The authors would like to acknowledge our colleagues at H3 Biomedicine for their feedback during the manuscript preparation.

1. Avaliação GI 50 para o composto (s) de interesse <ol><li> Gerar curva (s) de crescimento de linhas celulares de interesse para avaliar a densidade de sementeira apropriada. Traçar O número de células em vários pontos de tempo após a sementeira (dias 2, 4, 6 e 8) em relação ao dia 0. Isto proporcionará uma taxa de crescimento relativo da linha de células de interesse e deve ser utilizado para avaliar a densidade de sementeira inicial de tal modo que confluência não é atingido em placas de 96 poços no prazo de 7 dias. </li><li> Uma vez que as curvas de crescimento foram determinadas, semente número adequado de células em não-transparente, claro fundo placas de 96 poços em 100 ul de meio de células para avaliar GI 50. Semente o número de células com base na linha celular utilizada e determinada em 1,1. Normalmente, sementes 3x10 3 células para linhas de células de crescimento rápido com um tempo de duplicação de ~ 24 horas, por exemplo., HCT116. <ol><li> Prepara-se uma placa de ensaio (dia-1). Para a placa de ensaio, as células semente com uma densidade desejada em 100 ul de meio de cultura In poços sombreados em azul (Figura 1). Wells em destaque na branco contêm apenas mídia. </li><li> Prepara-se uma placa de controlo (dia-1). Para a placa de controlo, semear a mesma densidade das células como no passo 1.2.1 em 100 ul de meio de cultura em separado uma placa de 96 poços. Este &quot;Dia 0&quot; leitura vai ajudar na interpretação da natureza citostático / citotóxica dos compostos que está sendo analisado (Figura 2). </li></ol></li><li> No dia seguinte (dia 0), ler a placa de controle. Equilibrar reagente de viabilidade celular luminescente (substrato CellTiter-Glo misturado com tampão de acordo com as instruções do fabricante) para a TA e agitar suavemente o conteúdo por inversão para se obter uma solução homogénea. Adicionar 80 ul de reagente a 100 ul de células / mistura meios e agitar o conteúdo durante 30 min para induzir a lise celular. <ol><li> Grave luminescência com um luminómetro definida para uma exposição de 0,1-1,0 segundos e detecção de comprimento de onda de 560 nm. </li></ol></li><li> Adicionar os compostos de teste (compostosde interesse) para testar as placas (dia 0). Fazer uma diluição 1: 4 em série dos compostos em DMSO, a concentração final de 200x, para um total de 10 concentrações (diluições contendo o composto 9 e apenas um de DMSO, a placa de composto). Como um ponto de partida inicial, o objectivo para uma dose 200x menor de 0,03 mM e uma dose superior de 2.000 mM (volume final de 200 ul). </li><li> Adicionar compostos serialmente diluídos para meio para fazer uma mistura composto-forma numa concentração final 10X (volume final de 100 ul, a placa intermediária). Armazenar a placa de composto a -20 ° C para utilização no dia 3 do ensaio. Adicionar 10 uL de mistura de composto de médio a células em triplicado de modo a que a dose mais elevada é 10 uM (por ex., As linhas B, C e D, dia 0) (Figura 1). Incubar as placas de ensaio durante 3 dias a 37 ° C. Descartar placa intermédia (s) após o uso. </li><li> No dia 3, preparar uma mistura de composto 400 ul de meio 1x utilizando as placas de composto preparado no passo 1.4. Inverta placas de ensaio para remover mídia e seque em autotoalhas de papel claved 2-3x para remover mídia residual. Adicionar composto / meios (100 ul / poço) para poços sombreadas em azul e adicionar 100 ul de meios de perímetro poços para evitar a evaporação (Figura 1). Re-incubar as placas de ensaio a 37 ° C durante um período adicional de 3 dias. </li><li> No dia 6, avaliar o número relativo de células viáveis ​​através da realização de uma leitura de luminescência, tal como descrito na etapa 1.3. </li><li> Use a leitura dia 0 para avaliar a natureza estática / tóxico de compostos. Agentes tóxicos induzir a apoptose enquanto os agentes citostáticos induzir parada do ciclo celular. Se o composto é tóxico (dia 6 leitura está abaixo de dia 0 leitura), considere a escolha de GI 50, e GI 50 x 5 concentrações para os testes de resistência. No entanto, se o composto induz a estase (igual a ou maior do que a leitura D0), considere GI 100 e 100 GI X5 para os ensaios de resistência (Figura 2). </li></ol> 2. Criação de drogas Resistência Assays <ol><li> Se a sagacidade de trabalhoha agente citostático, as células semente em uma confluência de 30-40% em 150 mm 2 pratos de cultura de tecidos (volume = 30 ml) para o ensaio de resistência. Se trabalhar com um agente tóxico, semear a uma confluência de 70-80%. </li><li> Para linhas de células que abrigam um mecanismo de reparação de emparelhamentos incorrectos intacta (MMR), incubar as células do passo 2.1 O / N a 37 ° C com o agente cancerígeno de N-etil-N-nitrosoureia (ENU). Tratar as células com 30 ul de uma solução de estoque de 50 mg / ml ENU (concentração final 50 ug / ml) para aumentar a instabilidade do genoma. Para linhas de células que possuem um defeito MMR (Tabelas 2 e 3), o tratamento com ENU ou outras substâncias cancerígenas pode não ser necessário. <ol><li> Para outras linhas celulares, determinar MMR-deficiência por critérios NCI usando microsatélites instabilidade 12, ou com base na caracterização publicada utilizando ensaios de instabilidade de microssatélites ou perfil genômico / epigenômico de genes MMR 13-15. </li></ol></li><li> Células trata-se com o composto de teste (s) deinteresse na concentração determinada no passo 1.8. Para os compostos altamente tóxicos que causam a morte celular num ensaio de viabilidade de três dias típico 10, começar com um tratamento de dose baixa (ou seja, GI 50) e progressivamente aumentar a concentração (múltiplos de GI 50) de composto até cada 2-3 semanas robusta resistência é observada. Reabastecer de mídia e agravar a cada 3 d. </li><li> Uma vez que a selecção foi iniciada, mudança media / composto misturar a cada 3-4 dias até clones resistentes emergem. Resistência, por definição, surge quando as células tratadas mostram um maior crescimento / viabilidade durante o tratamento da droga em relação ao tratamento agudo de células de