Este trabalho foi apoiado pela associação americana do coração [subsídio 0365274B para H.L.], National Cancer Institute [P50CA150964 GI SPORE para Z.W.], National Institutes of Health [escritório de pesquisa infra-estrutura compartilhada instrumentação Grant S10RR031845 para a microscopia de luz imagem facilidade na Case Western Reserve University] e China Scholarship Conselho [X.G.]. Os autores graças a Richard Lee do núcleo de Imaging de microscopia de luz por sua ajuda com a digitalização de slides.

Todos os experimentos descritos aqui que envolvem ratos foram aprovados pelo Comitê de utilização e caso Western Reserve University institucional Cuidado Animal. O título do protocolo de 2016-0068 (PI: Hua Lou) é "Papel de alternativo pre-mRNA emendar no desenvolvimento de vertebrados".
Nota: Informações de todos os equipamentos, reagentes e suprimentos utilizados neste protocolo são incluídas na Tabela de materiais.
1. prepare a formalina parafina fixa incorporado (FFPE) seções
<ol><li>
Eutanásia em 1 CD1 de rato e 1 rato C57BL/6J por deslocamento cervical. Cuidadosamente corte o crânio com uma tesoura cirúrgica e fórceps. Remova o cérebro com uma colher. Nota: 5 meses CD1 masculinos ratos e camundongos machos de 3 meses C57BL/6J foram utilizados e mostraram resultados semelhantes.<ol>
<li>Lave o cérebro com PBS. Consertar o cérebro com uma solução de formol a 10% em temperatura ambiente (RT) para 30 h colocando o cérebro todo em 50 mL da solução de formalina.</li>
		<li>Alterar a solução de fixação para PBS e incubar o cérebro em PBS durante a noite a 4 ° C. Desidratar e incorporar o cérebro com xileno e parafina usando os procedimentos padrão de18.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Use um micrótomo para corte de tecido incorporado em 5 seções µm. Ponha a fita de parafina em banho maria RT primeiro e depois em um banho de água de 45 ° C para espalhar a faixa de opções.
	<ol>
<li>Quando as rugas e dobras na fita desaparecerem, imediatamente monte seções em lâminas de vidro. Ar secos slides durante a noite em slides RT. leve ao forno por 1h a 60 ° C antes do uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. pré-tratamento da amostra
<ol><li>
Deparaffinize cortes de tecido. Execute estas etapas em uma coifa.
	<ol>
<li>Preencha dois lavar pratos (figura 1A) com 250 mL de xileno fresco e dois com 250 mL de etanol a 100%. Inserir slides de tecido em um rack de lavagem (figura 1A) e coloc a lavagem da cremalheira em lavar pratos seguindo a ordem e incubação tempo indicado na tabela 1.</li>
		<li>Durante cada incubação, levante o cesto de lavagem acima e para baixo mais de 3 vezes no lavar prato. Após cada incubação, mover-se rapidamente a cremalheira de lavagem para o prato seguinte de lavagem para impedir os cortes histologicos desseque.</li>
		<li>Depois de concluir as etapas de incubação, retire o cesto de lavagem com slides do lavar prato. Coloque o Carré numa incubadora de 60 ° C por 5 min ou até que as lâminas estejam completamente secas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desenhe uma 0,75 '' x 0,75 '' barreira em torno da seção de tecido com uma caneta de barreira hidrofóbica. Ar seco a barreira por 3 min em RT</li>
	<li>
Fatias de pré-tratamento
	<ol>
<li>Preparar reagentes e equipamentos<ol>
<li>Acender o forno de hibridização (figura 1B) e definir a temperatura a 40 ° C 30 min antes de usar.</li>
			<li>Molhe o papel de humidificação (Figura 1E) com água destilada completamente e colocá-lo na bandeja de controle de umidade (Figura 1, à esquerda). Manter a bandeja de controle de umidade no forno da hibridação.</li>
