Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Greg Martin (Cornell University) e seu grupo para fornecer a tensão DC3000, sementes de tomate, e aconselhamento. Eles também gostariam de agradecer ao Dr. Zhonglin Mou para obter ajuda com o protocolo DAB e da Divisão de Proteômica na UF Centro Interdisciplinar de Pesquisa de Biotecnologia para a assistência no desenvolvimento do método. O protocolo para a extracção de proteína foi modificado a partir do Hurkman e Tanaka 16. O protocolo em cysTMT rotulagem, os passos 4 a 6 foi adaptada de acordo com o Thermo Pierce inicial Fisher Scientific produto manual 17. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation (MCB 0818051 para S Chen).

1. Produção de mudas e bactérias Preparação <ol><li> As plântulas são germinadas em Metromix mistura de solo 500 (Companies IBW) numa câmara de crescimento (160 umol fotões m -2 s -1 com um fotoperíodo de 8 horas de luz a 22 ° C e 16 horas escuro a 20 ° C durante 1 semana. Relativa humidade foi ajustada para 70%. As plântulas foram regadas com água da torneira, conforme necessário para manter o solo de secarem. </li><li> Duas mudas de tamanho semelhante são então transplantadas para vasos de 4 &quot;de diâmetro contendo o solo 500 Metromix e cultivadas durante mais 3 semanas nas mesmas condições que 1,1. </li><li> Pseudomonas syringae (PST) é inicialmente T-listado na Kings B Médio (KBM) placas (por litro: 20 g peptona proteose, 0,1975 g MgSO4, Glicerol 1%, 1,5 g de K 2 HPO 4, 18 g Ágar) e crescidas durante dois dias a 28 ° C. Uma única colônia é coletado, misturado em 300 l Reis líquido B Médio (20 g Proteose peptona, 0,1975 g MgSO 4 </sub&gt;, glicerol a 10 mL, 10 mL de 100x 2 HPO 4 K de stock (1,5 g de K 2 HPO 4 em 10 mL de H2O), e espalhada sobre uma placa de Reis B Médio. Este é cultivada durante a noite a 28 ° C. </li><li> O inoculo de bactérias é preparado por raspagem das bactérias cultivadas a partir da placa KBM em 20 mL de H2O Uma DO600 de 0,03 (~ 10 6 ufc / ml) é preparado em 1 L de tampão de inoculação (10 mM de MgCl2 + 400 uL Silwett-70). Tampão de inoculação menos bactérias foi preparado para a solução de controlo. </li></ol> 2. A inoculação de Tomate com Pst e H 2 O 2 histoquímica Stain <ol><li> Quatro semanas de idade plantas foram inoculadas por meio de imersão na solução de inoculação acima durante 30 segundos. Sacos de plástico foram colocados sobre as plantas imediatamente após a inoculação. </li><li> 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidina (DAB) a mancha 11 foi preparado (1 mg / ml DAB em H2O, pH 3,8 (HCl)) três days antes de usar para atingir a solubilização completa. A solução foi sacudido para misturar à temperatura ambiente. </li><li> Vinte e quatro horas após o tratamento, a folha totalmente expandida foi removido, colocado em DAB mancha lado epidérmico acima, e sob vácuo infiltrada durante 15 min. As folhas foram então colocadas no escuro à temperatura ambiente durante a noite para coloração. </li><li> As folhas foram fervidas em etanol a 95% durante 10 min e, em seguida mantidos em etanol a 75%. </li></ol> 3. Extração de Proteínas <ol><li> Após a colheita, as folhas do tomate foram moídos em pó fino com nitrogênio líquido utilizando almofariz e pilão. </li><li> Para 0,5 g de tecido, adicionar 1,25 mL de Tris pH 8,8 tamponada de fenol e 1,25 mL / 0,5 g de tampão de extracção (0,1 M Tris-HCl pH 8,8, EDTA 10 mM, 0,9 M de sacarose), em seguida continuam de moagem para um min mais alguns num coifa. </li><li> Transferir o extracto a Oakridge tubo de centrifugação (Thermo Fisher Scientific Companhia Nalgene) e agitar durante 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar a 5.000 xge 15 ° C durante 10 min. Transferir a fase superior fenol, para um novo tubo limpo. </li><li> Back-extrair a fase aquosa com um volume igual de tampão extraído com fenol; agitar num agitador durante 30 min. Centrifugar e transferir o extracto para um tubo Falcon de novo. </li><li> Repita o passo anterior mais uma vez e transferir o extrato para novo tubo Oakridge. </li><li> Precipitar fenol proteínas extraídas pela adição de 5 volumes de acetato de amónio 0,1 M em metanol a 100% (armazenada a -20 ° C). Vortex e incubar à temperatura de -20 ° C durante a noite. </li><li> Recolher o pelete de proteína por centrifugação a 20.000 xg, 4 ° C durante 20 min. </li><li> Lavar o pellet de 2 vezes com o acetato de frio de amónio 0,1 M em metanol e 2 vezes com 80% de acetona fria. Adicionar 1,5 mL de etanol frio a 70% para sedimentar e suspender. Transferir para um tubo de microcentrífuga de 2 mL (EUA Scientific) e centrifugar a 14.000 rpm, 4 ° C durante 20 min. Remover o etanol. </li><li> Seca-se a pelete brevemente num concentrador Speedvac e dissolver em uma extr proteínatampão de acção, por exemplo, Proteína ReadyPrep Reagente extraction kit 3 (8 M de