This work was supported by the Alzheimer&#8217;s Association (NIRG-10-171721; to U.H.), National Institute of Mental Health (MH096702; to U.H.), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333; to C.M.T.), and pilot study awards from the National Institute on Aging-funded Alzheimer&#8217;s Disease Research Center at Columbia University (AG008702; to J.B. and Y.Y.J.) that also supports the New York Brain Bank. We thank members of the Hengst laboratory for comments and discussions

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo IACUC da Universidade de Columbia e orientações aplicáveis ​​para o cuidado e uso de animais de laboratório foram seguidas. Nota: Prepare todos os buffers utilizados para os procedimentos ISH em água RNase ou tratada com DEPC. Esta recomendação não é estritamente necessário após ISH foi concluída, mas sugere-se que buffers ainda são preparadas com água bidestilada autoclavado e / ou esterilizado por filtragem. 1. Detecção de ATF4 mRNA localizada Cholinergic axônios no Adulto do rato do cérebro usando fluorescência Hibridização In Situ (FISH) Seguido por imuno-histoquímica <ol><li> Preparação de amostras para fatias de cérebro congeladas fixo-paraformaldeído <ol><li> Por exemplo a seguir, preparar fatias de cérebros de camundongos congelados fixos. <ol><li> Resumidamente, sacrificar ratos nove meses de idade, pela anestesia com cetamina (100 mg kg -1 de peso corporal) e xilazina (10 mg kg -1 weig corpoHT) seguido por infusão transcardial de 4% de paraformaldeído em PBS (pH 7,4). </li><li> Remover cérebros e pós-correção em paraformaldeído a 4% durante 24 horas a 4 o C. </li><li> Após a fixação, lavar as amostras três vezes em PBS e cryoprotect em 30% de sacarose em PBS (pH 7,4) durante 24 horas a 4 o C. </li><li> Cérebros Incorporar em outubro congelamento composto, em série na seção de 20 um em um criostato e montar em poli-D-lisina tratados lâminas de microscópio. Mantenha fatias do cérebro a -20 ° C até o uso. </li></ol></li><li> Remover fatias do cérebro fixadas com paraformaldeído a partir do congelador e secar ao ar durante 30 min à TA. </li><li> Lavar três vezes com PBS 1x. </li><li> Numa hotte, re-fixar fatias do cérebro do 20 min com 4% de paraformaldeído à temperatura ambiente. NOTA: CUIDADO: 4% de paraformaldeído é tóxico e devem ser manuseados e descartados apropriadamente seguindo os protocolos de segurança. </li><li> Lavar três vezes com PBS 1x. </li><li> Desidratar fatias de cérebro. <ol><li> Prepare a 50%, 75% e 100%soluções de etanol. </li><li> Imergir as lâminas em etanol a 50% durante 5 min à TA. </li><li> Imergir as lâminas em etanol a 75% durante 5 min à TA. </li><li> Imergir as lâminas em etanol a 100% durante 5 min à TA. </li><li> Imergir as lâminas em fresco etanol a 100% durante 5 min à TA. Nota: Em alternativa, as lâminas podem ser armazenadas em etanol a 100% a -20 ° C até 1 mês. </li></ol></li></ol></li><li> Teste FISH seguido de imunohistoquímica usando induzida pelo calor antígeno / desmascaramento RNA <ol><li> Antes de começar preparar todo o material necessário: <ol><li> Aqueça o forno de hibridação a 40 ° C e colocar num tabuleiro contendo água destilada no forno para criar um ambiente humidificado. </li><li> Pegue uma caixa de slides e colocar toalhas de papel embebido em água destilada para dentro para umidificar a caixa de slide. Coloque a caixa de slides no forno de hibridização. </li><li> Remover as sondas (ambos sondas negativos e de destino) de geladeira e aqueça-os no forno de hibridação para 10 min. Deixe esfriar as sondas down à temperatura ambiente. </li><li> Equilibrar reagentes de amplificação AMP 1-4 (incluídos no kit de reagentes multiplex fluorescente) à TA. </li><li> Preparar a solução de recuperação de antigénio de: citrato de sódio 10 mM (pH 6), 0,05% de Tween 20. Nota: A solução pode ser armazenada à temperatura ambiente indefinidamente e ser utilizado para a coloração futuro. </li><li> Preparar o tampão de lavagem 1x diluição da solução estoque 50x (incluídos no kit de reagentes multiplex fluorescente) em água isenta de RNase ou tratada com DEPC. NOTA: 1x tampão de lavagem pode ser armazenado à temperatura ambiente durante 1 mês e ser utilizado para a coloração futuro. Tampão de lavagem 50x pode precipitar. Se assim for, o calor 50x tampão de lavagem