controlo tratadas com DMSO. </li></ol> 3. isolamento de clones de uma única célula <ol><li> Examine cultura prato usando microscopia de contraste de fase (ampliação de 40x) para clusters de células viáveis. </li><li> Clones satisfatórios de interrogação no fundo do prato com uma caneta de marcação. Escolha clones que são de tamanho médio (colônias maiores podemoriginários de várias células) e bem isolado a partir de outras colónias. Escolha clones usando uma das duas abordagens descritas no passo 3.3. </li><li> Método 1: Utilizando um pipetador (Figura 3) <ol><li> Remova a mídia de crescimento e enxágüe com 1x PBS para remover quaisquer células flutuantes. </li><li> Use marcas pretas como guia para &#39;colheita&#39; clones com ponta de pipeta (anexado a pipeta, p200 de preferência). </li><li> Clones de transferência para placas de 48 poços com 200 ul de meio fresco (com uma concentração metade composto para permitir a recuperação óptima de células). </li><li> Permitir que as células recuperar durante 2-3 dias antes de adicionar 200 mL de mídia fresco / concentração composto ideal. </li><li> Continuar a mudar media / composto a cada 3-4 dias e continuar a expandir clones. </li></ol></li><li> Abordagem 2: Usando clonagem de discos (Figura 3) <ol><li> Marque clones como descrito no passo 3.2. </li><li> Colocar 3 milímetros discos de clonagem em uma placa de 10 cm de cultura de tecidos contendo 5 ml de 0,25% trypsin-EDTA durante 2 min. </li><li> Aspirar media de prato contendo clones resistentes e sobrepor clones com tripsina embebido discos de clonagem utilizando fórceps estéreis descartáveis. </li><li> Deixar durante 1-2 min, dependendo da facilidade com que os clones levantar as placas, num banho a 37 ° C incubadora. </li><li> Pegue clonagem discos usando uma pinça estéril e transferir para placas de 48 poços com 200 ul media frescos e metade concentração do composto. </li><li> Pipeta-se para baixo e ligeiramente para desalojar as células a partir de discos de clonagem e incubar O / N a 37 ° C (deixar em discos de clonagem de poços). </li><li> Na manhã seguinte, remova os discos de clonagem a partir de placas de 48 poços e encher os poços com 200 ul fresco media / composto (concentração do composto de metade ideal). </li><li> Três dias mais tarde, reabastecer de mídia com a concentração ideal do composto. </li><li> Continuar a mudar o media / composto a cada 3-4 dias e continuar a expandir clones. </li></ol></li></ol> 4. Avaliação Grau de Resistance de Isolado Clones <ol><li> Uma vez que 10-20 colónias são expandidos, geram IG 50 curvas, tal como descrito no passo 1 para avaliar o grau de resistência. </li><li> Sempre incluir populações de controlo tratados com DMSO durante o processo de seleção. É muito provável que o espectro de resistência vai ser grande (alguns mostrando parcial enquanto outros mostrando resistência completa). Recolha algumas clones de cada uma destas classes como o mecanismo de resistência pode variar entre os dois grupos. </li></ol> Sequenciamento 5. Próxima geração <ol><li> Girar 2 milhões de células (controlo) e os clones resistentes (500 xg durante 5 min) em 15 ml de frascos cónicos para ambos ADNg e recolha de RNA (por conseguinte, 2 x 2 milhões). </li><li> Lavar duas vezes com PBS 1x e congelar em aglomerados -80 ° C até estar pronto para o isolamento. </li><li> Use um kit de extração comercial para isolar RNA ou gDNA de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Enviar amostras para sequenciamento de última geraçãousando o protocolo do fornecedor 10. </li></ol> 6. Bioinformática análise de amostras (whole-exome sequenciação) <ol><li> Preprocess sequência de dados de acordo com a melhor prática DNA-seq gasoduto 16. <ol><li> Mapear todas as leituras para fazer referência GRCh37 genoma humano utilizando BWA 17. Converter descompactados alinhamentos SAM formatadas para o formato BAM comprimido com Samtools 18. Classificar alinhamentos por coordenar com Samtools. Adicionar grupos de leitura usando Picard. (Para BWA específico, Samtools e Picard comanda, consulte Suplementar Text 1, linhas 1-4) </li><li> Mark todas as duplicatas lê usando os MarkDuplicates comando da ferramenta Picard definido 19. Índice este arquivo com Samtools. (Texto Suplementar 1, linhas 5-6) </li><li> Para minimizar bases não correspondentes em todos os lê, lê realinhar localmente em regiões que abrigam pequenas inserções ou exclusões usando uma realigner indel 20. (Texto Suplementar 1, linhas 7-8) </li><li> Para melhorar ainda mais o Accuracy da chamada variante, os escores de qualidade de base empírica recalibrar usando uma ferramenta de recalibração índice de qualidade base. A ferramenta de calibração da qualidade de base deve não só o índice de qualidade inicial correto, mas também ter em conta covariation de vários recursos, incluindo leitura de grupo, ciclo da máquina, posição de base, e contexto dinucleotide (bases atuais anteriores +). Gerar BAM recalibrado com PrintReads Picard. (Para comandos específicos para esta etapa, consulte Suplementar Text 1, linhas 9-10) </li><li> Repita os passos 6.1.1 através 6.1.4 (Texto Suplementar 1, linhas 1-10) para cada amostra sequenciada. </li></ol></li><li> Identificar a variação de nucleotídeo único (SNV) em cada clone usando uma variante emparelhado chamando tool19, 21-23. Para cada clone sequenciado, variante emparelhado executar chamando usando o clone parental como o combinado &quot;normal&quot;. (Recurso Text 1, linha 11) </li><li> Filtro recorrentes, variantes de alta qualidade e se preparar para anotação com uma ferramenta de anotação variante 24. Deprioritize variants não é comum a todos os clones resistentes. (Veja R roteiro em Suplementar Text 2) </li><li> Anotar variantes com uma ferramenta de anotação 25, 26. Muitas ferramentas de anotação variante tenho um aplicativo web que acompanha permitindo que os dados sejam enviados e processados ​​por um servidor remoto. </li><li> Use uma ferramenta de previsão do impacto funcional 27-29 de priorizar as variantes previstas de ter alto impacto funcional. Como anotação variante, várias ferramentas estão disponíveis para a previsão do impacto funcional através de uma interface web. </li></ol>