			<li>Prepare a 700 mL de 1x fresco alvo recuperação de reagentes, acrescentando 630 mL de dH2O a 70 mL de 10 x alvo recuperação de reagentes.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aplica o peróxido de hidrogênio.<ol>
<li>Coloque os slides deparaffinized no banco. Adicione 5-8 gotas de peróxido de hidrogênio a uma seção para cobrir totalmente o tecido. Incubar durante 10 minutos a RT.</li>
			<li>Toque os slides em um pedaço de papel absorvente para remover a solução de peróxido de hidrogênio, um slide de cada vez. Imediatamente inserir o slide em um rack de lavagem e mover o cesto para um prato de lavar roupa cheio de dH2O.</li>
			<li>Lave os slides, movendo o rack acima e para baixo em água destilada por 3 a 5 vezes. Tirar a grade de lavagem para um prato de lavagem cheio de água destilada fresca e slides de lavagem mais uma vez.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Executar recuperação de alvo<ol>
<li>Coloque um copo de vidro de 1.000 mL em uma chapa quente. Adicione 700 mL de 1x fresco alvo recuperação de reagentes para o copo e cubra com papel alumínio. Inserir um termômetro na medida através da cobertura da folha (Figura 1). Ligar a chapa e coloque em alta por 10-15 min.</li>
			<li>Quando a temperatura dos reagentes de recuperação atinge 98 ° C, passar o controle de temperatura da placa quente de alta para baixa para manter uma fervura suave. Não ferva mais de 15 min.</li>
			<li>Enquanto isso, cuidadosamente Abra o papel alumínio e coloque a grelha de lavagem com fatias dentro o regente de recuperação. Cobrir o copo novamente e incube por 15 min.</li>
			<li>Uso de fórceps para retirar o suporte do copo para um prato de lavagem preenchido com 200 mL de dH2O e enxaguar por 15 s.</li>
			<li>Mover o cesto para um prato de lavagem contendo 100% de etanol fresco e deixe descansar por 3 min. remover slides e secá-las em uma incubadora de 60 ° C por 10 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aplicar a Protease III<ol>
<li>Coloque os slides na prateleira a mancha (Figura 1, direito). Adicione 5 gotas de Protease III para cobrir o tecido. Cuidadosamente coloque a grelha na bandeja de controle de umidade (Figura 1, à esquerda) e insira a bandeja do forno de hibridização de 40 ° C. Incube durante 30 min.</li>
			<li>Retire as lâminas e volte a colocar o tabuleiro no forno. Toque os slides para remover o excesso de líquido, um slide de cada vez. Inserir o slide em um rack de lavagem e o rack em um prato de lavar roupa cheio de dH2O. Move o rack de cima e para baixo para lavar os slides para 3 - 5 vezes.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ISH ensaio
<ol><li>
Preparar materiais
	<ol>
<li>Pré-aquecer 50 x tampão de lavagem em uma incubadora de 40 ° C por 20 min. Mix 2,94 L de dH2O e 60 mL de 50 x tampão de lavagem tornar 1x tampão de lavagem.</li>
		<li>Prepare a solução de coloração de hematoxilina 50% adicionando-se 100 mL de hematoxilina de Gill, eu a 100 mL de dH2água de amônia de 0,02% (p/v) Prepare O. adicionando 1,43 mL de 1 N de hidróxido de amônio a 250 mL de dH2O. Mix bem em um recipiente.</li>
		<li>Colocar as sondas e AMP 0 – 6 reagentes RT 30 min antes de usar. Manter a bandeja de controle de umidade em forno de hibridização a 40 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procedimento ISH Nota: Para examinar a expressão da Nf1 isoformas de emenda e calcular a porcentagem emendada em valor (PSI) para exon 23a, três diferentes sondas ISH que destino exon 23a-incluído isoform, exon 23a-excluídos isoform ou ambas as isoformas são usados (Figura 2 ). As sondas são usadas na Adjacent corte cortes histologicos. Para garantir a precisão do cálculo, é fundamental que os três cortes histologicos são tratados exatamente o mesmo nas etapas de deteção de hibridização e amplificação de sinal.<ol>
