The authors would like to acknowledge Marcos Di Falco for his expertise and advice with the preparation of the samples for nano-LC MS/MS as well as Dr. Zoran Minic from the University of Regina for the LC MS/MS analysis. This work was supported by NSERC (DG402214-2011) and CRC (950-221184) funding. D.C. was supported by Concordia Institute for Water, Energy, and Sustainable Systems and FQRNT.

1. Prepare Reagentes <ol><li> Preparar a solução de extracção SDS-: M de Tris-HCl 0,1 M pH 7,5, glicerol a 5%, EDTA 10 mM e SDS a 1%. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de 0,22? M e armazenamento a 4 ° C. </li><li> Prepare os reagentes necessários para o banco de gel de poliacrilamida. <ol><li> Prepare a 1,5 M de Tris-HCl pH 8,8. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de 0,22? M e armazenamento à temperatura ambiente. </li><li> 0,5 M de Tris-HCl pH 6,8. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de 0,22? M e armazenamento à temperatura ambiente. </li><li> Prepare 10% SDS. Filtrar esterilizar utilizando um filtro de 0,22? M e armazenamento à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Prepare soluções necessárias para em gel e extracção de tripsina digerir péptido. <ol><li> Preparação de 100 mM de bicarbonato de amónio. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de 0,22? M e armazenamento a 4 ° C. </li><li> Prepare 1 stocks M TDT. Suspenso em 100 mM de bicarbonato de amónio e armazenar a -80 ° C. </li><li> Prepare 550 mM stocks iodoacetamida. Suspenso em100 mM de bicarbonato de amónio e armazenar a -80 ° C. </li><li> Prepare 100 ng / mL de tripsina stocks. Alíquota de 60 mL em 1,5 mL tubos de microcentrífuga e armazenar a -80 ° C. </li><li> Preparar a solução de extracção: ácido fórmico a 1%, 2% de acetonitrilo. </li><li> Preparar a solução de re-suspensão: 5% de acetonitrilo e ácido fórmico a 0,1%. </li></ol></li></ol> 2. Execute Lise Celular na Unidade de Filtro Cartucho com células preservadas em RNA Solução de Estabilização <ol><li> Expelir a solução de estabilização de ARN a partir da unidade de filtro de cartucho (1,5 ml) e num tubo de microcentrifugação de 2 ml usando uma seringa de 60 ml ligado na extremidade luer-lock do filtro. </li><li> Centrifuga-se o tubo de microcentrifugação de 2 ml durante 10 minutos a 17,000 xg para sedimentar quaisquer restos celulares. Isto é feito de modo a que o filtro no passo 2.3 não entupir. </li><li> Transferir o sobrenadante para uma unidade de filtro de ultra-centrifugaï¿½o 10 K para capturar quaisquer proteínas provenientes de células que foram lisadas do congelamento / thaW da amostra. Não jogue fora o sedimento. Será utilizado no passo 2.5. Realizar centrifugação da unidade de filtro de ultra-centrifugaï¿½o a 3.270 xg durante 30 minutos ou até que o volume foi reduzido para cerca de 600 ul. </li><li> Derreter a ponta de uma ponta de p10 e bloquear o lado não luer-lock da unidade de filtro de cartucho, com a extremidade aberta da ponta. Isto irá assegurar que nenhum tampão de extracção e biomassa escapa durante os passos de 2,5-2,7. </li><li> Suspende-se o sedimento em 1 ml de solução de extracção SDS e pipeta-la para a unidade de filtro de cartucho original. A maneira mais fácil de pipeta na unidade de filtro de cartucho é empilhar uma dica p200 em uma ponta P1000 e usar essa dupla ponta de pipetagem. </li><li> Adicionar 1 ml de solução de extracção SDS para a unidade de filtro de cartucho, de modo que o volume total é de cerca de 2 ml e incubar durante 10 min à temperatura ambiente, durante a rotação num forno de hibridação. Coloque toalhetes 3 laboratório amassado na parte inferior de um tubo de 50 ml. Parafilme ambas as extremidades da unidade de filtro de cartuchoe colocar a unidade do filtro cartucho para dentro do tubo de 50 ml. Fechar a tampa e colocar o tubo num forno de hibridação. </li><li> Após 10 min lugar a Sterivex filtrar em um floater espuma e prenda-o no lugar com uma seringa de 5 ml na extremidade luer-lock. Flutuar e incubar em um 95 ° C em banho-maria por 15 min. </li><li> Deixe que a unidade de filtro de cartucho fresco e girar à temperatura ambiente durante 1 hora (tal como no passo 2.6). </li><li> Expelir o lisado solução de extracção / SDS de células fora do filtro com uma seringa de 60 mL para a mesma unidade de filtro de ultra-centrifugaï¿½o como anteriormente (passo 2.3). Adicionar 1 ml de solução de extracção SDS fresco para a unidade de filtro de cartucho e mistura-se durante 30 segundos com a mão, em seguida, para expulsar a unidade de filtro de ultra-centrifugaï¿½o usando a seringa de 60 