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Taxas de publicação do presente artigo são pagos pelo H3 Biomedicina.

Seleção de linha (s) celular: Caracterização do estado genético e instabilidade genômica Sem dúvida, o factor mais importante na descoberta de mecanismos de resistência com sucesso clinicamente relevantes é a seleção inicial da linha celular. Dois factores devem ser considerados. Em primeiro lugar, o objectivo de seleccionar a linha de células (s) da mesma linhagem / subtipo abrigar os traços genéticos que definem a doença (por exemplo., BRAF V600E em melanoma). Interrogatório de dados transcriptomic e mutação publicamente disponíveis para ambas as linhas de células 30-32 e tumores primários / metástase para uma variedade de indicações 33,34 facilitará o processo de seleção. Embora a identificação de linhas celulares com alterações genéticas clinicamente relevantes é ideal, em alguns casos, isto pode não ser possível devido à falta de linhas celulares disponíveis ou viável devido a factores tais como a dificuldade e duração do processo de triagem. <p class="jove_content"&gt; Com relação ao ponto acima mencionado, um segundo fator a considerar, em seguida, durante a seleção de linha celular é a facilidade ou viabilidade de resistência rastreio utilizando a linha desejada. Por exemplo, factores tais como a proliferação e taxas de mutação intrínsecas podem ter grande impacto na velocidade de descoberta. Para esse efeito, as linhas celulares podem ser utilizadas com uma cinética de crescimento mais rápidas e deficiente em mecanismos de ADN MMR na esperança de que o surgimento de resistência espontânea pode ser acelerada 35. Com base no banco de dados cósmicos, várias linhas celulares candidatas existir com deficiência de um dos dois genes MMR frequentemente mutados MSH2, MLH1 ou (Tabelas 2 e 3). Alternativamente, se as linhas celulares de interesse, não existem defeitos de rolamento na MMR, o tratamento agudo com mutagénios químicos ou físicos ADN reactivo, tal como o agente de alquilação N-etil-N -nitrosourea (ENU) pode ser usado para aumentar a instabilidade do genoma. Apesar de ambas as abordagens podem significativamente de sHorten o tempo para atingir os clones resistentes e seguimento de sequenciação, ensaio funcional rigorosas deve ser realizada em genes candidatos como um maior número de não-funcional, mutações de passageiros é provável que surjam. SNVS pode ser posto ordenou para maximizar as chances de identificação de mutações funcionalmente relevantes. Em primeiro lugar, escolha dessas mutações que são recorrentes em clones independentes vai aumentar a probabilidade de estas mutações são drivers de resistência. No caso mutações recorrentes não são identificados, concentrando-se em SNVS que se encaixam no mecanismo de acção do fármaco (por exemplo, o alvo da droga ou um efector a jusante do conhecido fármaco alvo) pode ser significativa. Em última análise, o padrão-ouro é sempre a avaliação experimental da atividade de resistência concessão dos SNVS candidatos por expressão cDNA ectópica em células parentais sensíveis à droga. DNA vs RNA seqüenciamento Uma vez que os clones resistentes foram gerados, ADN e / ou ARNpode ser sequenciado de acordo com a necessidade. A sequenciação de ADN, quer exome ou todo o seqüenciamento do genoma, permitirá a identificação de germinativas e somáticas variantes, tais como SNPs, indels e número do exemplar variantes. Considerando que o mais exome seqüenciamento custo-friendly centra-se na geração lê a partir de regiões codificantes conhecidos, todo o seqüenciamento do genoma irá gerar dados de seqüenciamento de todo o genoma que possam facilitar a identificação de mutações em elementos não-codificantes, como potenciadores ou miRNAs 36. No entanto, uma vez que a expressão do gene de dados não é calibrada durante a sequenciação de ADN, é difícil prever qual a mutação (ões) é provável que seja um condutor funcional. A este respeito, a sequenciação de ARN, ainda mais dispendiosos, oferece esta vantagem. O facto de que a mutação de chamada é realizada apenas em espécies de ARN expressas aumenta a probabilidade de que a mutação de interesse pode ser um condutor funcional. Além de permitir uma pesquisa mais focada de mutações para testes funcionais de seguimento, RNA sequenciamento tambémoferece a vantagem adicional de ser capaz de identificar alterações no gene expressão, splicing alternativo e novas espécies de