<li>Teste de hibridização.<ol>
<li>Retire o cesto de lavagem os slides e toque o líquido em excesso das lâminas de. Coloque os slides no rack mancha.</li>
			<li>Use um lápis para rotular as lâminas com o nome de sonda. Coloca os três slides de tecido de cérebro Adjacent corte para ser hibridizado com três diferentes sondas de Nf1 (Figura 2) juntos. Realize as etapas subsequentes na mesma ordem dos slides.</li>
			<li>Adicione 4 gotas de sonda para cobrir o tecido. Fazer um slide de cada vez para evitar que as seções de secar. Coloque o Carré de mancha na bandeja do controle de umidade e inseri-lo no forno 40 ° C por 2 h.</li>
			<li>Lave as lâminas duas vezes com tampão de lavagem. Para cada lavagem, encher o prato de coloração com 200 mL de tampão de lavagem 1x e coloque um rack de lavagem nele. Toque o excesso de líquido em um slide de um papel toalha por vez e rapidamente, inseri-lo dentro do rack de lavagem. Mover as lâminas acima e para baixo no prato para 3 a 5 vezes por 2 min em RT</li>
			<li>Para a segunda lavagem, use o tampão de lavagem fresca.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Amplificação de sinal.<ol>
<li>Toque o tampão de lavagem em excesso das lâminas de... e colocá-los na prateleira de mancha. Adicione 4 gotas de AMP 0 para cobrir o tecido. Coloque o Carré de mancha na bandeja do controle de umidade e inseri-lo no forno por 30 min a 40 ° C.</li>
			<li>Lave as lâminas duas vezes com tampão de lavagem como descrito acima.</li>
			<li>Repita este passo com AMP 1 – 6, seguindo a ordem e a condição da tabela 2. Lave as lâminas duas vezes depois de cada passo de hibridização.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Detecção do sinal<ol>
<li>Toque o tampão de lavagem em excesso das lâminas de... e colocá-los em rack de mancha. Adicionar 2 µ l de Fast Red B a 120 µ l de Fast Red (proporção de 1: 60) em um tubo de microcentrifugadora. Misture bem e adicione para cobrir totalmente a seção de tecido. Nota: O volume total de vermelho A / B mix baseia-se no número e tamanho das secções de tecido. Para uma área de 0,75 '' x 0,75 '', 120 µ l é suficiente para uma seção. Use a mistura dentro de 5 min e evitar a exposição da mistura à luz solar direta ou luz UV.</li>
			<li>Feche a bandeja e incubar durante 10 minutos a RT. Remove a solução para um contentor de resíduos e imediatamente inserir os slides em um rack de lavar e coloque o Carré em um prato de lavagem cheio de água da torneira. Lave novamente com água fresca da torneira.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Counterstaining dos slides
	<ol>
<li>Retire o cesto de lavagem da água da torneira e rapidamente toque em papel absorvente para remover a água extra. Colocar o cesto em uma hematoxilina de 50%, solução de coloração e imediatamente tirar a grade acima e para baixo várias vezes. Incubar por 2 min em RT.</li>
		<li>Transferi o porta-lâminas volta para o prato de água da torneira. Lave 3 – 5 vezes movendo o rack acima e para baixo e trocando a água fresca da torneira até os slides tornam-se claras, enquanto os tecidos do cérebro permanecem roxos.</li>
		<li>Mova o cesto para um prato contendo água de amônia de 0,02%. Tirar a grade acima e para baixo 2 – 3 vezes até que os tecidos ficam azuis. Lave os slides 3 a 5 vezes com água fresca da torneira em um prato de coloração.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montagem das amostras
	<ol>
<li>Mover o porta-lâminas do prato coloração para uma incubadora de 60 ° C e incubar durante pelo menos 15 min, até que as lâminas estejam completamente secas.</li>
		<li>Coloque 40 µ l de meio de montagem no slide e cuidadosamente coloque uma lamínula 24 x 50 mm sobre a seção de tecido. Ar secos slides durante 30 min à RT</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. análise e coleta de dados