ml. Isto é para enxaguar a unidade de filtro de cartucho, para garantir que todas as proteínas foram removidas. </li><li> Realizar centrifugação na unidade de filtro de ultra-centrifugaï¿½o durante 45 min a 3270 xg ou até que o volume da unidade de filtro é menor do que 600 ul. </li><li> Rejeitar flow-through eo topo até a unidade de filtro ultra-centrifugaï¿½o com solução de SDS-extração fresco. </li><li> Centrifugar a unidade de filtro para a outra 45 min a 3.270 x g. </li><li> Repita os passos 2.11 e 2.12 duas vezes mais. Assegurar o volume final na unidade de filtro de ultra-centrifugaï¿½o é no máximo 600 jil no final da centrifugação final. </li><li> Neste ponto, o concentrado dividido em dois. Uma fracção será usado para a precipitação de ADN e o outro para precipitação da proteína. Nota: A quantidade de fraccionamento depende da quantidade de biomassa que foi filtrado e as utilizações pretendidas dos produtos. No nosso caso, nós dividir o concentrado com 10% em relação a precipitação do DNA e de 90% em relação a precipitação da proteína. </li></ol> 3. Protein Precipitation <ol><li> Adicionar 4 volumes de metanol: acetona (50:50) a um volume de concentrado e de vórtice durante 10 seg. Incubar durante a noite a -20 ° C. </li><li> Girar a 17.000 xg durante 30 min. Decantar o sobrenadantee deixar o sedimento (pode ser invisível) seco num Speedvac durante 1 h (ou até secar). Nota: Não mais de secar o sedimento, pois isso pode tornar difícil para voltar a suspender. </li><li> Suspende-se o sedimento em 25 ml de solução de SDS-extracção. Deixe descansar por uma hora, em seguida ressuspender pipetando cima e para baixo. </li><li> Quantificar proteína usando um kit de ensaio de proteína e as instruções do fabricante. </li></ol> 4. DNA Precipitation <ol><li> Adicionar a solução de SDS-extracção para a fracção de concentrado a ser usado para a precipitação de ADN até a marca de 500 ul. Este passo é simplesmente a aumentar o volume da solução, tornando-o mais fácil de trabalhar. </li><li> Adicionar 0,583 volumes de um reagente de precipitação de proteína (tal como o reagente de precipitação de proteína MPC) e agitar com vortex durante 10 seg. Você deverá ver uma forma precipitado branco. Nota: Temos também utilizado fenol: métodos de extração de DNA de clorofórmio, mas é mais difícil devido aos baixos volumes. Obtivemos melhores rendimentos de ADN usando oMPC Proteína Reagente de precipitação. </li><li> Centrifugar a 17.000 xg e 4 ° C durante 10 min. </li><li> Transferir o sobrenadante para outro tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e adicionar 0,95 volumes de isopropanol. Inverta 30-40 vezes. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 4 ° C, à velocidade máxima. </li><li> Decantar cuidadosamente e desprezar o sobrenadante. </li><li> Lavar duas vezes com 750 ul de etanol a 70%. </li><li> Remover o máximo possível de etanol por pipetagem, em seguida, deixe secar ao ar. Nota: Não secar sobre o DNA, pois isso pode tornar difícil para voltar a suspender. </li><li> Ressuspender em 25 ul de tampão TE baixo, pH 8 (Tris 10 mM-HCl, EDTA 0,1 mM). </li><li> Quantificar o ADN utilizando um kit de ensaio de ADNcd e as instruções do fabricante. Realizar gel de agarose (1%) eletroforese em 3 ul de DNA para verificar a sua qualidade. </li></ol> 5. Gel de SDS-PAGE de proteínas <ol><li> Preparar tampão de amostra (tampão de amostra Laemmli 950 ul e 50 ul β-mercaptoetanol). &lt;/ li&gt; <li> Adicionar o volume correspondente de 15 ug de proteína, ou um máximo de 20 ul de um volume igual de tampão de amostra e ferver durante 4 minutos. As amostras podem agora ser armazenados a -80 ° C até de SDS-PAGE podem ser executadas. </li><li> Preparar 10% de acrilamida com um gel de resolução de gel de acrilamida a 5% de empilhamento. </li><li> Carregar o gel com amostras e 4 ul de uma escada de proteína. Submeter o gel a constante de 120 V até o marcador de 250 kDa escada acaba de atingir o gel de resolução. </li><li> Corar o gel utilizando uma mancha de Coomassie base de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol> 6. Em gel de Tripsina-Digest e Peptídeo de Extracção Nota: Todos os passos daqui até 6,10 são realizadas em uma cabine de segurança biológica para minimizar a contaminação. <ol><li> Corte o excesso de gel sob a marca de 10 kDa escada para cada pista. Cada uma das pistas serão analisados ​​em MS / MS separadamente. Corte cada pista em 1 mm x 1 mm quadrados para aumentar a área de superfície e coloque tudo squares de pista para um tubo de ligação a partir de micro-centrífuga. Repita esse procedimento