A microscopia de força atômica, ou nanoindentação baseada em balanços AFM, pode ser usada para determinar as propriedades mecânicas em nanoescala de materiais que variam de módulos, de quilopascais a gigapascals no ar e no fluido. A nanoindentação baseada em balil AFM permite imagens topográficas colocalizadas e medições de propriedades mecânicas quantitativas in situ com precisão e resolução em nanoescala em uma ampla gama de materiais e ambientes relevantes. A nanoindentação baseada em cantilever AFM pode ser usada para diferenciar entre estruturas saudáveis e doentes, tecidos ou células que exibem propriedades mecânicas divergentes.

Determinar com precisão a área de contato da amostra da ponta e a força aplicada durante a nanoindentação baseada em cantilever requer uma calibração cuidadosa da sonda AFM, o que é desafiador, mas essencial para medições quantitativas de propriedades mecânicas em nanoescala. Para começar, selecione uma microscopia de força atômica ou sonda AFM apropriada para nanoindentação da amostra pretendida com base no meio, módulo esperado, topografia da amostra e tamanhos de características relevantes. Coloque a sonda no suporte da sonda e conecte-o à cabeça de varredura do AFM.

Selecione um modo de nanoindentação apropriado no software AFM que permita o controle do usuário de rampas individuais. Alinhe o laser na parte de trás do cantilever da sonda oposto à localização da ponta da sonda e no detector sensível à posição, ou PSD. Centralize o ponto do feixe de laser na parte de trás do cantiléver, maximizando a tensão da soma.

Em seguida, centralize o ponto de feixe de laser refletido no PSD ajustando os sinais de deflexão vertical e horizontal para que sejam o mais próximo possível de zero, fornecendo assim a faixa de deflexão máxima detectável para produzir uma tensão de saída proporcional à deflexão do cantilever. Calibrar a sensibilidade à deflexão, ou DS, do sistema AFM da sonda. Para fazer isso, configure e execute recuos de calibração DS em Safira para obter aproximadamente a mesma deflexão da sonda que os recuos de amostra planejados, uma vez que o deslocamento medido é uma função do ângulo de deflexão da ponta e se torna não linear para grandes deflexões.

Repita a rampa cinco vezes. Determine o DS em nanômetros por volt ou a sensibilidade inversa da alavanca óptica e volts por nanômetro a partir da inclinação da porção linear do regime de contato após o ponto de contato inicial na curva de deslocamento de força resultante, ou FD. Use a média dos valores para máxima precisão.

Se o desvio padrão relativo exceder 1%, remeça o DS, pois às vezes as primeiras curvas de DF não são ideais devido à introdução inicial de forças adesivas. Se a constante K da mola do cantilever da sonda não estiver calibrada de fábrica, calibre a constante da mola. Se a sonda não tiver uma medição de raio de ponta calibrada de fábrica, meça o raio efetivo da ponta R.Se empregar o método de reconstrução de ponta cega, imagine a caracterização da ponta ou amostra de rugosidade usando uma taxa de varredura lenta e altos ganhos de feedback para ajudar a otimizar o rastreamento das características muito nítidas.

Escolha um tamanho de imagem e densidade de pixels com base no raio de ponta esperado. Em seguida, use o software de análise de imagem AFM para modelar a ponta da sonda e estimar seu raio final e diâmetro efetivo da ponta na profundidade de recuo da amostra esperada. Ao concluir a calibração da sonda, insira os valores DS, K e R no software.

Finalmente, insira uma estimativa da razão de Poisson da amostra para converter o módulo reduzido medido para o módulo real da amostra. Se empregar um modelo de mecânica de contato cônico ou conosférico baseado na forma da ponta e na profundidade de recuo, é necessário inserir o meio-ângulo da ponta. Navegue pela amostra sob o cabeçalho AFM e envolva-se na região de interesse desejada.

Monitore o sinal de deflexão vertical ou execute uma pequena rampa inicial para verificar se a ponta e a amostra estão em contato. Ajuste a posição da cabeça do AFM ligeiramente para cima e rampa novamente. Repita até que a ponta e a amostra estejam fora de contato, como evidenciado por uma rampa quase plana e mínima deflexão vertical do cantilever.