a 40 ° C durante 10 min antes da preparação da solução 1x. </li></ol></li><li> Retirar as lâminas a partir de etanol a 100% e ar seco, durante 5 min à TA. </li><li> Prepare um frasco coplin contendo 50 ml de solução de recuperação antigênica. Imergir as lâminas em solução de recuperação antigênica e ferva-os durante 10 minutos em um forno de microondas. NOTA: Como alternativa lugar desliza horizontalmente em um 100 milímetrosdiâmetro prato de vidro redondo contendo 100 ml de solução de recuperação. <ol><li> Encha um copo de 1 L com água destilada e colocá-lo no microondas. NOTA: A água vai &quot;tampão&quot; o calor quando se realiza desmascaramento. </li><li> Colocar as lâminas em solução de recuperação antigênica dentro do microondas. Ferva desliza em potência alta por 5 min. Imediatamente após amostras pararam de ebulição, calor desliza novamente em alta potência para extra de 5 min. </li><li> Esfriar lâminas à temperatura ambiente. NOTA: passo crítico: ebulição duração e procedimento deve ser determinada pelo utilizador, dependendo das características de micro-ondas. Quanto mais rápido a ebulição começa maiores as chances de solução de evaporação. Neste caso recomenda-se que as amostras são fervidas durante períodos de tempo mais curtos do que mais duas vezes para completar um tempo de desmascaramento total de 10 min. Pelo contrário, se o aquecimento realizado a potência média ou baixa, desmascaramento pode ser realizada uma vez durante 10 min. No entanto, se as amostras não ferver continuously para um total de cerca de 10 min, isto pode resultar em desmascaramento parcial de ambos os ARN alvo e proteína a ser detectada. </li></ol></li><li> Lave as lâminas três vezes com PBS 1x. </li><li> Adicionar 2-3 gotas (~ 100? L) de sonda dapB definida como aquelas fatias do cérebro utilizadas para avaliar a coloração de fundo. Nota: O conjunto de sonda dapB tem como alvo um gene bacteriano e não deve reconhecer qualquer RNA mamíferos. </li><li> Adicionar 2-3 gotas de direccionamento a sonda definida como aquelas fatias do cérebro utilizadas para detectar o ARN de interesse. Nota: um conjunto de sondas alvo resíduos de 20 - 1381 do rato ATF4 ARNm é utilizado neste exemplo. </li><li> Lâminas de cobertura com parafilme para evitar a evaporação da sonda, colocá-los na caixa de slides umidificado dentro do forno de hibridação e incubar-los a 40 o C durante 2 horas. NOTA: OPCIONAL: fatias de cérebro adicionais podem ser hibridados com um conjunto sonda segmentação do mouse Polr2A e utilizados como controlos positivos. </li><li> Wash SLIdes duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 2-3 gotas de reagente de amplificação AMP 1-FL a cada fatia de cérebro, cobrir as lâminas com parafilme, colocá-los na caixa de corrediça e incubar a 40 ° C durante 30 minutos no forno de hibridação. </li><li> Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 2-3 gotas de reagente de amplificação AMP 2-FL a cada fatia de cérebro, cobrir as lâminas com parafilme, colocá-los na caixa de corrediça e incubar a 40 ° C durante 15 minutos no forno de hibridação. </li><li> Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 2-3 gotas de reagente de amplificação de AMP 3-FL a cada fatia de cérebro, cobrir as lâminas com parafilme, colocá-los na caixa de corrediça e incubar a 40 ° C durante 30 minutos no forno de hibridação. </li><li> Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 2-3 gotas de reagente de amplificação AMP 4-FL para cada fatia do cérebro, cobrir slides com parafilme, colocá-los noCaixa de lâminas e incubar a 40 ° C durante 15 minutos no forno de hibridação. </li><li> Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente e duas vezes com PBS 1x. </li><li> Adicionar 100-200 ul (ou volume suficiente para cobrir completamente as fatias) de uma solução de bloqueio contendo 3 mg / ml de BSA, 100 mM de glicina e 0,25% de Triton X-100 em PBS (pH 7,4) às lâminas, cobri-los com parafilme e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 100-200 ul de anticorpo anti-ChAT em ​​solução diluída (1/100) para as lâminas de bloqueio, cobri-los com parafilme e incubar durante 2 dias a 4 o C. Certifique-se de que fatias de cérebro não sequem. Se necessário, re-aplique a solução de anticorpo anti-chat para fatias de cérebro de 24 horas após a incubação. </li><li> Lave