para todas as pistas. (Ácido acético a 1% pode ser usado para impedir o gel de secar e tornando-se difícil de cortar). Nota: minimizar a contaminação é crítica nesta fase, de modo que corta gel é efectuada numa câmara de segurança biológica sobre o molde em gel de SDS-PAGE de vidro utilizado para fazer o gel. </li><li> De-mancha <ol><li> Dispensar 50 ul de 100 mM de bicarbonato de amónio em cada tubo de ligação baixa, perto tampa e incubar a 37 ° C durante 10 min. </li><li> Dispensar 50 ul de acetonitrilo, perto tampa e incubar a 37 ° C durante 5 min. </li><li> Aspirar e descartar 150 ul. </li><li> Repita os passos 6.2.1 e 6.2.2. </li><li> Aspirar e descartar 95 ul. </li></ol></li><li> Desidratação <ol><li> Dispense 50 ul de acetonitrilo, perto tampa e esperar 5 min. Aspirar e descartar 45 ul e esperar 10 min. </li></ol></li><li> Redução <ol><li> Dispensar 50 ul de DTT (10 mM, diluída em 100 mM de MVAbicarbonato de ónio), perto tampa e esperar 30 min a 37 ° C. </li></ol></li><li> Alkylation <ol><li> Dispensar 50 uL de iodoacetamida (55 mM, diluída em bicarbonato de amónio 100 mM), tampão de perto e esperar 20 minutos a 37 ° C. </li><li> Dispensar 100 ul de acetonitrilo, perto tampa e incubar durante 5 min a 37 ° C. Aspirar e descartar 195 ul. </li></ol></li><li> lavagem <ol><li> Dispensar bicarbonato de amónio 50 ul, perto tampa e incubar durante 10 min a 37 ° C. </li><li> Dispensar 50 ul de acetonitrilo, perto tampa e incubar a 37 ° C durante 5 min. Aspirar e descartar 120 ul. </li></ol></li><li> Desidratação <ol><li> Dispense 50 ul de acetonitrilo, perto tampa e esperar 5 min. Aspirar e descartar 45 ul. </li><li> Dispense 50 ul de acetonitrilo, aguarde 5 min. </li><li> Aspirar e descartar 75 ul e esperar 5 min. </li></ol></li><li> Digestão <ol><li> Dispensar 25-30 ul de 6 ng / uL de tripsina (uté todos os fragmentos de gel são cobertos). Fechar a tampa e esperar 30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Incubar durante a noite (mínimo de 4,5 horas) a 37 ° C. </li><li> Deixe descansar em temperatura ambiente por 30 min. </li></ol></li><li> Extracção e Péptido Transferência <ol><li> Dispensar 30 ul de solução de extracção e cobrir com tampa durante 30 min em gelo. </li><li> Aspirar 30 ul de volume aspirado e dispensar em um novo tubo de ligação de baixo marcado. </li><li> Dispensar 12 ul de solução de extracção, e 12 ul de acetonitrilo para dentro do tubo original (com gel). Fechar a tampa e incubar durante 30 min em gelo. </li><li> Aspirar 15 ul e depósito para o novo tubo. </li><li> Repita os passos (6.9.3 e 6.9.4). </li></ol></li><li> Coloque novos tubos em um SpeedVac até secar. </li><li> Ressuspender em 50 ul de solução de ressuspensão. Vortex no médio por 10 minutos para voltar a suspender. </li><li> Pipetar para solução de péptido quer nano LC / frascos ou placas de 96 poços adequados para nano / CLTrabalho MS / MS. </li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEGAN+analysis+of+metagenomic+data.">MEGAN analysis of metagenomic data.</a> Genome research. 17 (3), 377-3786 (2007).</li><li>Huson, D. H., Mitra, S., Ruscheweyh, H. -. J., Weber, N., Schuster, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analysis+of+environmental+sequences+using+MEGAN4.">Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4.</a> Genome research. 21 (9), 1552-1560 (2011).</li><li>Ea Ottesen, ., Marin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metatranscriptomic+analysis+of+autonomously+collected+and+preserved+marine+bacterioplankton.">Metatranscriptomic analysis of autonomously collected and preserved marine bacterioplankton.</a> The ISME journal. 5 (12), 1881-1895 (2011).</li><li>Feike, J., J&#252;rgens, K., Hollibaugh, J. T., Kr&#252;ger, S., Jost, G., Labrenz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+unbiased+metatranscriptomics+in+suboxic+waters+of+the+central+Baltic+Sea+using+a+new+in+situ+fixation+system.">Measuring unbiased metatranscriptomics in suboxic waters of the central Baltic Sea using a new in situ fixation system.</a> The ISME journal. 6 (2), 461-470 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Preservação das amostras é essencial para estudos metaproteomic e trabalho anterior demonstrou que uma solução de estabilização de ARN é um tampão de armazenamento útil para armazenar as células antes da extracção da proteína 28. Idealmente, as amostras iria ser preservado in situ para negar mudanças na expressão de proteínas durante o manuseamento 33,34. Na verdade, in situ têm sido desenvolvidas tecnologias de amostragem e de fixação, que permitem a recolha a...