RNA quiméricos, incluindo fusões de genes que podem também servir como motoristas potentes de resistência. Pipeline de Bioinformática Comandos de exemplo são fornecidos para fins de ilustração, mas uma documentação mais detalhada e tutoriais estão disponíveis a partir do Broad Institute 16 e devem ser lidas cuidadosamente antes de começar a análise NGS. Os comandos a seguir são projetados para um ambiente UNIX shell em um sistema no qual todas as ferramentas e dados de referência ter sido pré-instalado. Estes comandos também assumir FASTQ arquivos contendo seqüência emparelhados-end lê a partir de duas amostras, com o nome &quot;parental&quot; e &quot;resistentes&quot;, foram recebidas do fornecedor e colocado no diretório &quot;data&quot;. Na maioria dos casos, esses comandos devem ser adaptadas ou optimizados para uma aplicação específica usando arg de linha de comando adicionaldo- (por exemplo, acrescentando &quot;-t 8&quot; para o comando BWA permite o funcionamento de vários segmentos por 8 núcleos de CPU). Grupos de leitura (que atribuem alinhamentos de amostras biológicas), muitas vezes deve ser adicionado a arquivos BAM, mesmo se houver apenas uma amostra por arquivo bam, a fim de cumprir com os requisitos de formato de arquivo para certas ferramentas. Leia parâmetros do grupo RGID, RGSM, RGPL, RGPU, e RGLB podem ser strings arbitrárias descrevendo o nome da amostra, plataforma de sequenciamento e estratégia biblioteca. In vitro vs ensaios in vivo Apesar de vários mecanismos de resistência identificados por seleção in vitro foram verificados para ser clinicamente relevante, existe uma possibilidade de que os mecanismos não podem servir como mecanismos relevantes ou predominantes de resistência clínica. Uma razão para isto pode incluir um papel essencial para o micro-ambiente na condução resistência à terapia, um componente que é desprovida no protocolo experimental / d configuraçãoiscussed até agora. De facto, vários estudos têm demonstrado que os agentes anti-cancro que são capazes de matar células tumorais são alteráveis ​​quando as células tumorais são cultivadas na presença de células estromais que implica mecanismos inatos de resistência conferida pelo estroma 37,38. Para identificar esses mecanismos de resistência adquirida induzida pelo estroma, pode-se considerar a realização in vitro de co-cultura ou em ensaios de resistência do tumor in vivo. Uma vez que o ensaio anterior é bastante complexo, muitos têm recorrido a geração de xenoenxertos de tumores resistentes aos medicamentos para tratar o papel potencial do estroma na resistência ao avanço. Tais estudos revelaram ambos os únicos 5 e 39 idênticas mecanismos de resistência relativa à selecção in vitro, o que implica que o estroma podem de facto, desempenhar um papel no último. No entanto, é preciso estar atento ao período de tempo que pode demorar para gerar tais tumores resistentes e da complexidade do acompanhamento genômica análise complexitie-s por causa da heterogeneidade molecular e celular intra-tumoral. A identificação do alvo Além de revelar os mecanismos de resistência a drogas, esta abordagem baseia-perfilamento genómico NGS também pode ser aplicado para identificar alvos celulares de sondas químicas. Historicamente, vários métodos imparciais têm sido usados ​​para identificar os mecanismos celulares de ação e metas de produtos químicos de baixo peso molecular com atividades biológicas, incluindo a purificação por afinidade, juntamente com a proteômica quantitativa, métodos genómicas de levedura, triagem RNAi, e inferência computacional abordagens 40. Como uma extensão para a elucidação dos mecanismos de resistência a drogas usando perfil genômico ou transcriptomic baseado em NGS de populações de células fenotipicamente resistentes, identificação de variações exclusivas recorrentes de nucleotídeo único (SNVS) ou alterações de expressão que permitem resistência pode oferecer insights sobre alvos celulares funcionais dos compostos. To baseia-se na ideia de que um subconjunto de mecanismos de resistência observado pode envolver mutações recorrentes em genes que codificam as proteínas alvos directos da molécula pequena. Recentemente, vários relatórios validou a utilidade da abordagem, particularmente através da combinação com outras abordagens, incluindo em grande escala de células de cancro A linha de perfil de sensibilidade, para revelar os alvos celulares de pequena molécula sonda 9,10.