Nota: Use um scanner de slides para digitalizar as imagens na ampliação de X 40.
<ol><li>
Controles positivos e negativos
	<ol>
<li>Para cada experimento, incluem controles positivos e negativos (Figura 3). Como um bom controle positivo, o sinal deve ser visível como punctate pontos na ampliação de 20-40 X.</li>
		<li>Uso do Mouse (Mm) - PPIB - 1ZZ como controle positivo. Esta sonda alveja um gene de limpeza comum PPIB. Para controle negativo, um ponto para cada 20 células exibindo coloração por campo de microscópio X 20 de fundo é aceitável.</li>
		<li>Use a sonda DapB-1ZZ como controlo negativo. Esta sonda dapB o gene bacteriano como alvo. Estas sondas de controle têm sido utilizadas em muitos ensaios ISH19.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Detecção do sinal e a análise de como os padrões de expressão de Nf1 exon 23a
	<ol>
<li>Como os sinais de hibridação são indicados como pontos punctate, conte os pontos manualmente. O número de pontos está correlacionado com o nível de transcrições que é detectado por uma ponta de prova específica. Observe que o número de pontos também pode ser analisado pelo software ImageJ ou SpotStudio.</li>
		<li>Use três sondas para cruzar a exon 23a-contendo, exon 23a-faltando isoformas ou transcrições de Nf1 totais (Figura 2). Como as três sondas não podem ser usadas simultaneamente, use três seções do tecido cerebral adjacente para cruzar para cada sonda.<ol>
<li>Para calcular o % emendados em (PSI) para exon 23a, conte o número de células e pontos em várias regiões do cérebro. Para cada região de interesse, conte mais de 400 células de várias sub-regiões, conforme indicado na Figura 4.</li>
			<li>Colete dados de sub-regiões mesmas para cada uma das três sondas. Calcular o PSI como o número de pontos por celular com a sonda de inclusão exon 23a / (número de pontos por celular com a sonda de inclusão exon 23a + número de ponto por célula com o exon23a saltando de sonda) x 100%.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes.">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).</li><li>Cieply, B., Carstens, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+alternative+splicing+factors+in+human+disease.">Functional roles of alternative splicing factors in human disease.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).</li><li>Xiong, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+splicing.+The+human+splicing+code+reveals+new+insights+into+the+genetic+determinants+of+disease.">RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease.</a> Science. 347, 1254806 (2015).</li><li>Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+splice+variants+in+the+5'UTR+of+Gtf2i+expressed+in+the+rat+brain:+alternative+5'UTRs+and+differential+expression+in+the+neuronal+dendrites.">Novel splice variants in the 5'UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5'UTRs and differential expression in the neuronal dendrites.</a> Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).</li><li>Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+quantification:+in+situ+analysis+of+transcriptome+and+pre-mRNA+alternative+splicing+at+the+nanoscale.">Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li><li>Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamic+acid+decarboxylase+1+alternative+splicing+isoforms:+characterization,+expression+and+quantification+in+the+mouse+brain.">Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain.</a> BMC Neuroscience. 15, 114 (2014).</li><li>Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. 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Os autores não têm nada para divulgar.