Os microrganismos são onipresentes e desempenham um papel essencial nos ciclos biogeoquímicos da Terra 1. Atualmente, existem inúmeras abordagens moleculares disponíveis para a caracterização de estrutura da comunidade microbiana e função. O mais comum é a análise do gene 16S rRNA sequï¿½cias amplificado por PCR a partir de ADN ambiental 2 - 4. Uma desvantagem da análise do gene 16S rRNA é que ela só fornece informações sobre a identidade filogenética e estrutura da comunidade, com pouca informação sobre a função metabólica. Em contraste, abordagens como Metagenômica, metatranscriptomics e metaproteômica fornecer informações sobre a estrutura da comunidade e do metabolismo. Metagenomics, ou a análise do teor de gene de um conjunto de organismos, fornece informação sobre a estrutura e o potencial funcional da comunidade 5 - 8. Embora poderoso, este potencial funcional pode não corresponder ao metabólicaactividades dos organismos. Genótipo de um organismo é representado por seus genes, cada um dos quais pode ser transcrito em RNA e ainda traduzido para proteína, resultando num fenótipo. Assim, para auxiliar na compreensão da actividade funcional microbiano num ambiente, a análise pós-genómico deve ser executada 9. Metatranscriptomics, ou a análise de transcritos de ARN é útil porque revela que os genes são transcritos em qualquer dado ambiente. No entanto, os níveis de mRNA nem sempre coincidir com os seus níveis de proteína correspondentes devido à regulação de translação, meia-vida de ARN, e o facto de várias cópias de proteínas pode ser gerado para cada ARNm de 10. Por estas razões metaproteômica é agora reconhecida como uma importante ferramenta para microbiologia ambiental. Metaproteomic comum analisa usar uma abordagem proteômica shotgun onde o complemento total perto de proteínas em uma amostra complexa são purificados e analisados ​​simultaneamente, geralmente através de endigestão zymatic em peptídeos e análise em um espectrômetro de massa. Espectrometria de massa tandem subsequente (MS / MS) &quot;impressão digital peptídica&quot; é utilizado para determinar a sequência do péptido e proteína potencial de origem pelo banco de dados de proteínas procura (para uma revisão ver 11). Trabalho Proteômica já percorreu um longo caminho nos últimos 25 anos, graças ao aumento da disponibilidade de dados genômicos e do aumento da sensibilidade e precisão dos espectrômetros de massa permitindo high-throughput identificação e quantificação de proteínas 11,12. Uma vez que as proteínas são o produto final da expressão do gene, dados metaproteomic pode ajudar a determinar quais os organismos são activos em qualquer dado ambiente e proteínas que estão a expressar. Isto é vantajoso quando se tenta determinar como um determinado conjunto de variáveis ​​ambientais afetam o fenótipo de um organismo ou comunidade. Logo no início, metaproteomic estudos baseados em MS MS / no oceano foram utilizados para identificar proteínas específicas em alvolinhagens microbianas, com o primeiro estudo focando a luz conduzida da bomba de protões proteorhodopsin em bactérias marinhas SAR11 13. Mais recentemente, análises comparativas metaproteomic elucidaram padrões de expressão de proteínas diferenciais entre as comunidades complexas. Os exemplos incluem a identificação de mudanças temporais no metabolismo do litoral do Noroeste do Atlântico Oceano 14 ou a Península Antártica 5. Outros estudos descrevem variações nos padrões de expressão de proteínas através de escalas espaciais, por exemplo, ao longo de um transecto geográfica de um giro oceânico baixo em nutrientes para um sistema afloramento costeiro altamente produtiva 15. Para mais comentários de metaproteômica recomendamos Schneider et al. (2010) 9 e Williams et al. (2014) 16. Proteómica alvejados também tem sido empregada nos últimos anos para quantificar a expressão de vias metabólicas específicas no ambiente 17,18. There são três fases principais na análise metaproteomic. A primeira fase é a preparação da amostra, a qual inclui a recolha da amostra, a lise celular e a concentração de proteína. A recolha de amostras em microbiologia marinho frequentemente implica a filtração da água do mar através de um pré-filtro para remover as células eucarióticas maiores, partículas e bactérias associado a partículas, seguido de filtração para a captura de células microbianas de vida livre, normalmente com o uso de um cartucho de 0,22? M 19,20 unidade de filtro. Estes filtros são encaixada num cilindro de plástico e uma lise celular e protocolo de extracção de proteína que pode ser realizada dentro da unidade de filtro seria uma ferramenta valiosa. Uma vez que a biomassa é obtido, as células devem ser lisadas para permitir a extracção de proteína. Vários métodos podem ser empregues, incluindo a guanidina-HCl e sulfato de lise 21 de sódio dodecilo (SDS), métodos baseados em lise. Apesar de detergentes como SDS são muito eficientes em interromper as membranas e solubilizar muitos tipos de proteína, concentrations