as lâminas três vezes em 1X PBS durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicione 100-200 ul do anticorpo secundário Alexa conjugado apropriado (. Por exemplo, Alexa-594 burro anti-cabra para este exemplo particular) para os slides, cubra com filme plástico e incubcomeu durante 1 h à TA. </li><li> Lave as lâminas três vezes em 1X PBS durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavagem das lâminas uma vez com água destilada. </li><li> Mount slides com meio de montagem contendo DAPI. </li><li> Visualize fatias de cérebro sob um microscópio de fluorescência. </li></ol></li></ol> 2. Detecção de ATF4 mRNA localizado para axônios em amostras de cérebro usando Chromogenic Hibridização In Situ (CISH) Seguido por Luxol rápido azul e violeta Cresyl contracoloração <ol><li> A preparação da amostra para amostras de cérebros humanos embebidos em parafina e fixados em formalina <ol><li> Fatias Asse em forno seco a 60 ° C durante 1 hora. </li><li> Desparafinar fatias de cérebro em um exaustor. NOTA: CUIDADO: Os reagentes são tóxicos e deve ser manuseado e descartado seguindo as diretrizes de segurança apropriadas <ol><li> Imergir as lâminas em xileno agente de compensação alternativa duas vezes durante 10 minutos. </li><li> Imergir as lâminas em etanol a 100%, duas vezes durante 1 min. </li><li> UMAIR-seco fatias 5 min à TA. NOTA: Como alternativa amostras pode ser seco a temperatura ambiente O / N, mas deve ser utilizada dentro de 24 horas. </li></ol></li></ol></li><li> Diaminobenzidina (DAB) à base de ensaio ISH cromogï¿½ico seguido por Luxol rápido mancha azul violeta e cresyl usando induzida protease-induzida pelo calor e RNA desmascaramento <ol><li> Antes de começar preparar os materiais necessários: <ol><li> Aqueça o forno de hibridação a 40 ° C e colocar num tabuleiro contendo água destilada para criar um ambiente humidificado. </li><li> Pegue uma caixa de slides e colocar toalhas de papel embebido em água destilada para dentro para umidificar a caixa de slide. Coloque a caixa de slides no forno de hibridização. </li><li> Prepare 1x Pretreat 2 por diluição da solução estoque 10x (incluídos no kit de reagentes CISH) em água isenta de RNase ou tratada com DEPC. Se o pré-tratamento é realizado em uma placa quente, adicionando 100 ml de solução de pré-tratamento para um prato de 100 mm de diâmetro de vidro para aumentar a superfície de contacto entre o prato e a placa quente (pré-tratamento seé realizada em um forno de microondas, um frasco Coplin pode ser usado em vez conforme especificado no ponto 1.2.3). Solução de aquecimento para 100 ° C e mantê-lo não mais de 30 min a ferver antes de submergir amostras. </li><li> Calor sondas positivos e negativos 10 min a 40 o C e arrefecer à temperatura ambiente. </li><li> Equilibrar reagentes de amplificação AMP 1-6 (incluídos no kit de reagentes CISH) à TA. </li><li> Preparar o tampão de lavagem 1x diluição da solução estoque 50x (incluído no Kit de Reagentes CISH) em água destilada. Nota: 1x tampão de lavagem pode ser armazenado à temperatura ambiente durante 1 mês e ser utilizado para a coloração futuro. </li></ol></li><li> Adicionar ~ 4 gotas (~ 120 ul) de um Pré-tratar a cada fatia de cérebro, cobrir com parafilme e incubar à TA durante 10 min. </li><li> Lavar 3 a 5 vezes em água destilada fresca. </li><li> Execute desmascaramento induzida pelo calor: <ol><li> Lâminas de transferência para quente Pretreat 2 (incluído no Kit de Reagentes CISH) de solução e deixe ferver por 15 minutos. Nota: Ebulição pode ser executada em um prato quente assegurandoebulição contínua ou em um forno seguindo os passos críticos especificados no ponto 1.2.3). </li></ol></li><li> Imediatamente transferir lâminas para água destilada e lava-se 3-5 vezes. </li><li> Lavagem das lâminas de 3 a 5 vezes em fresco etanol a 100%. </li><li> Fatias de ar seco 5 min a RT. Nota: Em alternativa pode ser seco fatias O / N. </li><li> Realizar desmascaramento induzida por protease: <ol><li> Adicionar 4 gotas de 3 Pré-tratar (incluído no Kit de Reagentes CISH), cobrir com parafilme e incubar 30 min a 40 ° C no forno de hibridação. </li></ol></li><li> Lavagem das lâminas de 3 a 5 vezes em água destilada fresca. </li><li> Adicionar 4 gotas da sonda dapB definido para essas fatias do cérebro utilizadas para avaliar a