A presente comunicação relata o uso de BaseScope RNA ISH para examinar como os padrões de expressão nas seções de cérebro de rato. Está demonstrado que essa junção exon de anti-sentido-exon sondas menor do que 50 nucleótidos podem direcionar exon inclusão e saltando isoformas robusta e especificamente. Além disso, os sinais resultantes podem ser usados para calcular PSI de um exon alternativo.
Algumas variações foram testadas no procedimento. Por exemplo, seções de tecido cong...

Splicing alternativa (AS) é um processo comum que ocorre durante a maturação de pre-mRNA. Neste processo, um exon diferencialmente pode ser incluído no mRNA maduro. Assim, AS, através de um gene pode gerar muitos mRNAs esse código para produtos diferentes da proteína. Estima-se que os 92 – 94% dos genes humanos sofrem alternativas emenda1,2. Alternativa anormal, padrões de emenda resultou de mutações genéticas têm sido associadas a um grande número de doenças, incluindo câncer,3,4, distrofia miotônica e esclerose lateral amiotrófica. Assim, é crucial investigar e entender melhor os mecanismos reguladores splicing alternativos na tentativa de encontrar novos tratamentos de doenças humanas.
COMO muitas vezes é regulada de forma de tipo específico de célula. É importante determinar o padrão de expressão de AS de um gene específico em um determinado sistema biológico. No entanto, isso se torna complicado quando um órgão complexo que contém muitos tipos diferentes de células, tais como o cérebro ou no coração, é estudado. Neste caso, a escolha ideal do sistema de ensaio é RNA em situ hibridação (ISH) usando tecido seções para que o padrão de expressão de AS de um gene específico pode ser detectado em muitos tipos de células simultaneamente. Com efeito, sondas específicas do exon têm sido utilizadas para avaliar os níveis de expressão de uma alternativa exon5,6,7. No entanto, essa abordagem não é adequada para análise do padrão pelas seguintes razões. Em primeiro lugar, convencionais métodos ISH geralmente usam sondas mais de 300 bp, enquanto o tamanho médio dos vertebrados exões internos (não primeiro ou último exon) é 170 nucleotídeos8,9. Em segundo lugar, quando uma sonda exon-específico é usada para examinar o padrão de emenda de um exon alternativo interno, a única isoforma de mRNA detectada pela sonda é aquele que contém o exon, enquanto a isoforma de mRNA sem o exon não pode ser detectado. Assim, o cálculo por cento emendados em valor (PSI) para o exon alternativo é complicado. Além disso, ISH fluorescente convencional muitas vezes combina ISH com imunocoloração, que reduz a eficiência de deteção e robustez. Por exemplo, em um estudo que investigou a induzida por estresse, Emendando isoform comutação da acetilcolinesterase (AChE) mRNA, Digoxigenina foi incorporada a sonda ISH e detectado usando anticorpo anti-Digoxigenina. Alternativamente, biotina-rotulado sonda foi detectada por um fosfatase alcalina/estreptavidina conjugado e um substrato para a fosfatase alcalina10. Nenhum método usa qualquer estratégia de amplificação para aumentar a sensibilidade da deteção. Como resultado, é difícil detectar as transcrições de mRNA que são expressos em níveis baixos. Assim, é necessário um sistema de ensaio ISH mais simples e mais robusto para analisar como expressão padrões em situ.
BaseScope foi recentemente desenvolvido com base na plataforma de RNAscope, uma bem estabelecida e amplamente utilizado o sistema de ensaio ISH. Ambos os sistemas de ensaio utilizam uma tecnologia de amplificação de destino específico que aumenta a sensibilidade da deteção11,12. O que distingue um do outro é o comprimento da sequência de destino, que é tão curto quanto 50 nucleótidos para BaseScope e 300 – 1.000 nucleotídeos para RNAscope. Assim, é possível a concepção sondas junções exon-exon para detectar alternativa específica do mRNA isoformas de destino. No estudo atual, foi estabelecido um procedimento para examinar como testes padrões da expressão de neurofibromatose tipo 1 (Nf1) exon 23a, um exon alternativo extensivamente estudado no mesmo laboratório13,14,15 , 16 , 17, nas seções de cérebro de rato. Os resultados demonstram que o BaseScope é um sistema ideal para estudar os padrões de expressão de Nf1 exon 23a in situ. Como este sistema de ensaio pode ser adaptado para analisar como padrões de expressão de muitos exões alternativos, representa uma nova ferramenta poderosa nos estudos de AS.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybridization Oven</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>241000ACD</td><td></td></tr><tr><td>Humidity Control Tray (with lid)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310012</td><td></td></tr><tr><td>Stain Rack</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310017</td><td></td></tr><tr><td>Hot plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>1160049SH</td><td></td></tr><tr><td>Imperial III General Purpose Incubator</td><td>Lab-Line</td><td>302</td><td></td></tr><tr><td>Slide Scanner</td><td>Leica</td><td>SCN400</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Pretreatment kit&lt;/strong&gt;</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>322381</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2000899</td><td></td></tr><tr><td>Protease III*</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2000901</td><td></td></tr><tr><td>10x Target Retrieval</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2002555</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Detection Reagent Kit</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>332910</td><td></td></tr><tr><td>AMP 0</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001814</td><td></td></tr><tr><td>AMP 1</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001815</td><td></td></tr><tr><td>AMP 2</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001816</td><td></td></tr><tr><td>AMP 3</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001817</td><td></td></tr><tr><td>AMP 4</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16229B</td><td></td></tr><tr><td>AMP 5-RED</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16229C</td><td></td></tr><tr><td>AMP 6-RED</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001820</td><td></td></tr><tr><td>Fast RED-A</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001821</td><td></td></tr><tr><td>Fast RED-B</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16230F</td><td></td></tr><tr><td>50x Wash Buffer</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310091</td><td></td></tr><tr><td>Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>701021</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>701081</td><td></td></tr><tr><td>Control slide-mouse 3T3 cell pellet</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310045</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humidifying Paper</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310015</td><td></td></tr><tr><td>Washing Rack</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>9837976</td><td></td></tr><tr><td>Washing Dishes</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>LWS20WH</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic Barrier Pen</td><td>Vector Laboratory</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Glass Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass, 24 mm x 50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12--545-F</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>002689</td><td></td></tr><tr><td>100% ethanol (EtOH)</td><td>Decon Labs</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>formalde solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF94-4</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin I</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>17012359</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium</td><td>Vector Labs</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>173942</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analysis of alternative pre-mrna splicing in mouse brain sections using rna in situ hybridization assay