tão baixo quanto 0,1% pode interferir com a digestão de proteínas a jusante e análise MS 22. De grande preocupação é os efeitos negativos de SDS sobre a eficiência da digestão de tripsina, poder de resolução de cromatografia líquida de fase reversa e de supressão de iões ou acumulação no interior da fonte de iões 23. A segunda fase é de fraccionamento e de análise, onde as proteínas são sujeitas a digestão enzimática seguida por análise por LC MS / MS, o que resulta no padrão de fragmentação am / Z que pode ser usada para determinar a sequência de aminoácidos primária do péptido tríptico inicial. Vários métodos de digestão pode ser realizada de acordo com os tipos de detergentes utilizados, bem como o fluxo de trabalho de espectrometria de massa a jusante. No nosso protocolo, electroforese PAGE 1-D seguido pela remoção do SDS a partir do gel é utilizada de modo a remover qualquer contaminação detergente. A análise de proteínas que são difíceis de solubilizar, tais como proteínas de membrana, requer o uso de alta concentrações de SDS ou outros detergentes. Isto leva a problemas de compatibilidade com eletroforese SDS-gel. Se o objectivo de um estudo requer a solubilização destes difícil de solubilizar proteínas, o sistema de tubos-gel pode ser usada 22,24. O método do tubo-gel incorpora as proteínas no interior da matriz de gel, sem a utilização de electroforese. Posteriormente quaisquer detergentes utilizados para a solubilização são removidos antes da digestão de proteínas. A terceira fase é a análise bioinformática. Nesta fase, os dados de péptidos MS / MS são pesquisados ​​contra uma base de dados de sequências de nucleótidos traduzidas para determinar quais os péptidos e as proteínas estão presentes na amostra. A identificação de péptidos está dependente da base de dados é pesquisado contra. Dados metaproteomic marinhos são comumente procurou contra bancos de dados composta de genomas de referência, dados metagenomic tais como o conjunto de dados de amostragem Oceano Global 25, bem como de células amplificado genomas individuais de li incultaneages 26,27. Identificação de proteínas também pode ser aumentada pela inclusão de sequências metagenomic partir da mesma amostra de dados como o metaproteomic foi derivado 5. Aqui nós fornecemos um protocolo para a geração de péptidos adequados para a análise baseada em MS MS / a partir de biomassa microbiana recolhido por filtração e armazenados numa solução de estabilização de ARN. O protocolo aqui descrito permite a ADN e proteína a ser isolada a partir da mesma amostra, de modo que todos os passos que conduzem à proteína e as precipitações de DNA são idênticas. De uma perspectiva prática, a filtração é menos necessária uma vez que apenas um filtro é necessário tanto para a extracção do ADN e proteína. Gostaríamos também de reconhecer que este protocolo foi criado através da combinação, adaptação e alteração de dois protocolos previamente publicados. Os passos de lise celular são adaptadas de Saito et ai. (2011) 28 e a tripsina em gel digerir componente é adaptado de ShevcheNKO et ai. (2007) 29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterivex -GP 0.22 &#956;m filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td>Sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Stabilization Solution</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>Sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>77-86-1 or TB0196-500G</td>
			<td>Protein Extraction/ SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>15-21-3</td>
			<td>Protein Extraction/ SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10K Amicon Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337-4L</td>
			<td>Protein Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td>Protein Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPC Protein Precipitation reagent</td>
			<td>Epicenter</td>
			<td>mmP03750</td>
			<td>DNA Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td>DNA Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Protein Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33211</td>
			<td>Protein Quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0375EDU</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CABDH6044-4</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4HCO3</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>1066-33-7</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0507-500ML</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270733-4L</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tube 1.5ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL ROBO vial 9mm</td>
			<td>Candian Life Science</td>
			<td>VT009/C395SB</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP BM insert, No spring</td>
			<td>Candian Life Science</td>
			<td>4025P-631</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an aquatic microbial metaproteomics workflow: from cells to tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based analysis