coloração de fundo. </li><li> Adicionar 4 gotas da sonda alvo definido para essas fatias do cérebro utilizadas para detectar o ARN de interesse. NOTA: Um conjunto de sonda alvo resíduos de 15 - 1256 do ATF4 ARNm humano é utilizado neste exemplo. OPCIONAL: fatias de cérebro adicionais podem ser hybridized com um conjunto de sonda alvo PPIB humano e utilizado como controle positivo. </li><li> Colocar as lâminas na caixa de corrediça e incubar durante 2 horas. a 40 ° C no forno de hibridação. </li><li> Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 4 gotas de AMP um reagente a cada fatia de cérebro, cobrir lâminas com parafilme, colocá-los na caixa de corrediça e incubar a 40 ° C durante 30 minutos no forno de hibridação. </li><li> Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 4 gotas de AMP 2 reagente a cada fatia de cérebro, cobrir lâminas com parafilme, colocá-los na caixa de corrediça e incubar a 40 ° C durante 15 minutos no forno de hibridação. </li><li> Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 4 gotas de reagente de AMP 3 para cada fatia de cérebro, cobrir lâminas com parafilme, colocá-los na caixa de corrediça e incubar a 40 ° C durante 30 minutos no forno de hibridação. </li><li> Lavagem das lâminas duas vezes com 1x erah tampão durante 2 minutos à TA. </li><li> Adicionar 4 gotas de AMP 4 reagente a cada fatia de cérebro, cobrir lâminas com parafilme, colocá-los na caixa de corrediça e incubar a 40 ° C durante 15 minutos no forno de hibridação. </li><li> Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 4 gotas de AMP 5 reagente a cada fatia de cérebro, cobrir lâminas com parafilme e incubar 30 min a RT. </li><li> Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 4 gotas de AMP 6 reagente a cada fatia de cérebro, cobrir lâminas com parafilme e incubar 15 min a RT. </li><li> Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Misturar um volume igual de BROWN-1 e BROWN-2 reagentes (incluído no Kit de Reagentes CISH), adicione ~ 120 ml de solução para cada fatia do cérebro, cubra com parafilme e incubar 10 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente e enxaguar uma vez em água destilada. NOTA: As etapas críticas: as seguintes etapas são fundamentais paraobter uma contracoloração axonal óptima sem mascarando a presença de grânulos de ARN. </li><li> Antes de executar counterstain verificar a presença de mRNA de interesse sob um microscópio de campo claro. Definir zonas de referência em amostras de cérebro nas quais a monitorizar a presença de pontos lacrimais durante todo o procedimento de contraste. </li><li> Pré-aqueça o Luxol rápido solução de azul a 60 o C. </li><li> Colocar as lâminas em Luxol azul rápido e incubar 30 min a 60 o C. </li><li> Lavar várias vezes em água destilada. </li><li> Dip slides para várias vezes em solução de carbonato de lítio 0.05% para iniciar a diferenciação. </li><li> Dip desliza duas vezes em fresco etanol a 75%. </li><li> Enxágüe em água destilada. </li><li> Verifique fatias de cérebro sob um microscópio de campo claro. Note-se que a matéria cinzenta e branca deve começar a ser distinguíveis grânulos e RNA ainda visíveis como azul escuro / puncta preto. Verifique se axónios começam a aparecer como fibras de luz azul. </li><li> Repita os passos 2.2.28 a 2.2.32. Perform incubações com Luxol solução de azul rápido em 10-20 mínimo de etapas, acompanhando atentamente a counterstain ea presença de grânulos de RNA. Nota: Tipicamente, contracoloração óptima é adquirido em 60 - 90 minutos (tempo total de incubação), mas o tempo pode ser encurtado se suspeita-se que os grânulos de ARN pode ser mascarado pela Luxol rápido mancha azul (ver Figura 2 para os exemplos). </li><li> Incubar as lâminas em solução de violeta de cresilo, durante 10 min à TA. </li><li> Lavar as lâminas em água destilada. </li><li> Dip slides para 5 a 10 vezes em etanol a 70%. </li><li> Desidratar fatias do cérebro através de 3 mudanças rápidas de etanol a 100%. </li><li> Numa hotte, fatias de cérebro claras através da incubação de duas vezes em xileno agente de remoção alternativa, durante 2 minutos e uma terceira vez durante 5 min à TA. </li><li> Mount fatias cerebrais em meio de montagem permanente à base de xileno. </li><li> Analisar amostras sob um microscópio de campo claro. </li></ol></li></ol>