ureia, CHAPS 4%, 40 mM de Tris-base, 2 M Tioureia) (Bio-Rad). Centrifugar a 14.000 rpm e 20 ° C durante 30 min para formar uma pelota. Recolher o sobrenadante. </li><li> Medir a concentração de proteína usando um ensaio de proteína CB-X de acordo com o manual do fabricante (Geno Technology). </li></ol> 4. Preparação de Amostras e Rotulagem Peptide com cysTMTs <ol><li> Preparar amostra de proteína a uma concentração de 2-5 ug / uL. Aqui nós usamos 100 mg de proteína para cada marca de massa, 20 ul-50 amostras microlitro. Para esta experiência todos os 6 etiquetas foram utilizados. </li><li> Adicionar volume igual de tampão de alquilação (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 200 mM de iodoacetamida) para a amostra de proteína para bloquear o grupo tiol livre. Tampão deve ser preparado fresco. A alquilação é realizado a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Precipitar a proteína por adição de 1 ml de acetona a 80% frio a -20 ° C durante a noite. Pelete de proteína do por centrifugação a 14.000rpm, 4 ° C durante 20 min. Lavar o pellet 3 vezes com acetona a 80% vórtice de cada vez. Remover o sobrenadante e deixar secar ao ar, enquanto seca sobre gelo. </li><li> Ressuspender o sedimento em 50 uL de tampão de lise (6 M de ureia, 50 mM de base Tris, 1 mM de EDTA). 0,5 ul de 100 mM de Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) é então adicionado para reduzir as pontes dissulfeto por incubação durante uma hora à temperatura ambiente. </li><li> Preparar etiquetas por adição de 20 uL de acetonitrilo para os tubos de reagentes para solubilizar as etiquetas. Vortex e girar para o fundo. </li><li> Lavar a TCEP extra usando uma centrífuga Microcon 3KD dispositivo de filtro (Millipore). Adicionar 50 uL de amostra para Microcon coluna 3KD, e 50 uL de tampão de lise para a coluna. Centrifugar durante 15 min a 10.000 xg e 4 ° C. Repetir este passo para um total de três vezes. Remover coluna e inverter para um tubo limpo. Centrifugar durante 5 min a 1000 xg e 4 ° C. </li><li> Verifique o pH. Se necessário, ajustar o pH a 7,0-8,0 com 1 M de HCl. </li><li> Adicionar 5 uL da cysTMO reagente de T para cada amostra (O kit de reagentes cysTMT fornece 20 uL etiquetas para até 500 ug de proteína. Este método utiliza 100 ug de proteína, por conseguinte, usamos um quinto da marca.). Permitir que a reacção prosseguir durante 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> As amostras foram combinadas com Tampão de amostra Laemmli (Bio-Rad) em uma razão de 1:1. </li></ol> 5. A remoção de não-fracionamento da amostra reagiu Tag <ol><li> As amostras foram fervidas durante 5 min e separados num gel de poliacrilamida pré-fundido 12% (Bio-Rad). O gel foi lavado três vezes em intervalos de 5 minutos com filtrada H2O e coradas com Azul de Coomassie (Bio-Rad) durante 1 hora. O gel foi corado de-dia para o outro com H2O </li><li> Doze frações foram coletadas de cada pista gel. As fracções foram determinados por concentrações banda de proteína. As fracções foram cortadas em pedaços de 1 mm e recolhido num tubo de 1,5 ml. </li><li> Pedaços de gel foram coradas utilizando de-acetonitrilo 50% e 0,1 M de bicarbonato de amónio em H 2 </sub&gt; O. Este passo deve ser repetido até que a cor azul é removido a partir de pedaços de gel (~ de 3-4 vezes, 15 min de cada vez). </li><li> Peças de-gel corado foram secos usando acetonitrilo a 100% (cobrir pedaços de gel) durante 15 min, o sobrenadante removido, e os pedaços secos usando um Speedvac. </li><li> Dissolve-se tripsina (Promega) a 1:10 (tripsina: proteína) ratio no mesmo volume (como amostras combinadas rotulada) de bicarbonato de amónio 25 mM. Por exemplo, 600 ug de proteína da amostra com um volume de 500 uL precisa 60 ug de tripsina dissolvido em 500 uL de 25 mM de bicarbonato de amónio. </li><li> Adicionar a solução de tripsina para os pedaços de gel e definir em gelo para re-hidratar. Se as peças não estão cobertas adicionar 50 mM de tampão de bicarbonato de amónio. Depois de re-hidratação, incubar a 37 ° C durante 12-16 hr. </li><li> Remover o extracto de proteína de líquido a partir das amostras incubadas. </li><li> Parar a reacção e remover qualquer digerir a proteína restante cobrindo pedaços de gel com 5% de ácido fórmico, acetonitrilo 50% .. Agitar pedaços de gel durante 20 min a sala de TEmperature. Transferir o sobrenadante para os tubos de amostra extraída de proteína a partir de 5,7. Repita o procedimento de extração duas vezes. Seca-se os péptidos extraídos utilizando o Speedvac. </li></ol> 6. Enriquecimento amostra de cysTMT rotuladas de peptídeos <ol><li> Adicionar um gradiente de anti-TMT resina para tubos de 0,5 ml para uma lama de 50%. (Gradiente foi determinada a partir da concentração banda em gel de fraccionamento. Se uma recolha de fracções consiste de uma banda escura, mais resina é necessária. As