Splicing alternativa (AS) ocorre em mais de 90% dos genes humanos. O padrão de expressão de um exon alternativamente emendado frequentemente é regulado de forma de tipo específico de célula. COMO expressão de padrões normalmente são analisados por RT-PCR e RNA-seq usar amostras do RNA isolado de uma população de células. Em situ exame de como os padrões de expressão para uma particular estrutura biológica pode ser realizada por RNA em situ da hibridação (ISH) usando sondas específicas do exon. No entanto, este uso particular do ISH tem sido limitado porque exões alternativos geralmente são muito curtos para projetar sondas específicas do exon. Neste relatório, o uso de BaseScope, uma tecnologia desenvolvida recentemente que emprega oligonucleotides antisentidos curtos no RNA ISH, é descrito para analisar como padrões de expressão nas seções de cérebro de rato. Exon 23a de neurofibromatose tipo 1 (Nf1) é usado como um exemplo para ilustrar que curto exon-exon junction sondas exibem sinais de hibridização robusto com alta especificidade na análise de RNA ISH em seções de cérebro de rato. Mais importante, sinais detectados com sondas de inclusão e saltando-específicas do exon podem ser usados para confiantemente, calcular a porcentagem emendada em valores de Nf1 exon 23a expressão em diferentes áreas anatômicas de um cérebro de rato. O protocolo experimental e o método de cálculo para análise são apresentados. Os resultados indicam que o BaseScope oferece uma nova ferramenta poderosa para avaliar como expressão padrões em situ.