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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+extranuclear+lamin+B+promotes+axon+maintenance.">Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance.</a> Cell. 148, 752-764 (2012).</li><li>Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+developmentally+regulated+local+translation+of+odorant+receptor+mRNAs+in+the+axons+of+olfactory+sensory+neurons.">Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons.</a> J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).</li><li>Willis, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Localization+of+transgene+mRNA+in+mature+PNS+and+CNS+neurons.">Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons.</a> J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).</li><li>Kar, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+the+axonal+trafficking+of+nuclear-encoded+mitochondrial+mRNA+alters+neuronal+mitochondrial+activity+and+mouse.">Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse.</a> Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).</li><li>Levsky, J. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization:+past,+present+and+future.">Fluorescence in situ hybridization: past, present and future.</a> J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).</li><li>Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization+analysis+of+mouse+pancreas+using+low-power+antigen-retrieval+technique.">Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique.</a> J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-Color+Ultrasensitive+Bright-Field+RNA+In+Situ+Hybridization+with+RNAscope.">Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope.</a> Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).</li><li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system.">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and Practice of Histotechnology. , (1987).</li><li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos.">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biol. 12, 55 (2014).</li><li>Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+localization+of+arc+mRNA+in+dendrites+involves+activity-+and+translation-dependent+mRNA+degradation.">Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histotechnology. , (1980).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Neste relatório, descreve-se a utilização de uma tecnologia de ISH alta-resolução na detecção de axonally localizada ATF4 ARNm. Estes estudos anteriores publicados e mostram que esta tecnologia é compatível com a detecção de proteína à base de anticorpo em tecidos de embriões inteiros ou mesmo 33. É importante notar que foi recentemente usada para a detecção de ARNm dentro do arco dendrites dos neurónios do hipocampo 34. Também podem ser combinados com corantes ...