fracções com bandas mais fracas requerem menos resina como há menos proteína.) </li><li> A resina é então lavada três vezes com um volume de coluna de Tris-1x solução salina tamponada com (TBS) (25 mM de Tris, 0,15 M NaCl, pH 7,2) (Thermo Scientific Pierce Research Products de proteína). </li><li> Adicionar 200 uL 1xTBS para cada amostra. As amostras são então adicionados aos anti-TMT resina (Thermo Scientific Pierce Research Products de proteína) e agitado à temperatura ambiente durante 2 hr seguido por balançar durante a noite a 4 ° C. </li><li> Adicionar amostra a coluna (ARMO Scientific Protein Pierce Produtos de Pesquisa). </li><li> Lava-se cada coluna três vezes com TBS 1x 200 uL. Esta é seguida com lavagem três vezes com CHAPS 0,05% (dissolvido em 1x TBS). </li><li> A coluna é então lavada três vezes com 4 M ureia em 1x TBS. Duzentos microlitros de H2O é então usada para lavar a coluna três vezes. </li><li> Cada amostra é eluída três vezes com 200 uL de tampão de eluição de 50% (acetonitrilo a 50%, TFA a 0,4%). </li><li> As amostras são então secas num concentrador de vácuo. </li></ol> 7. Por espectrometria de massas <ol><li> Ressuspender as amostras em 12 uL de acetonitrilo 3% com 0,1% de ácido fórmico e injectar 5 uL directamente sobre uma coluna de pressão elevada Eksigent nanoLC-1D cromatografia líquida (AB SCIEX, EUA). </li><li> Os péptidos serão separados sobre uma coluna C18 Proteopep ID iM II 75 x 20 cm (Novo Objectivo, EUA) utilizando um gradiente de 4-60% (A: acetonitrilo 3%, 0,1% ácido fórmico; B: acetonitrilo 97%, fórmico 0,1% ácido)em 3 mL / min ao longo de 60 min. </li><li> Um Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL espectrómetro de massa foi utilizado para detectar péptidos utilizando um topo 2 x experimento 3 consistindo de uma única fase MS seguido por aquisição de 3 MS / MS espectros com fragmentação dissociação maior energia C-armadilha (HCD) seguido por 3 MS / MS com dissociação induzida por colisão (CID) para identificação de proteínas. Parâmetros neste modo foram: largura Isolamento: 3,0 m / z; energia de colisão: 50% (10% em dois passos). Peptídeos Apenas duplamente e triplamente carregadas foram selecionados para a fragmentação. Parâmetros de exclusão dinâmicos foram definido como: Repita count = 1; Duração Repeat = 60; tamanho Exclusão list = 500; Exclusão duração = 28. Os valores alvo são as seguintes: MS = 5 e 5; MS / MS (HCD) = 1 e 5. Tempo de transferência de íon foram definidos para 500 para FTMS e 300 para MS / MS (HCD). Dois microscans foram necessários para espectros HCD. </li></ol> 8. Buscando banco de dados e quantificação <ol><li> Os dados adquiridos CID e HCD eram umaanalisados: usando Thermo Scientific software Discoverer Proteome 1,2 (Thermo Scientific Pierce Produtos pesquisa de proteína) através de um fluxo de trabalho ramificada que implementou um Reporter Ion Quantizer (20 ppm de tolerância de massa de íons fragmento) para quantificar a proporção. Um segmento separado processou a MS 2 espectros através da Spectrum Selector, Normalizer Spectrum, e nós Garoupa Spectrum. </li><li> Os dados foram então comparados com o motor de busca Sequest. A 20 tolerância massa ppm foi utilizado. Modificações estáticas foram definidas para o reagente cysTMT (304,18 Da) e alterações dinâmicas incluiu fosforilação e oxidação da metionina (15,99 Da). Um banco de dados personalizado para Solanum lycopersicum foi composta usando RNA de dados (com cerca de 350.000 entradas da Universidade de Harvard) 13 foi utilizado em ambos os casos. </li></ol> 9. Os resultados representativos Uma imagem representativa de uma folha da planta de controlo de tomate e uma folha Pseudomonas inoculado émostrada na Figura 1. Uma diferença entre o controlo tratado e folhas de Pseudomonas tratados é observada. Depois de as folhas são removidos e corados usando DAB, o processo de coloração-permite a mancha histoquímica para mostrar sinais de ROS no tecido foliar (Figura 2). Figura 2A é representativa de uma folha de controle sem coloração. Figura 2B é representativa de uma folha tratada com Pseudomonas e positiva para a coloração de H2O 2 produção. Um exemplo de saída de dados Proteome Discover de uma proteína diferencialmente redox regulada é mostrado na Figura 3. Esta proteína é um ferredoxina-1 proteína conhecida redox regulamentado 14 e tem sido demonstrado que desempenham um papel na defesa contra Pseudomonas syringae pv tomate 15. Intensidade de pico entre o controlo e as amostras inoculadas é usado para obter quantificação relativa, que mostrou alterações significativas na ferredoxem-1 regulação redox (p &lt;0,05). Picos de alta intensidade sugerem que esta proteína é oxidado em resposta ao tratamento do patógeno. A Figura 4 é um exemplo de saída de dados Proteome Discover de uma proteína que tem regulação redox de uma proteína semelhante entre uma amostra de controlo e inoculada. Os picos de intensidade semelhante sugerem a presença de ligações dissulfureto não regulada por uma alteração do tratamento. O método vai revolucionar a forma como os cientistas a detectar redox cisteínas responsivas e dissulfetos 10. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig1.jpg" /> Figura 1. Uma imagem representativa de tomate inoculadas folhas com a solução de controlo (A) e Pseudomonas (B). &lt;classe span = &quot;pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig2.jpg" /> Figura 2. Uma imagem representativa de DAB coloração de tomate inoculadas folhas com a solução de controlo (A) e Pseudomonas (B). As folhas foram coradas utilizando 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidina. A clorofila foi removido a partir de folhas por ebulição em etanol a 95%. A coloração escura indica a presença de H2O 2. Apenas deixa inoculado com cultura de bactérias apresentaram coloração escura. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig3.jpg" /> Figura 3. Um exemplo de Proteome saída de dados de Discover ferredoxina-1, diferencialmente redox proteína regulada 14. Intensidade do pico acima de cada pico é usado para a quantificação absoluta. Intensidade de pico entre o controlo e as amostras inoculadas é usadopara realizar a quantificação relativa. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig4.jpg" /> Figura 4. Um exemplo de saída de dados Proteome Discover de uma proteína que tem intensidade de pico semelhante entre uma amostra de controlo e inoculada. Os picos de intensidade semelhante sugerem a presença de ligações dissulfureto não regulada por uma alteração do tratamento.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Este protocolo fornece informações sobre a execução de coloração DAB, bem como cysTMT quantificação de cisteína marcado redox. Estes procedimentos são benéficos em examinar a produção de ROS, bem como o efeito sobre a regulação da proteína quando Solanum lycopersicum é inoculado com Pseudomonas syringae. Os métodos apresentados neste protocolo fornecer uma forma de examinar ROS em amostras de folhas inteiras de uma maneira que faz com que a menor quantidade de danos ao tecido foliar. O procedimento de etiquetagem fornece uma maneira para examinar potencialmente redox proteínas reguladas por utilizando um método de marcação de cisteína. Isto é benéfico quando se examina uma fase precoce da resposta ao stress. Métodos tais como isótopo-codificado marcador de afinidade (ICAT) e cysTMT pode ser usado para examinar o potencial redox proteínas reguladas em amostras biológicas. ICAT permite rotulagem e comparação de duas amostras de 12. Ambos os métodos rotular cisteínas livres e pode ser usado para a proteína Quantification 10,12. No entanto, o método cysTMT permite uma diminuição da variação experimental, bem como a multiplexação 10. O número de marcas disponíveis permite que os pesquisadores de incluir repetições ou várias amostras em seu projeto experimental. Tendo em amostras mais oferece o potencial para um maior número de proteínas identificadas. Uma grande desvantagem da técnica de cysTMT é que compromete a qualidade global da identificação de proteínas por causa das etapas de enriquecimento selectivo para cysTMT rotulados-péptidos (6,5-6,6). O número de péptidos para a identificação de proteínas depende em grande medida o número de resíduos de cisteína na sequência de proteína. Este problema pode ser superado através da apresentação de parte da amostra antes tríptica de enriquecimento para a identificação de espectrometria de massa de proteína. Devido à natureza do desenho experimental, bem como o mecanismo de etiquetagem de que o método cysTMT utiliza, certos passos são críticos. Durante a execução de proteína precipitation e pellet lavagens (3,9) é importante para manter as amostras arrefecida em gelo para reduzir a degradação de proteínas. Durante a etiquetagem cysTMT, a remoção do reagente redutor (4,6) é importante porque as amostras podem ser submetidos a rotulagem inversa. Rotulagem inversa é possível se a redução do reagente permanece na amostra. Se as amostras forem reduzidos após rotulagem, a etiqueta cysTMT pode ser removido. Uma vez que as etiquetas são adicionados às amostras, o nível de pH deve ser verificada (4,7), a fim de ter eficiência de marcação óptima. Além disso, a análise dos dados é dependente do que é exigido do pesquisador eo objetivo final na utilização do protocolo. Também é dependente do software a ser utilizado como cada software tem algoritmos diferentes. Este experimento utiliza um patógeno como eliciador para aumento da produção de espécies reativas oxidantes em tomate, no entanto, outros redox respostas regulamentados pode ser medido em conformidade. Este projeto experimental é adaptável a outras plantas e sistemas animais. </p&gt;

