WDA is supported by grant funding from NIH-NICHD (5K12HD001097-17) and Cure SMA. SJK is supported by grant funding from NINDS (K08NS067282 and U01NS079163).

Este protocolo foi aprovado pelo e segue as orientações de cuidados de animais e da ética da Ohio State University Medical Center Wexner. 1. Preparação Animal e Anestesia <ol><li> Usar luvas durante o manuseio de ratos. </li><li> Anestesiar ratos com isoflurano inalado e coloque na posição prona. Induzir a anestesia utilizando 3-5% de isoflurano e 1 L por minuto O 2 vazão. Após indução da anestesia, manter a anestesia em 2-3% e 1 L por minuto de O2 caudal. <ol><li> Ajuste O 2 fluxo e percentual isoflurano para anestesia adequada de acordo com estado de doença, idade e taxa de respiração do animal. Animais mais pequenos ou mais fracos podem exigir menos isoflurano para anestesia adequada (isto é, de 1,5 a 2,5% de isoflurano). </li><li> Confirme anestesia adequada, aplicando pressão pata luz hindlimb com um objeto, como uma pinça para demonstrar a falta de resposta de retirada.; </li></ol></li><li> Manter a temperatura a 37 ° C de temperatura de superfície com uma placa de aquecimento termostático como variação na temperatura pode afectar o tamanho e a duração CMAP. </li><li> Aplicar a pomada à base de petróleo veterinário para os olhos para prevenir o ressecamento. Monitorar o nível de anestesia observando taxa de respiração e avaliação para as respostas de retirada seguintes pressão aplicada à almofada do pé através de uma pinça. </li><li> Remover os pêlos da hindlimb a ser estudado usando cortadores. Após remoção dos pêlos do membro posterior (s) a ser estudado, levemente estender os membros posteriores no joelho, sequestre os quadris e apor a superfície de trabalho usando uma fita adesiva (como mostrado na Figura 1). </li><li> Após as gravações e descontinuação da anestesia CMAP e MUNE, não deixar animais sem vigilância até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva animal para a companhia de outros animais até que totalmente recuperado. </li></ol> 2. Recording Setup e Equipamentos <ol><li> Coloque os eletrodos para as gravações CMAP e MUNE como retratado na Figura 1. </li><li> Use dois eletrodos finos anel para os eletrodos de registro. <ol><li> Coloque a (E1) do eléctrodo activo anel sobre a pele que recobre a porção proximal do músculo do gastrocnémio de membro posterior, na articulação do joelho, e o eléctrodo de referência (E2) do anel sobre a pele sobre a porção intermédia do metatarso do pé. </li><li> A fim de reduzir a impedância, revestimento a pele subjacente aos eletrodos de anel com gel para cabelo suficientemente saturar residual e maximizar o contato eletrodo-pele. Evitar a aplicação excessiva de gel eletrodo, pois isso pode causar uma ponte eléctrica entre os eléctrodos e pode evitar uma gravação precisa. </li></ol></li><li> Para a estimulação do nervo ciático no membro posterior proximal, use dois isolados 28 g agulhas monopolares como o cátodo eo ânodo. Inserir o cátodo na região da pata traseira proximal e inserir o anode mais proximalmente no tecido subcutâneo que recobre o sacro. <ol><li> Evite inserir os eletrodos que estimulam excessivamente perto do nervo ciático ou muito profundas que iria diretamente lesão do nervo ciático ou outra estrutura. A figura 1 ilustra a colocação do eletrodo. </li></ol></li><li> Para o eletrodo terra, coloque um eletrodo de superfície descartável no membro posterior contralateral ou cauda. </li></ol> 3. Aquisição de Dados <ol><li> CMAP ciático <ol><li> Obter respostas CMAP ciático, estimulando o nervo ciático com pulsos de onda quadrada de 0,1 ms de duração e intensidade variando de 1-10 mA. </li><li> Adquirir respostas CMAP com o aumento da intensidade do estímulo até que a amplitude da resposta não aumenta mais. Em seguida, a fim de assegurar a estimulação supramáxima, aumentar a estimulação de ~ 120% da intensidade do estímulo utilizado para se obter uma resposta máxima e obter uma resposta adicional. Se não há é aumentar ainda mais in o tamanho CMAP, gravar esta resposta como a CMAP máxima. </li><li> Ficha de linha de base a pico e pico-a-pico amplitudes CMAP em mV (Figura 2). </li></ol></li><li> Média Individual Potencial Unidade de Motor (SMUP) Tamanho e MUNE Cálculo <ol><li> Determine o tamanho médio potencial unidade do motor único (SMUP) com uma técnica de estimulação 1 adicional. Para obter respostas incrementais, entregar estimulação submáxima de duração 0,1 ms a uma frequência de 1 Hz, aumentando a intensidade em 0,03 mA passos para obter as mínimas tudo-ou-nada respostas. Obter a resposta inicial com intensidade do estímulo entre 0,21 mA e 0,70 mA. <ol><li> Se a resposta inicial não ocorrer com uma intensidade de estímulo entre 0,21 mA e 0,70 mA, ajustar a posição do cátodo estimulante mais próximo ou mais distante da posição do nervo ciático na coxa proximal para diminuir ou aumentar a intensidade do estímulo necessário, respectivamente. </li><li> Se o i inicialncremental resposta é obtida com a intensidade do estímulo entre 