Recrutamento mRNA axonal e tradução local permitir axônios de responder a estímulos extracelulares de uma forma temporal e espacialmente aguda 1. Síntese da proteína intra-axonal é melhor compreendida no contexto de neurodesenvolvimento, onde ele desempenha um papel crucial no crescimento do cone de comportamento 2-8, 9-11 pathfinding axonal retrógrado e sinalização 12,13. Mas muito menos se sabe sobre o significado funcional da síntese de proteínas axonal em neurónios pós-desenvolvimento, quando os níveis de mRNA e ribossomas axonal são muito reduzidas 14,15. Axônios vertebrados maduros têm sido pensado para ser traducionalmente inativo 16. No entanto, estudos recentes indicam que a tradução local é reativado em axônios maduras em condições patológicas. Por exemplo, um subconjunto de mRNAs é recrutado para axónios em regeneração após a lesão do nervo e a síntese de proteínas intra-axonal é necessária para a regeneração de axónios correcta destes 17. Além disso, o nosso grupo has demonstrou que mRNAs específicos são recrutados para os axônios após exposição local à doença de Alzheimer peptídeo Aâ 1-42, e tradução local do ATF4 fator de transcrição é necessária para propagar os efeitos neurodegenerativos de Ap 1-42 de axônios para a soma neuronal 18. Finalmente, análises de alto rendimento têm revelado que os axônios maduros têm um transcriptoma mais complexo e dinâmico do que o esperado 18-21, especialmente sob condições patológicas. À luz destes estudos, um método altamente sensível e específico para a detecção de mRNAs axonally localizados no sistema nervoso adulto é necessária. Grande parte do trabalho sobre recrutamento mRNA e tradução local em axônios maduras foi realizada em neurônios cultivados. Isto é especialmente verdadeiro para as análises do transcriptoma de cultura uma vez que não existem métodos especializados que permitem o isolamento de axónios do compartimento da somato-dendrítico 18-20. Embora esses estudos tenham dado ins valiososight para o papel da tradução local em axônios maduros, a questão de saber se neurônios cultivados representam fielmente a situação in vivo ou se o recrutamento mRNA é uma resposta adaptativa dos axônios para condições de cultura ainda está aberta. Poucos estudos têm fornecido evidências de recrutamento mRNA para amadurecer axônios in vivo. Por exemplo, o transcrito que codifica para a proteína marcadora olfactiva tem sido detectada em axónios em neurónios sensoriais adultos 22. Um transgene contendo 3 &#39;UTR do mRNA β-actina é transportado para axónios em neurónios do sistema nervoso periférico e central, nos ratinhos, e é localmente traduzido após períodos de desenvolvimento 23. Lamin b2 mRNA é localizada axônios da retina em Xenopues laevis girinos e seu esgotamento afeta manutenção axônio após o desenvolvimento axonal 21. Interferência com o transporte axonal do ARNm que codifica para o citocromo C oxidase IV altera o comportamento do rato 24. Finalmente, ATF4 ARNm é encontrado em um adultoXONs de ratos e cérebros humanos no contexto de Ap 1-42 induzida neurodegeneração 18. Transcriptoma análises de alto rendimento têm provado ser útil para identificar perfis de mRNA em axônios isolado in vitro, mas tem limitações para estudos in vivo uma vez que em tecidos completos axônios nunca são encontrados isoladamente, mas misturado com corpos celulares neuronais, células gliais e outros tipos de células. Assim, essas análises têm de ser combinadas com as técnicas de imagem que confirmem a localização subcelular de mRNAs. RNA de hibridação in situ (ISH ARN) permite a detecção e a visualização de sequências de RNA específicas em células e tecidos. No entanto, os ensaios de ARN ISH originais foram adequado apenas para a identificação de ARN altamente abundantes 25, que é raramente o caso para o ARNm axonally localizadas. Para as últimas décadas crescentes esforços têm sido postas em desenvolvimento novas tecnologias que permitem a detecção de ARNm no nível de uma única molécula <sup&gt; 25,26. Por exemplo, Singer e seus colegas desenvolveram sondas ISH para detectar mRNAs em células individuais, que consiste em 5 não sobrepostas marcado por fluorescência 50-meros (para obter detalhes consulte o 27). A principal diferença entre as técnicas acima mencionadas e aquela aqui descrito é que a posterior usa 20 Z-estrutura dupla (não linear), que tipicamente têm como alvo sondas ~ 1 kb da região de ARN de interesse assegurar a especificidade e baixos níveis de fundo. As sondas são então hibridados com sequências pré-amplificador e do amplificador que estão, finalmente, marcados com fluorescência ou conjugados com enzimas que permitem reacções cromogénicos. Estes passos de amplificação melhorar a relação sinal-para-ruído em comparação com outras tecnologias de ISH 28. Aqui nós descrevemos dois protocolos utilizando RNAscope combinada ou com fluorescência imunocitoquímica ou com corantes histológicos permitindo counterstaining axonal. Ambos os protocolos são adequados para visualizar localização axonal de ATF4 mRNA em mo adultoe utilizar os cérebros humanos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>custom probe targeting residues 20-1381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>-</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>custom probe targeting residues 15-1256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>-</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative control probe-DapB</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">310043</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>positive control probe-mouse Polr2A (optional)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">312471</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>positive control probe-human PPIB (optional)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">313901</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">320850</td>
			<td>In situ hybridization kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - BROWN (for chromogenic detection)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">310035</td>
			<td>In situ hybridization kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-ChAT antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>KTLFB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clearify clearing agent (xylene substitute)</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>CACLEGAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold mounting&#160; medium with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">6522</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of axonally localized mrnas in brain sections using high-resolution in situ hybridization