Uma vez que nenhuma interação óbvia da amostra da ponta esteja presente, diminua a cabeça do AFM em uma quantidade correspondente a aproximadamente 50% do tamanho da rampa para garantir que a ponta da sonda não colida com a amostra enquanto move manualmente a cabeça do AFM. Rampa novamente, repetindo até que uma boa curva seja observada. Ajuste os parâmetros da rampa.

Selecione um tamanho de rampa apropriado dependendo da amostra e da profundidade de recuo desejada. Em seguida, selecione uma taxa de rampa apropriada. Um hertz é um bom ponto de partida para a maioria das amostras.

Defina o número de amostras por rampa para alcançar a resolução desejada da medição. Ajuste o X Girar para reduzir as forças de cisalhamento na amostra e na ponta, movendo simultaneamente a sonda ligeiramente na direção X enquanto recua na direção Z. Use um valor para o X Girar igual ao ângulo de deslocamento do suporte da sonda em relação à superfície normal.

Em seguida, escolha se deseja empregar uma rampa acionada ou não acionada. Se uma rampa acionada for escolhida, defina o limite de gatilho para resultar no recuo desejado na amostra. Execute um recuo no local escolhido.

Selecione e carregue os dados a serem analisados no software. Valores calibrados de entrada para a constante de mola, DS ou sensibilidade inversa da alavanca óptica e raio da ponta da sonda, juntamente com uma estimativa para a razão de Poisson da amostra. Escolha um modelo de mecânica de contato de nanoindentação apropriado para a ponta e a amostra.

Execute o algoritmo de ajuste. Verifique se há ajuste adequado das curvas FD. Um baixo erro residual correspondente a um R-quadrado médio próximo à unidade indica um bom ajuste ao modelo escolhido.

Se desejar, verifique pontualmente as curvas individuais para inspecionar visualmente a curva, o ajuste do modelo e os pontos de contato calculados. Curvas de FD próximas do ideal obtidas no ar em uma amostra de pinheiro loblolly embebida em resina e em solução salina tamponada com fosfato em um núcleo de células-tronco mesenquimais são mostradas. Com a sonda de silicone, a ponta sofreu um desgaste significativo em relação ao seu estado inicial puro durante a imagem.

A cada imagem subsequente, a ponta torna-se progressivamente mais arredondada. Em contraste com a sonda de diamante, o raio da ponta não se alterou dentro dos limites do método de reconstrução da ponta cega, destacando a extrema resistência ao desgaste do diamante. Uma imagem de topografia AFM cobrindo várias células com uma representação pseudo 3D e um mapa de módulo correspondente de uma amostra de pinheiro loblolly é mostrada aqui.

O mapa de módulo derivado do AFM gerado durante a obtenção de uma imagem AFM mostra que a inclusão mineral no centro das imagens é significativamente mais difícil do que a matriz orgânica circundante. O efeito do raio e da forma da ponta da sonda na aparência de características de alta proporção de uma amostra de xisto Bakken é mostrado. A nanoindentação baseada em cantilever em células-tronco mesenquimais e núcleos isolados não exibiu diferença estatística no módulo de elasticidade.

A morfologia e as propriedades mecânicas das bicamadas lipídicas de colesterol estudadas por AFM são demonstradas aqui. A calibração adequada da sonda e a seleção de parâmetros apropriados em rampa em modelos de mecânica de contato são essenciais para medições nanomecânicas precisas. Além de permitir medições modulares elásticas, a nanoindentação baseada em balanços AFM pode ser usada para sondar a força de ruptura ou força de ruptura das bicamadas fosfolipídicas sob condições fisiológicas relevantes.

A nanoindentação baseada em balil AFM permitiu a investigação dos efeitos de knockouts estruturais, tratamentos farmacêuticos e vibrações de baixa intensidade para simular o exercício sobre as propriedades mecânicas de núcleos de células-tronco mesenquimais.