BaseScope ISH foi realizado utilizando três estirpes de rato: CD1 selvagem tipo ratos, C57BL/6J selvagem tipo ratos e ratos mutantes de Nf123aIN/23aIN em background C57BL/6J, em qual exon 23a está incluído em todos os tipos de células como resultado de engenharia local da tala mutações de14,15.
Como primeiro passo, o sistema de ensaio ISH foi t...

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Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

É descrito um em situ protocolo de hibridação (ISH) que usa oligonucleotides antisentidos curtos para detectar padrões de splicing alternativo pre-mRNA nas seções de cérebro de rato.

Análise quantitativa de alternativo Pre-mRNA emendar nas seções de cérebro de rato usando o RNA In Situ da hibridação do ensaio

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

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Genetics

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

8.8K visualizações.  Case Western Reserve University. É descrito um em situ protocolo de hibridação (ISH) que usa oligonucleotides antisentidos curtos para detectar padrões de splicing alternativo pre-mRNA nas seções de cérebro de rato.

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Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 nucleotides apart result in either the inclusion (S) or exclusion (&#916;S) of a single residue, Serine-701. Further downstream, splicing at a pair of alternative acceptor splice sites result in transcripts encoding either the 55 terminal residues of the transactivation domain (&#945;) or a truncated transactivation domain with 7 unique residues (&#946;). As outlined in this manuscript, measuring the proportions of STAT3's four spliced transcripts (S&#945;, S&#946;, &#916;S&#945; and &#916;S&#946;) was possible using absolute qPCR (quantitative polymerase chain reaction). The protocol therefore distinguishes and measures highly similar splice variants. Absolute qPCR makes use of calibrator plasmids and thus specificity of detection is not compromised for the sake of efficiency. The protocol necessitates primer validation and optimization of cycling parameters. A combination of absolute qPCR and efficiency-dependent relative qPCR of total STAT3 transcripts allowed a description of the fluctuations of STAT3 splice variants' levels in eosinophils treated with cytokines. The protocol also provided evidence of a co-splicing interdependence between the two STAT3 splicing events. The strategy based on a combination of the two qPCR techniques should be readily adaptable to investigation of co-splicing at other tandem splicing sites.

Tandem splicing events occur at sites less than 12 nucleotides apart. Quantifying ratios of such splice variants is feasible using an absolute quantitative PCR approach. This manuscript describes how splice variants of the gene STAT3, in which two splicing events results in Serine-701 inclusion/exclusion and &#945;/&#946; C-termini, can be quantified.

Mesclando Absoluto e dados relativos PCR quantitativo para quantificar STAT3 Splice Variant Transcrições

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Genética

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance can be caused by a range of mechanisms, including increased drug elimination, decreased drug uptake, drug inactivation and alterations of drug targets. Recent data showed that other than by well-known genetic (mutation, amplification) and epigenetic (DNA hypermethylation, histone post-translational modification) modifications, drug resistance mechanisms might also be regulated by splicing aberrations. This is a rapidly growing field of investigation that deserves future attention in order to plan more effective therapeutic approaches. The protocol described in this paper is aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of several in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes. In particular, we evaluated the differential splicing of DDX5 and PKM transcripts. The aberrant splicing detected by the computational tool MATS was validated in leukemic cells, showing that different DDX5 splice variants are expressed in the parental vs. resistant cells. In these cells, we also observed a higher PKM2/PKM1 ratio, which was not detected in the Panc-1 gemcitabine-resistant counterpart compared to parental Panc-1 cells, suggesting a different mechanism of drug-resistance induced by gemcitabine exposure.

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Here we describe a protocol aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of parental and resistant in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes.

Usando RNA-sequenciação para detectar Novel Splice variantes relacionadas à resistência aos medicamentos em<em&gt; In Vitro</em&gt; modelos de cancro

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Pesquisa do câncer

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.

