSM) permitiu que os investigadores para ver os movimentos dinâmicos e interações de células individuais dentro LNs ao vivo em 12-16 situ. Em particular, nós e outros têm aplicado esta técnica para o comportamento da imagem celular e interacções dentro do LN poplítea, onde a sua natureza, compacto denso oferece a vantagem de aquisição de dados multiplex ao longo de um grande área de tecido com o tecido diversas sub-estruturas 11,17-18 . É iÉ importante notar que esta técnica oferece benefícios adicionais sobre as técnicas tecido explantado de imagem, as quais requerem a interrupção do sangue, fluxo linfático, e, finalmente, a dinâmica celulares do sistema. Além disso, os tecidos explantados têm uma janela de tempo muito limitado em que o tecido permanece viável para geração de imagens após explante. Com a hidratação adequada e monitoramento das condições ambientais do animal, o tempo de imagens pode ser significativamente ampliado com esta técnica intravital. Aqui, apresentamos um método detalhado de preparação LN rato poplítea com a finalidade de realizar imagens intravital.

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Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Recentes avanços em 2-fotão microscopia permitiram em tempo real<em&gt; Em</em&gt; Imagiologia in situ de tecidos vivos em modelos animais, aumentando assim a nossa capacidade para investigar o comportamento celular em condições fisiológicas e patológicas. Aqui, destacamos os preparativos necessários para realizar imagens intravital do linfonodo poplíteo do rato.

Imagem intravital do Linfonodo Popliteal Rato

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

intravital-imaging-of-the-mouse-popliteal-lymph-node

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

28.3K visualizações.  Case Western Reserve University. Recentes avanços em 2-fotão microscopia permitiram em tempo real Em Imagiologia in situ de tecidos vivos em modelos animais, aumentando assim a nossa capacidade para investigar o comportamento celular em condições fisiológicas e patológicas. Aqui, destacamos os preparativos necessários para realizar imagens intravital do linfonodo poplíteo do rato.

Vídeo: Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Microscopia intravital do linfonodo inguinal

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Imunologia e Infecção

Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

Two-photon imaging has revealed an elegant choreography of motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and at the initiation of an immune response 1. Here, we present methods for adoptive transfer of labeled T cells, isolation of lymph nodes, and imaging motility of CD4+ T cells in the explanted lymph node as first described in 2002 2. Two-photon imaging of immune cells requires that the cells are fluorescently labeled, either by staining with a cell tracker dye or by expressing a fluorescent protein. We demonstrate the adoptive transfer procedure of injecting cells derived from donor mice into the tail vein of a recipient animal, where they home to lymphoid organs within approximately 15-30 min. We illustrate the isolation of a lymph node and describe methods to ensure proper mounting of the excised lymph node. Other considerations such as proper oxygenation of perfused media, temperature, and laser power are discussed. Finally, we present 3D video images of naive CD4+ T cells exhibiting steady state motility at 37&deg;C.

Two-photon imaging has uncovered lymphocyte motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and durring an immune response 1. Here, we demonstrate adoptive transfer of T cells, isolation of lymph nodes, and imaging motility of CD4+ T cells in the explanted lymph node.

Dissecção e 2-Photon Imagens de linfonodos periféricos em ratos

Two-photon imaging has revealed an elegant choreography of motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and at the ...

Biologia

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

Não-invasiva de Imagem Óptico da vasculatura linfática de um rato

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Altamente Resolvido Microscopia intravital Striped-iluminação dos centros germinativos

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;

Imagem latente intravital de linfócitos intraepithelial no intestino pequeno murine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal ...

Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice

Lymphatic vessels are critical in maintaining tissue fluid balance and optimizing immune protection by transporting antigens, cytokines, and cells to draining lymph nodes (LNs). Interruption of lymph flow is an important method when studying the function of lymphatic vessels. The afferent lymphatic vessels from the murine footpad to the popliteal lymph nodes (pLNs) are well-defined as the only routes for lymph drainage into the pLNs. Suturing these afferent lymphatic vessels can selectively prevent lymph flow to the pLNs. This method allows for interference in lymph flow with minimal damage to the lymphatic endothelial cells in the draining pLN, the afferent lymphatic vessels, as well as other lymphatic vessels around the area. This method has been used to study how lymph impacts high endothelial venules (HEV) and chemokine expression in the LN, and how lymph flows through the adipose tissue surrounding the LN in the absence of functional lymphatic vessels. With the growing recognition of the importance of lymphatic function, this method will have broader applications to further unravel the function of lymphatic vessels in regulating the LN microenvironment and immune responses.

A protocol to block lymph flow by surgical suturing of afferent lymphatic vessels is presented.

Bloqueando o fluxo linfático suturing afferent vasos linfáticos em camundongos

Lymphatic vessels are critical in maintaining tissue fluid balance and optimizing immune protection by transporting antigens, cytokines, and cells to ...

Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for analyzing collateral arteries and leukocytes in arteriogenesis is ex vivo (immuno-) histological methodology. However, this technique does not allow the measurement of dynamic processes such as blood flow, shear stress, cell-cell interactions, and particle velocity. This paper presents a protocol to monitor in vivo processes in growing collateral arteries during arteriogenesis utilizing intravital imaging. The method described here is a reliable tool for dynamics measurement and offers a high-contrast analysis with minimal photo-cytotoxicity, provided by multiphoton excitation microscopy. Prior to analyzing growing collateral arteries, arteriogenesis was induced in the adductor muscle of mice by unilateral ligation of the femoral artery.
After the ligation, the preexisting collateral arteries started to grow due to increased shear stress. Twenty-four hours after surgery, the skin and subcutaneous fat above the collateral arteries were removed, constructing a pocket for further analyses. To visualize blood flow and immune cells during in vivo imaging, CD41-fluorescein isothiocyanate (FITC) (platelets) and CD45-phycoerythrin (PE) (leukocytes) antibodies were injected intravenously (i.v.) via a catheter placed in the tail vein of a mouse. This article introduces intravital multiphoton imaging as an alternative or in vivo complementation to the commonly used static ex vivo (immuno-) histological analyses to study processes relevant for arteriogenesis. In summary, this paper describes a novel and dynamic in vivo method to investigate immune cell trafficking, blood flow, and shear stress in a hindlimb model of arteriogenesis, which enhances evaluation possibilities notably.

The recruitment of leukocytes and platelets constitutes an essential component necessary for the effective growth of collateral arteries during arteriogenesis. Multiphoton microscopy is an efficient tool for tracking cell dynamics with high spatio-temporal resolution in vivo and less photo-toxicity to study leukocyte recruitment and extravasation during arteriogenesis.

Imagem Intravital Multifóton para Monitoramento do Recrutamento de Leucócitos durante a Arteriogênese em Modelo de Membro Posterior Murino

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for ...

Medicina

Popliteal Vascular Lymph Node Resection in the Rabbit Hindlimb for Secondary Lymphedema Induction

Lymphedema is a common condition often associated with cancer and its treatment, which leads to damage to the lymphatic system, and current treatments are mostly palliative rather than curative. Its high incidence among oncologic patients indicates the need to study both normal lymphatic function and pathologic dysfunction. To reproduce chronic lymphedema, it is necessary to choose a suitable experimental animal. Attempts to establish animal models are limited by the regenerative capacity of the lymphatic system. Among the potential candidates, the rabbit hindlimb is easy to handle and extrapolate to the human clinical scenario, making it advantageous. In addition, the size of this species allows for better selection of lymphatic vessels for vascularized lymph node resection.
In this study, we present a procedure of vascular lymph node resection in the rabbit hindlimb for inducing secondary lymphedema. Anesthetized animals were subjected to circumferential measurement, patent blue V infiltration, and indocyanine green lymphography (ICG-L) using real-time near-infrared fluorescence, a technique that allows the identification of single popliteal nodes and lymphatic channels. Access to the identified structures is achieved by excising the popliteal node and ligating the medial and lateral afferent lymphatics. Special care must be taken to ensure that any lymphatic vessel that joins the femoral lymphatic system within the thigh without entering the popliteal node can be identified and ligated. 
Postoperative evaluation was performed at 3, 6, and 12 months after induction using circumferential measurements of the hindlimb and ICG-L. As demonstrated during follow-up, the animals developed dermal backflow that was maintained until the 12th month, making this experimental animal useful for novel long-term evaluations in the management of lymphedema. In conclusion, the approach described here is feasible and reproducible. Additionally, during the time window presented, it can be representative of human lymphedema, thus providing a useful research tool.

<meta charset="utf8"></head><body>Ressecção de linfonodo vascular poplíteo no membro posterior de coelho para indução secundária de linfedema

Here, the surgical induction of stable acquired lymphedema in the rabbit hindlimb is described. This experimental animal can be used to further investigate the effect of lymphedema treatment by microsurgical techniques.

Ressecção de linfonodo vascular poplíteo no membro posterior de coelho para indução secundária de linfedema

Lymphedema is a common condition often associated with cancer and its treatment, which leads to damage to the lymphatic system, and current treatments are ...

Imagem intravital do Linfonodo Popliteal Rato

Resumo

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Microscopia intravital do linfonodo inguinal

Dissecção e 2-Photon Imagens de linfonodos periféricos em ratos

Não-invasiva de Imagem Óptico da vasculatura linfática de um rato

Altamente Resolvido Microscopia intravital Striped-iluminação dos centros germinativos

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Imagem latente intravital de linfócitos intraepithelial no intestino pequeno murine

Bloqueando o fluxo linfático suturing afferent vasos linfáticos em camundongos

Imagem Intravital Multifóton para Monitoramento do Recrutamento de Leucócitos durante a Arteriogênese em Modelo de Membro Posterior Murino

Ressecção de linfonodo vascular poplíteo no membro posterior de coelho para indução secundária de linfedema

Ressecção de linfonodo vascular poplíteo no membro posterior de coelho para indução secundária de linfedema