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Metromix 500 </td><td> Empresas IBW </td><td> TX-500 </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;-diaminobenzidina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8001 </td></tr><tr><td> ReadyPrep Reagente kit Sequential Extraction 3 </td><td> Bio-Rad </td><td> 163-2104 </td></tr><tr><td> CB-X ensaio de proteína </td><td> Geno Tecnologia </td><td> 786-12x </td></tr><tr><td> cysTMT reagentes </td><td> Thermo Scientific Research Pierce produtos de proteína </td><td> 90071 </td></tr><tr><td> Tampão de amostra Laemmli </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> Bio-Safe Comassie (G-250 mancha) </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> Microcon coluna 3KD </td><td> Millipore </td><td> 42403 </td></tr><tr><td> Imobilizado resina Anti-TMT </td><td> Thermo Scientific Research Pierce produtos de proteína </td><td> 90076 </td></tr><tr><td> Coluna centrífuga </td><td> Thermo Scientific Research Pierce produtos de proteína </td><td> 89896 </td></tr><tr><td> Proteopep coluna II C18 </td><td> Objetivo Novo </td><td> PFC7515-PP2-10 </td></tr><tr><td> NanoLC-1D HPLC </td><td> AB Sciex </td><td> 90389 </td></tr><tr><td> LTQ Orbitrap XL </td><td> Thermo Scientific </td><td> 0020137580 </td></tr><tr><td> Speedvac </td><td> Labconco </td><td> 7812013 </td></tr><tr><td> Proteome Discoverer 1,2 software </td><td> Thermo Scientific Research Pierce produtos de proteína </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Promega </td><td> V5111 </td></tr><tr><td> Oakridge tubo de centrífuga </td><td> Thermo Scientific NalgeEmpresa ne </td><td> 3139-0050 </td></tr><tr><td> Tubo de microcentrífuga (2 ml) </td><td> EUA Científico </td><td> 1620-2700 </td></tr><tr><td> 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel </td><td> Bio-Rad </td><td> 456-1043 </td></tr><tr><td> Top of Form &gt; Bio-Safe Coomassie StainBottom do formulário </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> TMT kit enriquecimento </td><td> Thermo Scientific Research Pierce produtos de proteína </td><td> 90077 </td></tr></tbody></table>