mRNAs são freqüentemente localizada axônios vertebrados e sua tradução local é necessário para pathfinding axônio ramificação ou durante o desenvolvimento e para a manutenção, reparação ou neurodegeneração em períodos postdevelopmental. Análises de alto rendimento revelaram recentemente que os axônios têm um transcriptoma mais dinâmico e complexo do que o anteriormente esperado. Estas análises, no entanto, têm sido feitas principalmente em neurónios em cultura, onde axónios podem ser isolados a partir dos compartimentos somato-dendrítico. É virtualmente impossível de alcançar tal isolamento em tecidos completos in vivo. Assim, a fim de verificar o recrutamento de ARNm e a sua relevância funcional num animal inteiro, análises transcriptoma devem, idealmente, ser combinadas com as técnicas que permitem a visualização de ARNm in situ. Recentemente, as novas tecnologias ISH que detectam ARN a um nível de uma única molécula têm sido desenvolvidos. Isto é especialmente importante quando se analisa a localização subcelular de ARNm, Uma vez que os ARN são localizados, tipicamente encontrada em níveis baixos. Aqui, descrevemos dois protocolos para a detecção de ARNm axonally-localizadas utilizando um novo ultra-sensível tecnologia de RNA ISH. Nós combinamos RNAscope ISH com counterstain axonal usando imuno-histoquímica de fluorescência ou corantes histológicos para verificar o recrutamento de ATF4 mRNA para axônios in vivo no rato maduro e cérebros humanos.