Caracterização molecular detalhada de genomas de tumor por tecnologias de sequenciação e robustas ferramentas analíticas melhorada dados levou à descoberta de alterações genéticas importantes em tipos específicos de cancro 1,2. Desenvolvimento de terapias específicas destinadas a essas alterações genéticas, como HER2, BCR-ABL, EGFR e ALK, melhoraram significativamente a qualidade de vida dos pacientes 1,2. No entanto, apesar da especificidade desta abordagem, a resposta clínica para a maioria das terapias individuais tem sido sub-óptima em última análise, como a resistência emerge. Recentemente, progressos significativos foram feitos na compreensão das bases moleculares de resistência à terapêutica alvejados. Curiosamente, torna-se evidente que um mecanismo importante de resistência envolve a atividade de destino / caminho persistente. Como um caso em apreço, receptor de andrógeno (AR) -directed tratamento enzalutamida de câncer de próstata leva ao enriquecimento de mutações ativadoras em si AR, mantendo outp de sinalização ARut na presença de inibidor a 3-5. Este conhecimento tem conduzido a uma campanha agressiva para 1) desenvolver antagonistas da terceira geração que pode continuar a suprimir tanto a WT e função mutante-AR em enzalutamida resistente CaP 3 e 2) identificar potenciais gânglios a jusante de sinalização de AR que pode ser alvo de intervenção terapêutica . Da mesma forma, a resistência a outras classes de inibidores tais como aquelas voltadas para EGFR, BRAF e ABL muitas vezes levar a mutações que reativam a quinase via viciante original é 1. Com o conhecimento de que a resistência surge inevitavelmente na maioria dos pacientes, desenvolvendo abordagens para rapidamente trazer esses mecanismos à luz permitirá o desenvolvimento de terapias de acompanhamento eficazes. Uma abordagem que está sendo amplamente utilizado é o de analisar a genômica dos tumores refratários clínicos em relação aos tumores sem tratamento prévio ou sensível a para identificar enriquecimentos / depleções em lesões genéticas que podem ser passíveis de ddescoberta tapete. Apesar de sua promessa, existem duas principais passivos dessa abordagem que dificultam a descoberta rápida. Em primeiro lugar, ganhando acesso oportuno a material de tumor para interrogatório genômica pode servir como um obstáculo significativo na mudança de terapia para curar. Em segundo lugar, desconvolução da miríade de lesões genéticas na configuração resistente pode ser um desafio uma vez que os tumores podem apresentar heterogeneidade intratumoral significativa 6,7. À luz destes desafios, tem havido um aumento da confiança na descoberta pré-clínica de mecanismos de resistência. Esta abordagem pode permitir a identificação de mecanismos de resistência proeminentes antes dos ensaios clínicos 1 que podem nortear estratégias alternativas de gestão clínica naqueles pacientes que carregam esses mecanismos, quer antes ou após o início da terapia de resistência. Uma dessas ferramentas descoberta pré-clínica que está sendo amplamente utilizado é aplicar imparciais telas de RNAi funcionais. Para o exameple, Whittaker e colegas aplicaram uma tela de RNAi genoma escala para identificar que a perda de NF1 medeia a resistência aos inibidores da RAF e MEK através MAPK sustentada ativação da via 8. Estes resultados foram encontrados como sendo clinicamente relevante, como a perda de função mutações em NF1 foram observados em células tumorais BRAF -mutant que são intrinsecamente resistentes à inibição da RAF e em tumores de melanoma resistentes à activação Vemurafenibe 8. No entanto, apesar do sucesso desta abordagem, muitos alvos clinicamente relevantes são frequentemente não identificada, presumivelmente devido à polarização por perda de função desta abordagem. Em contraste, uma ferramenta para a descoberta de menos parcial pré-clínico de mecanismos de resistência envolve a geração de linhas celulares resistentes após exposição prolongada ao composto de interesse juntamente com perfis genómico ou transcriptómica baseado no NGS. Esta abordagem tem sido implementada com sucesso por vários grupos para identificar espontâneavariantes de nucleótidos únicos ou recorrentes alterações de expressão que permitem a resistência 5,9,10. Por exemplo, uma mutação F876L recorrente em AR foi recentemente descoberto em clones resistentes in vitro 3-5 e em tumores de xenoenxerto in vivo 5 antes da identificação desta mutação na clínica 4. Muito recentemente, Bangue e colegas (2015) 11 utilizado ClonTracer em dois modelos clinicamente relevantes para mostrar que a maioria dos clones resistentes que surgem durante a exposição prolongada do fármaco fizessem parte de uma sub-população pré-existente que sugere que a maior parte funcionalmente relevantes mutações já são susceptíveis pré-existente que se tornam selecionado para durante a seleção de 11. Em contraste com o perfil genômico de tumores discutido anteriormente, esta abordagem benefícios de menor heterogeneidade como clones resistentes &quot;homogéneos&quot; são usados ​​para facilitar a análise de dissecção genética mais precisa do potencial de condutores. Furthermminério, excitante, para além do potencial de revelar os mecanismos de resistência, este método pode também ser aplicado para identificar os mecanismos celulares de acção e alvos de pequenas moléculas bioactivas para o qual essa informação é desconhecido 10. Dadas as vantagens claras e os múltiplos usos desta abordagem, aqui apresentamos um protocolo detalhando a implementação bem sucedida de uma tela de tais pré-clínico para maximizar o potencial para descobertas clinicamente significativas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-86&#160;</td>
			<td>Expanding clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-588</td>
			<td>Generating GI50 curves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7572</td>
			<td>Viability testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloning discs (3 mm)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z374431</td>
			<td>Picking clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile forceps</td>
			<td>Unomedical</td>
			<td>DF8088S</td>
			<td>Picking clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus RNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>Isolating RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood and Tissue DNeasy extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69581</td>
			<td>Isolating gDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATK</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Indel realigner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MuTect</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Paired variant calling tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncotator</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Variant annotation tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MutationAccessor</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Functional impact prediction tool</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementation of in vitro drug resistance assays: maximizing the potential for uncovering clinically relevant resistance mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Para maximizar o potencial para a descoberta de controladores funcionais chave de resistência, selecionar clones de células únicas de expansão, o teste fenotípico e seqüenciamento. Como ilustrado na Figura 4A, as células HCT116 tratados durante um período prolongado com o composto citotóxico # 1 levou ao surgimento espontâneo de clones resistentes que continuaram a crescer durante o tratamento (círculos pretos tracejadas). Estes clones foram colhidos usando uma abordagem # destacadas na Figura 3 e, posteriormente, expandidos para análise fenotípica. Como mostrado na Figura 4B, os clones resistentes a todos os 1-3 apresentaram uma resistência significativa ao composto n ° 1 e a sua estreita composto análogo # 2 (maior viabilidade / crescimento), ao passo que todos os clones mostrou