profiling thiol redox proteome using isotope tagging mass spectrometry

Pseudomonas syringae pv DC3000 estirpe. Tomate não só provoca a doença de pinta bacteriana em Solanum lycopersicum, mas também sobre as espécies de Brassica, bem como em Arabidopsis thaliana, um 1,2 planta geneticamente tratável hospedeiro. O acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ROS) em cotilédones inoculados com DC3000 indica um papel de ROS na morte celular modulando necrótico durante a doença mancha bacteriana do tomateiro, 3. O peróxido de hidrogénio, um componente de ROS, é produzida após a inoculação de plantas de tomate com Pseudomonas 3. O peróxido de hidrogénio pode ser detectada usando um histoquímica mancha 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidina (DAB) 4. Coloração DAB reage com o peróxido de hidrogénio para produzir uma mancha marrom no 4 tecido foliar. ROS tem um papel regulador do ambiente celular redox, o que pode alterar o estado redox de certas proteínas 5. A cisteína é um aminoácido importante sensível àalterações redox. Sob oxidação suave, a oxidação reversível de grupos de cisteína sulfidrilo serve como sensores de redox e transdutores de sinal que regulam uma variedade de processos fisiológicos 6,7. Massa em tandem tag (TMT) reagentes permitir a identificação simultânea e multiplexada quantificação de proteínas em amostras diferentes, usando espectrometria de massa 8,9. As cisteína-reactivas TMT (cysTMT) reagentes permitir rotulagem selectiva e quantificação relativa de cisteína contendo péptidos de até seis amostras biológicas. Cada etiqueta cysTMT isobárica tem o mesmo pai massa nominal e é composto de um grupo sulfidrilo reactivo, um braço espaçador MS-neutro e um repórter MS / MS 10. Após a marcação, as amostras foram sujeitas a digestão de protease. Os péptidos-cisteína marcadas foram enriquecidos utilizando uma resina contendo anti-TMT anticorpo. Durante MS / MS, análise de uma série de iões repórter (isto é, 126-131 Da) emergir na região de baixa massa, fornecendo informação sobre a quantificação relativa.O fluxo de trabalho é eficaz para reduzir a complexidade da amostra, melhorando a gama dinâmica e estudar modificações de cisteína. Aqui apresentamos uma análise proteômica redox do tomate DC3000 Pst tratado (Rio Grande) deixa usar a tecnologia cysTMT. Este método de alto rendimento tem o potencial de ser aplicado para estudar outras redox-regulados processos fisiológicos.

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Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Nível de espécies reativas de oxigênio é elevado quando as células encontrar condições de estresse. Aqui mostramos o exemplo de 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidina coloração, bem como cysTMT rotulagem e espectrometria de massa para traçar o perfil do proteoma redox em<em&gt; Pseudomonas syringae</em&gt; Tratada folhas de tomateiro.