Uso de uma única molécula fluorescente hibridação In Situ (FISH-SM) para Quantify e Localize os mRNAs em oócitos murino

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

Um método rápido de alta capacidade para Ribonucleoproteínas Mapping (RNPs) no pré-mRNA Humanos

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Biologia

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Detecção de Axonally localizada mRNAs em seções do cérebro Usando de alta resolução<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Neurociência

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome. This hypothesis can be tested using in situ hybridization to detect the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a. In the past, such procedures, utilizing radioactive riboprobe, were difficult because of the complicated workflow that needs several days to perform and the added difficulty that the technique required the use of fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment. Recently, the development of short oligonucleotide probes has simplified in situ hybridization procedures and allowed the use of paraformaldehyde-prefixed brain sections, which are more widely available in laboratories. Here, we describe a detailed protocol using non-radioactive oligonucleotide probes on the prefixed brain tissues. Hybridization probes used for this study include dapB (a bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase), ppiB (a housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B), and htr2a (a serotonin gene coding for 5-HT2A receptors). This method is relatively simply, cheap, reproducible and requires less than two days to complete.

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.

Rápido<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação usando sondas Oligonucleotide no cérebro prefixado-paraformaldeído de ratos com síndrome serotoninérgica

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can be hampered by the lack of specific primary or secondary antibodies for immunostaining. Here we describe a protocol to detect the expression of three different genes in the same brain section using double fluorescence in situ hybridization with two gene-specific probes followed by immunostaining with an antibody of high specificity directed against the protein encoded by a third gene. The Aspartoacyclase (ASPA) gene, mutations of which can lead to a rare human white matter disease - Canavan disease - is thought to be expressed in oligodendrocytes and microglia but not in astrocytes and neurons. However, the precise expression pattern of ASPA in the brain has yet to be established. This protocol has allowed us to determine that ASPA is expressed in a subset of mature oligodendrocytes and it can be generally applied to a wide range of gene expression pattern studies.

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

Combinando Duplo Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com imunomarcação para a detecção da expressão de três genes em secções do cérebro do rato

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Detecção de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal Transição

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also be utilized to explore other complex regulatory mechanisms at the exon level. Alternative splicing and polyadenylation play a crucial role in the functional diversity of a gene by generating different isoforms to regulate gene expression at the post-transcriptional level, and limiting analyses to the whole gene level can miss this important regulatory layer. Here, we demonstrate detailed step by step analyses for identification and visualization of differential exon and polyadenylation site usage across conditions, using Bioconductor and other packages and functions, including DEXSeq, diffSplice from the Limma package, and rMATS.

Alternative splicing (AS) and alternative polyadenylation (APA) expand the diversity of transcript isoforms and their products. Here, we describe bioinformatic protocols to analyze bulk RNA-seq and 3' end sequencing assays to detect and visualize AS and APA varying across experimental conditions.

Identificação de Splicing Alternativo e Poliadenilação em Dados de RNA-seq

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

In Situ Hybridization Using Oligonucleotide Probes to Study RNA Expression in Rat Brain Sections

Source: Shokry, I. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53165">Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015).
This video demonstrates the detection of serotonin receptor RNA synthesis using oligonucleotide probes in rat brain tissue affected by serotonin syndrome. The protocol includes tissue pretreatment, probe hybridization, and enzymatic detection to visualize and quantify serotonin receptor RNA expression under a microscope.

Análise quantitativa de alternativo Pre-mRNA emendar nas seções de cérebro de rato usando o RNA In Situ da hibridação do ensaio

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Mesclando Absoluto e dados relativos PCR quantitativo para quantificar STAT3 Splice Variant Transcrições

Usando RNA-sequenciação para detectar Novel Splice variantes relacionadas à resistência aos medicamentos em

Uso de uma única molécula fluorescente hibridação In Situ (FISH-SM) para Quantify e Localize os mRNAs em oócitos murino

Um método rápido de alta capacidade para Ribonucleoproteínas Mapping (RNPs) no pré-mRNA Humanos

Detecção de Axonally localizada mRNAs em seções do cérebro Usando de alta resolução

Rápido

Combinando Duplo Fluorescência

Detecção de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal Transição

Identificação de Splicing Alternativo e Poliadenilação em Dados de RNA-seq

In Situ Hybridization Using Oligonucleotide Probes to Study RNA Expression in Rat Brain Sections