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.

Como demonstração, foi realizado o protocolo em duas amostras de água do mar coletadas da superfície e camada de clorofila máxima do oceano costeiro no Norte do Canadá. Enquanto no mar, 6-7 L de água do mar foi passado através de um 3 um GF / D pré-filtro, em seguida, as células microbianas foram recolhidos para uma unidade de cartucho de filtro de 0,22 um, seguindo o protocolo de Walsh et ai. 20. As células foram imediatamente armazenadas numa solução de estabilização de ARN, até pro...

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An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

Um Aquatic Microbial metaproteômica fluxo de trabalho: a partir de células para Tryptic Peptides adequado para análise baseada em espectrometria de massa em tandem

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and ...

an-aquatic-microbial-metaproteomics-workflow-from-cells-to-tryptic

Research

JoVE Journal

Environment

8.7K visualizações.  Concordia University. This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

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Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study provides a protocol for the passive sampler preparation, calibration, extraction method and instrumental analysis. Sampling rates (RS) and passive sampler-water partition coefficients (KPW) were calculated for silicone rubber, polar organic chemical integrative sampler POCIS-A, POCIS-B, SDB-RPS and C18 disk. The uptake of the selected compounds depended on their physicochemical properties, i.e., silicone rubber showed a better uptake for more hydrophobic compounds (log octanol-water partition coefficient (KOW) &#62; 5.3), whereas POCIS-A, POCIS-B and SDB-RPS disk were more suitable for hydrophilic compounds (log KOW &#60; 0.70).

A protocol about the characterization and application of five different passive sampling devices is presented.

Caracterização e aplicação de amostradores passivos de monitorização de pesticidas em água

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Ambiente

Alternative Method of Removing Otoliths from Sturgeon

Extracting the otoliths (ear bones) from fish that have very thick skulls can be difficult and very time consuming. The common practice of making a transverse vertical incision on the top of the skull with a hand or electrical saw may damage the otolith if not performed correctly. Sturgeons (Acipenseridae) are one family in particular that have a very large and thick skull. A new laboratory method entering the brain cavity from the ventral side of the fish to expose the otoliths was easier than other otolith extraction methods found in the literature. Methods reviewed in the literature are designed for the field and are more efficient at processing large quantities of fish quickly. However, this new technique was designed to be more suited for a laboratory setting when time is not pressing and successful extraction from each specimen is critical. The success of finding and removing otoliths using this technique is very high and does not compromise the structure in any manner. This alternative technique is applicable to other similar fish species for extracting the otoliths.

The goal of the protocol is to show an effective method to extract the otoliths from sturgeon carcasses.

Método alternativo de remoção de otólitos de Sturgeon

Extracting the otoliths (ear bones) from fish that have very thick skulls can be difficult and very time consuming. The common practice of making a ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about the overall structure of terrestrial microbial communities. PLFA profiling has been extensively used in a range of ecosystems as a biological index of overall soil quality, and as a quantitative indicator of soil response to land management and other environmental stressors.
The standard method presented here outlines four key steps: 1. lipid extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, 2. fractionation using solid phase extraction columns to isolate phospholipids from other extracted lipids, 3. methanolysis of phospholipids to produce fatty acid methyl esters (FAMEs), and 4. FAME analysis by capillary gas chromatography using a flame ionization detector (GC-FID). Two standards are used, including 1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC(19:0/19:0)) to assess the overall recovery of the extraction method, and methyl decanoate (MeC10:0) as an internal standard (ISTD) for the GC analysis.

Phospholipid fatty acids provide information about the structure of soil microbial communities. We present methods for extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, fractionation of extracted lipids using solid phase extraction columns, and methanolysis to produce fatty acid methyl esters, which are analyzed by capillary gas chromatography.

Extração e Análise de Microbial Phospholipid Fatty Acids em solos

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Basic Research in Plasma Medicine - A Throughput Approach from Liquids to Cells