sensibilidade a um composto citotóxico VELCADE não relacionado. Após a confirmação da resistência fenotípica, gDNA foi isolado e submetido à análise de sequenciação de todo-exome. Ferramentas de bioinformática foram aplicadas para reduzir em no dessas variantes estruturais quesão: 1) recorrente e 2) têm o potencial de impacto funcional (Figura 5A). Variantes estruturais que conheci estes dois critérios foram confirmados por uma ferramenta de seqüenciamento independente. Tal como ilustrado na Figura 5B, uma mutação sem sentido heterozigótica que foi identificado utilizando-exome toda a sequenciação foi confirmada utilizando o método de sequenciação de Sanger (painel superior, sequência WT; painel inferior, sequência mutante). Após confirmação da sequência, a linha celular parental originalmente utilizado para o ensaio de resistência foi geneticamente manipulada para expressar o ADNc mutante para confirmar funcionalmente o papel da mutação. Tal como ilustrado na Figura 6, enquanto que a sobre-expressão de cDNA falhou o WT para conferir resistência, a expressão do ADNc mutante conferida significativamente a resistência fenotípica forçado para o composto # 1, confirmando o papel funcional desta variação estrutural, como um condutor de resistência. Todos os reagentes utilizados para esta experiência são apresentadas na Tabela 1 </s<html> trong&gt;. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig1.jpg" /> Figura 1. Disposição de placas de ensaio e de controlo. Sombra azul, poços de tratamento de compostos. Sombra branca, único meio. Os compostos são diluídos em série 1: 4 e são administradas em triplicado (BD) ou, por exemplo. 2 compostos podem ser aplicados por placa. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig2.jpg" /> Figura 2. Curvas de viabilidade representativos. Linha ponteada representa Vermelho do eixo x dia 0 leitura. Indica o aumento das doses do composto para a direita e o eixo dos y representa a viabilidade relativa aos poços de controlo de DMSO. GI = 100 dose utilizada para atingir 100% de inibição de crescimento; IG 50 = dose utilizada para reduzir a viabilidade de 50% de controlo de DMSO. _upload / 52879 / 52879fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Duas abordagens para escolher clones resistentes para a expansão. Aproxime-se 1- uso pipeta de pegar e transferir clones bem definidas para placas de 48 poços. Abordagem 2- uso de tripsina-embebido discos de clonagem para levantar clones e transferidos para placas de 48 poços. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig4.jpg" /> Figura 4. Confirmação da resistência obtida em relação aos clones HCT116 para o composto # 1 in vitro. (A) o composto # 1 HCT116 clones resistentes surgiu na sequência contínua selecção de três semanas. (B) A viabilidade dos clones de controlo e resistentes foi testada após 72 horas de tratamento com vários compostos. Composto # 2 é um análogo próximo do composto # 1. Velcade foi utilizado como um agente de controlo citotóxico. Os dados são apresentados como média + desvio padrão de três réplicas biológicas. Figura 5. Identificação de uma mutação única ou recorrente (variantes de um único nucleótido, SNVS) no gene A em composto # 1 HCT116 clones resistentes. Fluxo (A) de trabalho para identificar SNVS presente em todos os clones resistentes e previsto para ter um impacto funcional alta por MutationAssessor. (B) A confirmação da mutação no gene A por Sanger Sequencing. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig6.jpg" /> Figura 6. Re-expressão do gene mutado Uma resistência conferida ao composto # 1 in vitro. Viabilidade das linhas celulares HCT-116 modificadas foi testada após 72 horas de tratamento com o composto # 1. Linhas celulares mutantes HCT116-WT ou são estavelmente expressando cDNAs WT ou mutantes de gene A, respectivamente. Os dados são apresentados como média + desvio padrão OF três réplicas biológicas. <table><tbody><tr><td> Nome Amostra </td><td> Aminoácido </td><td colspan="2"> Tecido primário </td><td> Zigosidade </td></tr><tr><td> C-33-A </td><td> p.E768fs * 44 </td><td colspan="2"> cerviz </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> C-33-A </td><td> p.S860 * </td><td colspan="2"> cerviz </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> CML-T1 </td><td> P.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> CP66-MEL </td><td> p.C822F </td><td colspan="2"> pele </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> CTV-1 </td><td> p.0? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> p.Q130fs * 2 </td><td colspan="2"> ovário </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> P.? </td><td colspan="2"> ovário </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr> &lt;td&gt; HCC2218 </td><td> p.E467K </td><td colspan="2"> mama </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> J-RT3-T3-5 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> LNCaP </td><td> P.? </td><td colspan="2"> próstata </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> LoVo </td><td> P.? </td><td colspan="2"> intestino grosso </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> MOLT-13 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> NALM-6 </td><td> P.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> NCI-H630 </td><td> p.R680 * </td><td colspan="2"> intestino grosso </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> Skut-1 </td><td> p.L787fs * 11 </td><td colspan="2"> endométrio </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> Skut-1B </td><td> pL787fs * 11 </td><td colspan="2"> endométrio </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> SUP-T1 </td><td> P.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygous </td></tr></tbody></table> Tabela 1. MSH2 Linhas Celulares -mutated. A linha celular (nome da amostra), substituição de aminoácidos, a linhagem de origem e a zigosidade são indicados. <table><tbody><tr><td> Nome Amostra </td><td> Aminoácido </td><td colspan="2"> Tecido primário </td><td> Zigosidade </td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> p.R100 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> P.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> CW-2 </td><td> p.Y130fs * 6 </td><td colspan="2"> intestino grosso </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> DU-145 </td><td> P.? </td&gt; <td colspan="2"> próstata </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> GR-ST </td><td> P.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> HCT-116 </td><td> p.S252 * </td><td colspan="2"> intestino grosso </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> IGROV-1 </td><td> p.S505fs * 3 </td><td colspan="2"> ovário </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> MN-60 </td><td> P.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> NCI-SNU-1 </td><td> p.R226 * </td><td colspan="2"> estômago </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> P30-OHK </td><td> P.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> PR-Mel </td><td> P.? </td><td colspan="2"> pele </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> REH </td><td> P.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td&gt; <td> Homozygous </td></tr><tr><td> SK-OV-3 </td><td> p.0? </td><td colspan="2"> ovário </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> SNU-1544 </td><td> p.S2L </td><td colspan="2"> intestino grosso </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> SNU-1746 </td><td> p.E523K </td><td colspan="2"> intestino grosso </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.C233R </td><td colspan="2"> pâncreas </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2"> pâncreas </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> SNU-478 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2"> pâncreas </td><td> Heterozigotos </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Linhas Celulares -mutated MLH1. A linha celular (nome da amostra), substituição de aminoácidos, a linhagem de origem e a zigosidade são indicados.

