Este protocolo é altamente significativo porque representa o fluxo de trabalho de última geração para a análise global da metilação da arginina proteica por espectrometria de massa. Este é o único método para identificar e perfilar a proteína R-metilada com uma resolução de estilo único que não é alcançável com outras técnicas bioquímicas. Quando combinado com o uso de inibidores de PRMT, vários dos quais estão em ensaios clínicos e drogas anticancerígenas, este protocolo permite uma análise aprofundada de seu mecanismo de ação.
Para começar, realize a redução do grupo tiol de proteínas usando uma solução de reserva de TDT dissolvida em água ultrapura a uma concentração final de 4,5 milimolares e deixe a reação ir por 30 minutos a 55 graus Celsius. Realizar alquilação do grupo tiol de proteínas adicionando iodoacetamida a uma concentração de 10 milimolares e incubando por 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. Para verificar a eficiência da proteólise, guarde uma alíquota de extrato proteico para análise subsequente em gel corado com Coomassie, SDS-PAGE e compare-a com uma quantidade correspondente de amostra após a digestão.
Diluir o extrato proteico restante com quatro volumes de 20 HEPES milimolares a pH 8,0 para atingir uma concentração final de ureia de dois molares. Divida a amostra em duas partes e, em seguida, adicione tripsina modificada de grau de sequenciamento a uma e protease LysargiNase à outra. Deixe as amostras durante a noite a 37 graus Celsius em uma termificadora a 600 rotações por minuto para permitir a digestão enzimática.
Para cada gradiente cromatográfico, colete todas as frações em uma placa profunda de 96 poços. Agrupe as frações coletadas antes do início do gradiente em uma única fração chamada pre. Concatenar as 60 frações do gradiente cromatográfico líquido de fase invertida de pH elevado, agrupando-as de forma não contígua em 14 frações finais.
Para obter concatenação não contígua, agrupe as frações de fase invertida de pH elevado, conforme descrito no manuscrito do texto. Agrupe as frações coletadas após o gradiente em uma fração exclusiva chamada post. Realizar o enriquecimento sequencial de imuno-afinidade do peptídeo modificado separadamente para as duas amostras das digestões de tripsina e LysargiNase.
Diluir a purificação de imuno-afinidade concentrada 10X ou tampão IAP 10 vezes. Centrifugar os peptídeos liofilizados a 2.000 G por cinco minutos para girar os peptídeos até o fundo do tubo. Ressuscite os peptídeos com 250 microlitros de tampão IAP diluído por tubo de 15 mililitros e transfira para um tubo de baixa ligação de 1,5 mililitro.
Use um papel decisivo para verificar se o pH é maior que seis. Mantenha uma pequena alíquota de cada fração como entrada para a análise subsequente do MS. Divida cada fração em duas partes para realizar o imunoenriquecimento de peptídeos assimetricamente dimetilados, ou ADMA, e simetricamente dimetilados, ou SDMA, em paralelo.
Preparar três frascos para injetáveis dos anticorpos anti-metilados R-pan selecionados conjugados com grânulos de agarose de proteína A por 10 miligramas do extracto proteico inicial. Preparar a quantidade correta de anticorpos conjugados a grânulos de agarose, centrifugando cada frasco para injetáveis a 2 000 G durante 30 segundos e removendo o tampão das contas. Lave as contas três vezes com um mililitro de PBS 1X, centrifugando-as a 2.000 G por 30 segundos.
Após a última lavagem, ressuspeite as contas em 40 microlitros 1X PBS para cada frasco para injetáveis, junte-as e, finalmente, divida-as igualmente em 16 frações. Adicione 250 microlitros de tampão IAP 1X a cada tubo e misture invertendo. Em seguida, incube os tubos em uma roda rotativa por duas horas a quatro graus Celsius.
Após a incubação, centrifugar os tubos de 1,5 mililitro contendo peptídeos e contas conjugadas de anticorpos R-metil pan a 2.000 G por 30 segundos para peletizar as contas e transferir o fluxo de cada fração para um tubo limpo de 1,5 mililitro de baixa ligação. Adicione as esferas ao fluxo conjugado a anticorpos contra a metilação R-mono e repita a ressuspensão em PBS, incubação com tampão IAP e centrifugação. Durante a incubação das amostras peptídicas com contas de monometilização ou MMA, lavar as frações previamente imunoprecipitadas com anti-ADMA e SDMA com tampão IAP de 250 microlitros duas vezes e descartar o sobrenadante após cada lavagem.
Em seguida, lave com água de grau LC-MS três vezes. Elute os peptídeos SDMA ou ADMA enriquecidos por afinidade das contas de agarose adicionando 50 microlitros de 0,15 TFA a cada tubo. Deixe esta solução durante 10 minutos à temperatura ambiente, invertendo os tubos a cada dois a três minutos.
Transfira a primeira eluição para tubos limpos de 1,5 mililitros de baixa ligação e repita a eluição com 50 microlitros de 0,15 TFA. Junte as duas frações de eluição em um tubo. Repita este processo para os peptídeos R-mono-metilados que foram incubados com as esferas de anticorpos anti-MMA.
Após a mistura das células leves e pesadas, as proteínas foram extraídas e submetidas à digestão por tripsina e LysargiNase. Um gel corado com Coomassie-SDS-PAGE foi utilizado para verificar a digestão enzimática eficiente de proteínas totais em peptídeos. A eficiência da etapa de purificação realizada pela coluna C18 Sep-Pak foi avaliada, confirmando a ausência de peptídeos no fluxo da coluna C18 e na primeira e segunda lavagem, bem como sua presença esperada no eluente.
Avaliou-se a incorporação adequada de MET4 no canal pesado e a mistura correta de pesados ou leves. O cromatograma do fracionamento de peptídeos por cromatografia líquida de fase invertida de pH alto off-line e a subsequente concatenação não contígua de frações são mostrados aqui. Os peptídeos foram detectados por UV de 250 nanômetros, enquanto proteínas potencialmente não digeridas remanescentes foram avaliadas por UV de 280 nanômetros. Os espectros completos de MS de peptídeos representando a anotação de peptídeo metil positivo verdadeiro foram obtidos.
As diferenças de M sobre Z observadas entre os três picos são consistentes com a presença de resíduo enzimaticamente metilado. Os espectros completos de MS de peptídeos representando anotação de peptídeo metil falso positivo foram obtidos. As diferenças de M sobre Z observadas entre o peptídeo metilado leve e sua contraparte pesada punitiva se desviam do valor esperado em 0,0312.
O fluxo de trabalho do protocolo é linear em geral, mas há algumas etapas que precisam de atenção especial. Por exemplo, a separação por cromatografia IPH com concatenação de frações não contíguas, bem como a configuração IP. O mesmo protocolo pode ser acoplado ao SILAC padrão ou à quantificação sem rótulo para traçar a dinâmica de metilação da arginina em resposta a uma variedade de perturbações.
Este protocolo abre o caminho para a caracterização da extensão e dinâmica da metilação de proteínas em vários tipos de células e sistemas de modelo que suportam todos os aspectos da pesquisa básica e translacional focada em PRMTs.