In plasma medicine, ionized gases with temperatures close to that of vertebrate systems are applied to cells and tissues. Cold plasmas generate reactive species known to redox regulate biological processes in health and disease. Pre-clinical and clinical evidence points to beneficial effects of plasma treatment in the healing of chronic ulcer of the skin. Other emerging topics, such as plasma cancer treatment, are receiving increasing attention. Plasma medical research requires interdisciplinary expertise in physics, chemistry, and biomedicine. One goal of plasma research is to characterize plasma-treated cells in a variety of specific applications. This includes, for example, cell count and viability, cellular oxidation, mitochondrial activity, cytotoxicity and mode of cell death, cell cycle analysis, cell surface marker expression, and cytokine release. This study describes the essential equipment and workflows required for such research in plasma biomedicine. It describes the proper operation of an atmospheric pressure argon plasma jet, specifically monitoring its basic emission spectra and feed gas settings to modulate reactive species output. Using a high-precision xyz-table and computer software, the jet is hovered in millisecond-precision over the cavities of 96-well plates in micrometer-precision for maximal reproducibility. Downstream assays for liquid analysis of redox-active molecules are shown, and target cells are plasma-treated. Specifically, melanoma cells are analyzed in an efficient sequence of different consecutive assays but using the same cells: measurement of metabolic activity, total cell area, and surface marker expression of calreticulin, a molecule important for the immunogenic cell death of cancer cells. These assays retrieve content-rich biological information about plasma effects from a single plate. Altogether, this study describes the essential steps and protocols for plasma medical research.

A high-throughput cold physical plasma treatment protocol of liquids and cells is shown. It involves setting up different feed gas compositions for plasma ignition, measuring the plasma&#39;s emission spectra, and the subsequent analysis of liquids and cellular activity after plasma treatment.

Pesquisa básica em Plasma medicina - uma abordagem de taxa de transferência de líquidos para células

In plasma medicine, ionized gases with temperatures close to that of vertebrate systems are applied to cells and tissues. Cold plasmas generate reactive ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond quickly to environmental changes and can be thus used as indicators of water quality. Currently, biofilm assessment is mostly based on integrative and functional endpoints, such as photosynthetic or respiratory activity, which do not provide information on the biofilm community structure. Flow cytometry and computational visualization offer an alternative, sensitive, and easy-to-use method for assessment of the community composition, particularly of the photoautotrophic part of freshwater biofilms. It requires only basic sample preparation, after which the entire sample is run through the flow cytometer. The single-cell optical and fluorescent information is used for computational visualization and biological interpretation. Its main advantages over other methods are the speed of analysis and the high-information-content nature. Flow cytometry provides information on several cellular and biofilm traits in a single measurement: particle size, density, pigment content, abiotic content in the biofilm, and coarse taxonomic information. However, it does not provide information on biofilm composition on the species level. We see high potential in the use of the method for environmental monitoring of aquatic ecosystems and as an initial biofilm evaluation step that informs downstream detailed investigations by complementary and more detailed methods.

Flow cytometry in combination with visual clustering offers an easy-to-use and fast method for studying aquatic biofilms. It can be used for biofilm characterization, detection of changes in biofilm community structure, and detection of abiotic particles embedded in the biofilm.

Caracterização de biofilmes aquáticos com citometria de fluxo

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The purpose of this manuscript is to provide detail on how to rapidly sample soil, rhizosphere, and endosphere of replicated field trials and analyze changes that may occur in the microbial communities due to sample type, treatment, and plant genotype. The experiment used to demonstrate these methods consists of replicated field plots containing two, pure, warm-season grasses (Panicum virgatum and Andropogon gerardii) and a low-diversity grass mixture (A. gerardii, Sorghastrum nutans, and Bouteloua curtipendula). Briefly, plants are excavated, a variety of roots are cut and placed in phosphate buffer, and then shaken to collect the rhizosphere. Roots are brought to the laboratory on ice and surface sterilized with bleach and ethanol (EtOH). The rhizosphere is filtered and concentrated by centrifugation. Excavated soil from around the root ball is placed into plastic bags and brought to the lab where a small amount of soil is taken for DNA extractions. DNA is extracted from roots, soil, and rhizosphere and then amplified with primers for the V4 region of the 16S rRNA gene. Amplicons are sequenced, then analyzed with open access bioinformatics tools. These methods allow researchers to test how the microbial community diversity and composition varies due to sample type, treatment, and plant genotype. Using these methods along with statistical models, the representative results demonstrate there are significant differences in microbial communities of roots, rhizosphere, and soil. Methods presented here provide a complete set of steps for how to collect field samples, isolate, extract, quantify, amplify, and sequence DNA, and analyze microbial community diversity and composition in replicated field trials.

Excavation of plant roots from the field as well as processing of samples into endosphere, rhizosphere, and soil are described in detail, including DNA extraction and data analysis methods. This paper is designed to enable other laboratories to use these techniques for the study of soil, endosphere, and rhizosphere microbiomes.