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Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

A resistência aos medicamentos para a terapêutica visados ​​é generalizada e à necessidade de identificar mecanismos de resistência - antes ou após o início clínico - é fundamental para orientar estratégias de gestão de clínicas alternativas. Aqui, apresentamos um protocolo para casal derivação de linhas resistentes a drogas in vitro com sequenciamento para agilizar a descoberta desses mecanismos.

Implementação de<em&gt; In Vitro</em&gt; Droga de Resistência Ensaios: maximizar o potencial para Descobrindo clinicamente relevantes mecanismos de resistência

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

10.4K visualizações.  H3 Biomedicine.  A resistência aos medicamentos para a terapêutica visados ​​é generalizada e à necessidade de identificar mecanismos de resistência - antes ou após o início clínico - é fundamental para orientar estratégias de gestão de clínicas alternativas. Aqui, apresentamos um protocolo para casal derivação de linhas resistentes a drogas in vitro com sequenciamento para agilizar a descoberta desses mecanismos. 

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Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic response is a key regulator of local blood flow. In isobaric conditions small resistance arteries develop sustained constriction known as myogenic tone (MT), which is a major determinant of systemic vascular resistance (SVR). Hence, ex vivo&#160;pressurized preparations of small resistance arteries are major tools to study microvascular function in near-physiological states. To achieve this, a freshly isolated intact segment of a small resistance artery (diameter ~260 &#956;m) is mounted onto two small glass cannulas and pressurized. These arterial preparations retain most in vivo characteristics and permit assessment of vascular tone in real-time. Here we provide a detailed protocol for assessing vasoactivity in pressurized small resistance mesenteric arteries from rats; these arteries develop sustained vasoconstriction - approximately 25% of maximal diameter - when pressurized at 70 mmHg. These arterial preparations may be used to study the effect of investigational compounds on relationship between intra-arterial pressure and vasoactivity and determine changes in microvascular function in animal models of various diseases.

Pressure myography is used to assess vasoactivity of small arteries that develop sustained constriction when pressurized. This manuscript provides a detailed protocol to assess in isolated segments of small mesenteric arteries from rats, vasoactivity and the effect of intraluminal pressure on vascular diameter.

Avaliando Miogênica Resposta e vasoactividade em artérias mesentéricas de resistência Usando Miografia Pressão

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Medicina

Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell cultures that preserve the genomic profile of the parental tumors, for use in patient specific in vitro and in vivo models, has the potential to revolutionize the preclinical development of new treatments for glioblastoma tailored to the molecular characteristics of each tumor.
Starting with fresh high grade astrocytoma tumors dissociated into single cells, we use the neurosphere assay as an enrichment method for cells presenting cancer stem cell phenotype, including expression of neural stem cell markers, long term self-renewal in vitro, and the ability to form orthotopic xenograft tumors. This method has been previously proposed, and is now in use by several investigators. Based on our experience of dissociating and culturing 125 glioblastoma specimens, we arrived at the detailed protocol we present here, suitable for routine neurosphere culturing of high grade astrocytomas and large scale expansion of tumorigenic cells for preclinical studies. We report on the efficiency of successful long term cultures using this protocol&#160;and suggest affordable alternatives for culturing dissociated glioblastoma cells that fail to grow as neurospheres. We also describe in detail a protocol for preserving the neurospheres 3D architecture for immunohistochemistry. Cell cultures enriched in CSCs, capable of generating orthotopic xenograft models that preserve the molecular signatures and heterogeneity of GBMs, are becoming increasingly popular for the study of the biology of GBMs and for the improved design of preclinical testing of potential therapies.

Protocol for propagation of dissociated high grade glioma surgical specimens in serum-free neurosphere medium to select for cells with cancer stem cell phenotype. For specimens that fail to grow as neurospheres, an alternative protocol is suggested. A paraffin embedding technique for maintaining the 3D neurosphere architecture for immunocytochemistry is described.

Otimização da cultura celular glioma de alto grau a partir de espécimes cirúrgicos para uso em modelos animais clinicamente relevantes e imunoquímica 3D

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell ...

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in sub-Saharan Africa continue to expand, individuals on ART should be closely monitored for the emergence of drug resistance. Surveillance of transmitted drug resistance to track transmission of viral strains already resistant to ART is also critical. Unfortunately, drug resistance testing is still not readily accessible in resource limited settings, because genotyping is expensive and requires sophisticated laboratory and data management infrastructure. An open access genotypic drug resistance monitoring method to manage individuals and assess transmitted drug resistance is described. The method uses free open source software for the interpretation of drug resistance patterns and the generation of individual patient reports. The genotyping protocol has an amplification rate of greater than 95% for plasma samples with a viral load &#62;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The sensitivity decreases significantly for viral loads &#60;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The method described here was validated against a method of HIV-1 drug resistance testing approved by the United States Food and Drug Administration (FDA), the Viroseq genotyping method. Limitations of the method described here include the fact that it is not automated and that it also failed to amplify the circulating recombinant form CRF02_AG from a validation panel of samples, although it amplified subtypes A and B from the same panel.

Drug resistance testing for HIV-1 infected individuals failing antiretroviral therapy (ART) can guide future therapies and improve treatment outcomes. Optimizing individual and population health outcomes in high HIV prevalence but resource-limited settings will ultimately require affordable and accessible drug resistance genotyping and interpretation methods.

Um método de monitoramento acessível HIV-1 Resistência às Drogas para recursos configurações limitadas

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these diseases. Chronic retinal diseases such as retinal oedema or neovascularization usually require multiple intraocular injections to effectively treat the condition. However, the risks associated with these injections increase with repeated delivery of the drug. Therefore, alternative delivery methods need to be established in order to minimize the risks of reinjection. Several other investigations have developed methods to deliver drugs over extended time, through materials capable of releasing chemicals slowly into the eye. In this investigation, we outline the use of Elvax 40W, a copolymer resin, to act as a vehicle for drug delivery to the adult rat retina. The resin is made and loaded with the drug. The drug-resin complex is then implanted into the vitreous cavity, where it will slowly release the drug over time. This method was tested using 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB), a glutamate analogue that blocks the light response of the retina. It was demonstrated that the APB was slowly released from the resin, and was able to block the retinal response by 7 days after implantation. This indicates that slow-release drug delivery using this copolymer resin is effective for treating the retina, and could be used therapeutically with further testing.

This paper details how Elvax 40W can be used as a slow-release method for drug delivery to the adult rat retina. The protocol for preparing, loading, and delivering the drug-resin complex to the eye is described.