Uma breve resumo dos procedimentos descritos acima é mostrado na Figura 1. Detecção óptima de mRNA ATF4 grânulos em axónios colinérgicos usando desmascaramento induzida por calor Ao avaliar a localização axonal de ARNm, que é crítico para ser capaz de identificar os axónios e para ser capaz de visualizar baixas RNAs abundantes. A tecnologia de ARN ISH aqui descrito permite a detecção de RNAs com uma resolução de uma únic...

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Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Detecção de Axonally localizada mRNAs em seções do cérebro Usando de alta resolução<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

11.7K visualizações.  Columbia University. RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

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Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Fluorescência dupla In situ Hibridação nas Seções cérebro fresco

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Neurociência

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

Combinando corante lipofílico, In situ Hibridação, imunohistoquímica e histologia

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

Uma abordagem rápida para alta resolução de imagem de fluorescência em fatias grossas Semi-Cérebro

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

A detecção do genoma e Transcrições de um vírus DNA persistente em tecidos neuronais por fluorescentes Em situ Hibridização Combinado com Imunocoloração

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

Spinal Cord Injury completo e Cérebro Dissection Protocolo para Wholemount Subsequente<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização em larval da lampreia de mar

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

Alta resolução<em&gt; In Vivo</em&gt; Manual Protocolo Segmentação para hipocampo humano subcampos Utilizando Ressonância Magnética 3T

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome. This hypothesis can be tested using in situ hybridization to detect the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a. In the past, such procedures, utilizing radioactive riboprobe, were difficult because of the complicated workflow that needs several days to perform and the added difficulty that the technique required the use of fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment. Recently, the development of short oligonucleotide probes has simplified in situ hybridization procedures and allowed the use of paraformaldehyde-prefixed brain sections, which are more widely available in laboratories. Here, we describe a detailed protocol using non-radioactive oligonucleotide probes on the prefixed brain tissues. Hybridization probes used for this study include dapB (a bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase), ppiB (a housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B), and htr2a (a serotonin gene coding for 5-HT2A receptors). This method is relatively simply, cheap, reproducible and requires less than two days to complete.

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.

Rápido<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação usando sondas Oligonucleotide no cérebro prefixado-paraformaldeído de ratos com síndrome serotoninérgica

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can be hampered by the lack of specific primary or secondary antibodies for immunostaining. Here we describe a protocol to detect the expression of three different genes in the same brain section using double fluorescence in situ hybridization with two gene-specific probes followed by immunostaining with an antibody of high specificity directed against the protein encoded by a third gene. The Aspartoacyclase (ASPA) gene, mutations of which can lead to a rare human white matter disease - Canavan disease - is thought to be expressed in oligodendrocytes and microglia but not in astrocytes and neurons. However, the precise expression pattern of ASPA in the brain has yet to be established. This protocol has allowed us to determine that ASPA is expressed in a subset of mature oligodendrocytes and it can be generally applied to a wide range of gene expression pattern studies.

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

Combinando Duplo Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com imunomarcação para a detecção da expressão de três genes em secções do cérebro do rato

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in regulating neuronal growth and development. However, the mechanisms underlying Drd1&#945; receptor abnormalities mediating behavioral responses and modulating working memory function are still unclear. Using a novel RNA in situ hybridization assay, the current study identified dopamine Drd1&#945; receptor and tyrosine hydroxylase (TH) RNA expression from DA-related circuitry in the nucleus accumbens (NAc) area and substantia nigra region (SNR), respectively. Drd1&#945; expression in the NAc shows a &#34;discrete dot&#34; staining pattern. Clear sex differences in Drd1&#945; expression were observed. In contrast, TH shows a &#34;clustered&#34; staining pattern. Regarding TH expression, female rats displayed a higher signal expression per cell relative to male animals. The methods presented here provide a novel in situ hybridization technique for investigating changes in dopamine system dysfunction during the progression of central nervous system diseases.

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of dopamine D1-alpha receptor in the nucleus accumbens is critical for clarifying D1 receptor dysfunction during a central nervous system disease. We performed a novel RNA in situ hybridization assay to visualize single RNA molecules in a specific brain area.

Identificação de Receptor de dopamina D1-alfa dentro roedores núcleo Accumbens por uma inovador RNA In Situ tecnologia da deteção

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

Imagem latente 3D de alta resolução da infecção do vírus da raiva no tecido solvente-cancelado do cérebro

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...