Profiling Proteome Redox tiol Usando Isótopos Espectrometria de Massa Tagging

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

profiling-thiol-redox-proteome-using-isotope-tagging-mass-spectrometry

Research

JoVE Journal

Biology

16.1K visualizações.  University of Florida. Nível de espécies reativas de oxigênio é elevado quando as células encontrar condições de estresse. Aqui mostramos o exemplo de 3'-3 'diaminobenzidina coloração, bem como cysTMT rotulagem e espectrometria de massa para traçar o perfil do proteoma redox em Pseudomonas syringae Tratada folhas de tomateiro.

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MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI preparação da amostra: o método de Camada Ultra Thin

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Biologia

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and very simple lipidome, is a valuable model for studying biological functions of various lipid species in multicellular eukaryotes2,3,5. S. cerevisiae has 10 major classes of lipids with chain lengths mainly of 16 or 18 carbon atoms and either zero or one degree of unsaturation6,7. Existing methods for lipid identification and quantification - such as high performance liquid chromatography, thin-layer chromatography, fluorescence microscopy, and gas chromatography followed by MS - are well established but have low sensitivity, insufficiently separate various molecular forms of lipids, require lipid derivitization prior to analysis, or can be quite time consuming. Here we present a detailed description of our experimental approach to solve these inherent limitations by using survey-scan ESI/MS for the identification and quantification of the entire complement of lipids in yeast cells. The described method does not require chromatographic separation of complex lipid mixtures recovered from yeast cells, thereby greatly accelerating the process of data acquisition. This method enables lipid identification and quantification at the concentrations as low as g/ml and has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. Lipids extraction from whole yeast cells for using this method of lipid analysis takes two to three hours. It takes only five to ten minutes to run each sample of extracted and dried lipids on a Q-TOF mass spectrometer equipped with a nano-electrospray source.

We describe a new quantitative lipidomics method for identifying numerous lipid species in yeast using survey-scan electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS). This method exceeds currently available methods for lipid identification and quantification in the ability to resolve various molecular forms of lipids, sensitivity, and speed.

A avaliação quantitativa do Lipidome fermento usando Electrospray Espectrometria de Massa de Ionização

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

Analisar grandes complexos de proteínas por espectrometria de massa estruturais

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

Oligo Profiling Massa (OLIMP) de polissacarídeos extracelulares

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

Análise direta de células individuais por Espectrometria de Massa à pressão atmosférica

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Perfil de metiltransferases e Outros S-Adenosil- L Homocisteína-Proteínas de Ligação de captura por Espectrometria de Massa Compound (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Quantificação de Proteínas Usando Enriquecimento imunoafinidade Peptide Acoplado com Espectrometria de Massa

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Reação selecionada Monitoramento Espectrometria de Massa para Absolute Quantificação de Proteína

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ability to proliferate or they can differentiate and fuse into multinucleated myotubes, which maturate further to form myofibers. Skeletal muscle terminal differentiation is orchestrated by the coordinated action of various transcription factors, in particular the members of the Muscle Regulatory Factors or MRFs (MyoD, Myogenin, Myf5, and MRF4), also called the myogenic bHLH transcription factors family. These factors cooperate with chromatin-remodeling complexes within elaborate transcriptional regulatory network to achieve skeletal myogenesis. In this, MyoD is considered the master myogenic transcription factor in triggering muscle terminal differentiation. This notion is strengthened by the ability of MyoD to convert non-muscle cells into skeletal muscle cells. Here we describe an approach used to identify MyoD protein partners in an exhaustive manner in order to elucidate the different factors involved in skeletal muscle terminal differentiation. The long-term aim is to understand the epigenetic mechanisms involved in the regulation of skeletal muscle genes, i.e., MyoD targets. MyoD partners are identified by using Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) from a heterologous system coupled to mass spectrometry (MS) characterization, followed by validation of the role of relevant partners during skeletal muscle terminal differentiation. Aberrant forms of myogenic factors, or their aberrant regulation, are associated with a number of muscle disorders: congenital myasthenia, myotonic dystrophy, rhabdomyosarcoma and defects in muscle regeneration. As such, myogenic factors provide a pool of potential therapeutic targets in muscle disorders, both with regard to mechanisms that cause disease itself and regenerative mechanisms that can improve disease treatment. Thus, the detailed understanding of the intermolecular interactions and the genetic programs controlled by the myogenic factors is essential for the rational design of efficient therapies.

MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.

Identificação de MyoD interactome Usando purificação de afinidade em tandem Acoplado a Espectrometria de Massa

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

Redox Cellular Profiling Usando Microscopia de Alto Conteúdo

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...