Isolamento e análise de comunidades microbianas na rizosfera, solo e raízes em experiências de grama perene

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and toxicological studies. Using automated digital tracking platforms, recent efforts in neuropharmacology are leveraging larval fish locomotor behaviors to identify potential therapeutic targets for novel small molecules. Similar to these efforts, research in the environmental sciences and comparative pharmacology and toxicology is examining various behaviors of fish models as diagnostic tools in tiered evaluation of contaminants and real-time monitoring of surface waters for contaminant threats. Whereas the zebrafish is a popular larval fish model in the biomedical sciences, the fathead minnow is a common larval fish model in ecotoxicology. Unfortunately, fathead minnow larvae have received considerably less attention in behavioral studies. Here, we develop and demonstrate a behavioral profile protocol using caffeine as a model neurostimulant. Though photomotor responses of fathead minnows were occasionally affected by caffeine, zebrafish&#160;were markedly more sensitive for photomotor and locomotor endpoints, which responded at environmentally relevant levels. Future studies are needed to understand comparative behavioral sensitivity differences among fish with age and time of day, and to determine whether similar behavioral effects would occur in nature and be indicative of adverse outcomes at the individual or population levels of biological organization.

Here, we present a protocol to examine larval zebrafish and fathead minnow locomotor activities and photomotor responses (PMR) using an automated tracking software. When incorporated in common toxicology bioassays, analyses of these behaviors provide a diagnostic tool to examine chemical bioactivity. This protocol is described using caffeine, a model neurostimulant.

Protocolo experimental pela análise de perfis de resposta comportamental em peixes Larval: aplicação para a Neuro-estimulantes cafeína

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

Identifying Per- and Polyfluorinated Chemical Species with a Combined Targeted and Non-Targeted-Screening High-Resolution Mass Spectrometry Workflow

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the local to federal levels. The continuing evolution of PFAS chemistries presents a challenge to the environmental monitoring, where ongoing development of targeted methods necessarily lags the discovery of new chemical compounds. There is a need, therefore, to have forward-looking methodologies that can detect emerging and unexpected compounds, monitor these species over time, and resolve details of their chemical structure to enable future work in human health. To this end, non-targeted analysis by high-resolution mass spectrometry offers a broad base detection approach that can be combined with almost any sample preparation scheme and provides significant capabilities for compound identification after detection. Herein, we describe a solid-phase extraction (SPE) based sample concentration method tuned for shorter chain and more hydrophilic PFAS chemistries, such as per fluorinated ether acids and sulfonates, and describe analysis of samples prepared in this fashion in both targeted and non-targeted modes. Targeted methods provide superior quantification when reference standards are available but are intrinsically limited to expected compounds when performing analysis. In contrast, a non-targeted approach can identify the presence of unexpected compounds and provide some information about their chemical structure. Information about chemical features can be used to correlate compounds across sample locations and track abundance and occurrence over time.

Here, we present a protocol for the sequential targeted quantification and non-targeted analysis of fluorinated compounds in water by mass spectrometry. This methodology provides quantitative levels of known fluorochemical compounds and identifies unknown chemicals in related samples with semi-quantitative estimates of their abundance.

Identificação por- e espécies químicas perfluorados com um fluxo de trabalho combinada alvo e não alvo-triagem de alta resolução de espectrometria de massa

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the ...

Fluorescently Labeled Bacteria as a Tracer to Reveal Novel Pathways of Organic Carbon Flow in Aquatic Ecosystems

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial communities has many limitations, and determining a predator, prey, and predatory rates is often difficult. Presented here is an optimized method based on the addition of fluorescently labelled prey as a tracer, which allows for reliable quantitation of the grazing rates in aquatic predatory eukaryotes and estimation of nutrient transfer to higher trophic levels.

Presented here is a protocol for a single-cell, epifluorescence microscopy-based technique to quantify grazing rates in aquatic predatory eukaryotes with high precision and taxonomic resolution.

Bactérias rotuladas fluorescently como um Tracer para revelar novas vias de fluxo de carbono orgânico em ecossistemas aquáticos

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial ...

A Guide to Concentration Alternating Frequency Response Analysis of Fuel Cells

An experimental setup capable of generating a periodic concentration input perturbation of oxygen was used to perform concentration-alternating frequency response analysis (cFRA) on proton-exchange membrane (PEM) fuel cells. During cFRA experiments, the modulated concentration feed was sent to the cathode of the cell at different frequencies. The electric response, which can be cell potential or current depending on the control applied on the cell, was registered in order to formulate a frequency response transfer function. Unlike traditional electrochemical impedance spectroscopy (EIS), the novel cFRA methodology makes it possible to separate the contribution of different mass transport phenomena from the kinetic charge transfer processes in the frequency response spectra of the cell. Moreover, cFRA is able to differentiate between varying humidification states of the cathode. In this protocol, the focus is on the detailed description of the procedure to perform cFRA experiments. The most critical steps of the measurements and future improvements to the technique are discussed.

We present a protocol for concentration alternating frequency response analysis of fuel cells, a promising new method of studying fuel cell dynamics.

Um guia para a análise de resposta de frequência alternada de concentração das células de combustível

An experimental setup capable of generating a periodic concentration input perturbation of oxygen was used to perform concentration-alternating frequency ...