De liberação lenta Drug Delivery através Elvax 40W para o Rat Retina: implicações para o tratamento de condições crônicas

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

A Novel<em&gt; In vivo</em&gt; Técnica Gene Transferência e<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaios baseados em células para o Estudo da perda óssea em Distúrbios Osteomusculares

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

Avaliar a eficácia do Cancer Drogas Sensibilização<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

Adapted Resistance Training Improves Strength in Eight Weeks in Individuals with Multiple Sclerosis

Hip weakness is a common symptom affecting walking ability in people with multiple sclerosis (MS). It is known that resistance strength training (RST) can improve strength in individuals with MS, however; it remains unclear the duration of RST that is needed to make strength gains and how to adapt hip strengthening exercises for individuals of varying strength using only resistance bands. This paper describes the methodology to set up and implement an adapted resistance strength training program, using resistance bands, for individuals with MS. Directions for pre- and post-strength tests to evaluate efficacy of the strength-training program are included. Safety features and detailed instructions outline the weekly program content and progression. Current evidence is presented showing that significant strength gains can be made within 8 weeks of starting a RST program. Evidence is also presented showing that resistance strength training can be successfully adapted for individuals with MS of varying strength with little equipment.

Hip weakness is a common symptom affecting walking ability in people with multiple sclerosis. Isolated muscle strengthening is a useful method to target specific weaknesses. This protocol describes a progressive resistance-training program using exercise bands to increase hip muscle strength.

Treinamento da resistência adaptada melhora a força em oito semanas em indivíduos com esclerose múltipla

Hip weakness is a common symptom affecting walking ability in people with multiple sclerosis (MS). It is known that resistance strength training (RST) can ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to hypoxia sensitive organs such as the brain, compensatory circulatory mechanisms help to maintain an adequate oxygen supply. This is mainly achieved by increased cerebral blood flow. Intermittent hypoxia is a commonly seen phenomenon in patients with obstructive sleep apnea. Acute airway obstruction can also result in hypoxia and hypercapnia. Until now, no adequate model has been established to simulate these dynamics in humans. Previous investigations focusing on human hypoxia used inhaled hypoxic gas mixtures. However, the resulting hypoxia was combined with hyperventilation and is therefore more representative of high altitude environments than of apnea. Furthermore, the transferability of previously performed animal experiments to humans is limited and the pathophysiological background of apnea induced physiological changes is poorly understood. In this study, healthy human apneic divers were utilized to mimic clinically relevant hypoxia and hypercapnia during apnea. Additionally, pulse-oximetry and Near Infrared Spectroscopy (NIRS) were used to evaluate changes in cerebral and peripheral oxygen saturation before, during, and after apnea.

Hypoxia simulation in humans has usually been performed by inhaling hypoxic gas mixtures. For this study, apneic divers were used to simulate dynamic hypoxia in humans. Additionally, physiological changes in desaturation and re-saturation kinetics were evaluated with non-invasive tools such as Near-Infrared-Spectroscopy (NIRS) and peripheral oxygenation saturation (SpO2).

Um modelo para simular hipóxia clinicamente relevantes em humanos

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...

A Cell Culture Model of Resistance Arteries

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and signaling processes that can control vascular tone and blood pressure. As it is a projection from either the endothelial or smooth muscle cell, and due to its small size (on average, an area of ~1 &#181;m2), the MEJ is difficult to study in isolation. However, we have developed a cell culture model called the vascular cell co-culture (VCCC) that allows for in vitro MEJ formation, endothelial cell polarization, and dissection of signaling proteins and processes in the vascular wall of resistance arteries. The VCCC has a multitude of applications and can be adapted to suit different cell types. The model consists of two cell types grown on opposite sides of a filter with 0.4 &#181;m pores in which the in vitro MEJs can form. Here we describe how to create the VCCC via plating of cells and isolation of endothelial, MEJ, and smooth muscle fractions, which can then be used for protein isolation or activity assays. The filter with intact cell layers can be fixed, embedded, and sectioned for immunofluorescent analysis. Importantly, many of the discoveries from this model have been confirmed using intact resistance arteries, underscoring its physiological relevance.

A cell culture model of resistance arteries is described, allowing for the dissection of signaling pathways in endothelium, smooth muscle, or between endothelium and smooth muscle (the myoendothelial junction). The selective application of agonists or protein isolation, electron microscopy, or immunofluorescence can be utilized using this cell culture model.

Um modelo de cultura celular de artérias de resistência

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other vessels), and describes techniques for evaluating tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry (LDF) and microvessel density utilizing fluorescently labeled Griffonia simplicifolia (GS1) lectin. Current methods for studying isolated resistance arteries at transmural pressures encountered in vivo and in the absence of parenchymal cell influences provide a critical link between in vivo studies and information gained from molecular reductionist approaches that provide limited insight into integrative responses at the whole animal level. LDF and techniques to selectively identify arterioles and capillaries with fluorescently-labeled GS1 lectin provide practical solutions to enable investigators to extend the knowledge gained from studies of isolated resistance arteries. This paper describes the application of these techniques to gain fundamental knowledge of vascular physiology and pathology in the rat as a general experimental model, and in a variety of specialized genetically engineered &#34;designer&#34; rat strains that can provide important insight into the influence of specific genes on important vascular phenotypes. Utilizing these valuable experimental approaches in rat strains developed by selective breeding strategies and new technologies for producing gene knockout models in the rat, will expand the rigor of scientific premises developed in knockout mouse models and extend that knowledge to a more relevant animal model, with a well understood physiological background and suitability for physiological studies because of its larger size.

This manuscript describes in vitro video microscopy protocols for evaluating vascular function in rat cerebral resistance arteries. The manuscript also describes techniques for evaluating microvessel density with fluorescently labeled lectin and tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry.

Avaliação dos mecanismos de controlo Vascular utilizando a microscopia das artérias de resistência isolada de ratos

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...