0,21 mA e 0,70 mA e preenche os critérios indicados abaixo (3.2.2), armazenar e gravar incrementos adicionais com o aumento da intensidade de estímulo de ajuste em passos de 0,03 mA para obter um total de 9 incrementos adicionais que preencham os critérios estabelecidos. </li></ol></li><li> Durante as medições das respostas incrementais, garantir que cada incremento atenda aos seguintes critérios. <ol><li> Assegure-se que o pico inicial negativa das respostas incrementais está alinhado temporalmente dentro do pico negativo da resposta máxima CMAP mostrado como a parte sombreada da ilustração CMAP na Figura 2. </li><li> Certifique-se que cada resposta incremental é estável e sem fracionamento, estabelecida pela observação três respostas duplicadas. Distinguir visualmente as respostas incrementais em tempo real (sobrepõem-se aos incrementos registrados anteriormente). Nota: Cada incremento deverá ser visualmente distintae maior em comparação com a resposta anterior (Figura 3). Análise em tempo real permite o reconhecimento de maior amplitude (incrementais) respostas comparadas com as respostas anteriores, e pequenas mudanças atribuíveis ao ruído de fundo pode ser desconsiderada. Uma vista sobreposta incrementos de 10 é mostrado na Figura 4 (B e D) para ilustrar ainda mais este ponto. </li><li> Depois de confirmar visualmente cada incremento, garantir que a diferença de amplitude medido (confirmado resposta de amplitude da resposta antes = diferença de amplitude) é de pelo menos 25 mV. </li><li> Se o incremento é inferior a 25 mV, e descartar re-medir a resposta. Depois de gravar 10 respostas incrementais, avaliar os incrementos para assegurar que a amplitude de cada resposta periódica indivíduo não é superior a 1/3 da soma de todos os incrementos de dez (isto é, a amplitude total da resposta final). Se esta condição não for atendida, re-medir as respostas incrementais. </li></ol></li><li> Calcular a média dos 10 valores incrementais para dar uma estimativa do potencial de unidade do motor único (SMUP) amplitude média (Figura 3). Nota: A Figura 3 detalha a base do cálculo da média SMUP, mas a amplitude média SMUP pode ser simplesmente calculado dividindo-se toda a amplitude da resposta periódica final pelo número total de incrementos (por exemplo, 10). Exemplo SMUP cálculos individuais (ilustrado na figura 3): SMUP 1 = amplitude pico-a-pico de incremento de 1 SMUP 1 = 0,050 mV SMUP 2 (amplitude de pico-a-pico de incremento 2) = - (amplitude do incremento de pico-a-pico 1) SMUP 2 = 0,150 mV-0.050 mV = 0,100 mV <ol><li> Calcule cada aumento subsequente (até um total de 10), e fazer uma média dos incrementos de dez. </li></ol></li><li> Calcular MUNE dividindo a amplitude máxima CMAP (pico-a-pico) pela amplitude média SMUP (pico-a-pico). (MUNE = CMAP / SMUP média). Em alguns sistemas electrofisiológicas, os incrementos SMUP são medidas em mV Considerando que CMAP é tipicamente fornecida em mV. Quando necessário, converter resultados CMAP e SMUP para unidades similares anteriores ao cálculo MUNE. </li></ol></li></ol>

<ol>
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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+incremental+with+multipoint+MUNE+methods+in+transgenic+ALS+mice.">Comparison of incremental with multipoint MUNE methods in transgenic ALS mice.</a> Muscle &amp; Nerve. 25 (1), 39-42 (2002).</li><li>Shefner, J. M., Cudkowicz, M., Brown, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+unit+number+estimation+predicts+disease+onset+and+survival+in+a+transgenic+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Motor unit number estimation predicts disease onset and survival in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Muscle Nerve. 34 (5), 603-607 (2006).</li><li>Arnold, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+Biomarkers+in+Spinal+Muscular+Atrophy:+Preclinical+Proof+of+Concept.">Electrophysiological Biomarkers in Spinal Muscular Atrophy: Preclinical Proof of Concept.</a> Annals of clinical and translational neurology. 1 (1), 34-44 (2014).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+three+electrophysiological+methods+for+the+assessment+of+disease+status+in+a+mild+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">A comparison of three electrophysiological methods for the assessment of disease status in a mild spinal muscular atrophy mouse model.</a> PloS one. 9 (10), e111428 (2014).</li><li>Srivastava, A. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+muscular+atrophy:+The+development+and+implementation+of+potential+treatments.">Spinal muscular atrophy: The development and implementation of potential treatments.</a> Annals of Neurology. 74 (3), 348-362 (2013).</li><li>Li, J., Sung, M., Rutkove, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiologic+biomarkers+for+assessing+disease+progression+and+the+effect+of+riluzole+in+SOD1+G93A+ALS+mice.">Electrophysiologic biomarkers for assessing disease progression and the effect of riluzole in SOD1 G93A ALS mice.</a> PloS one. 8 (6), e65976-65 (2013).</li><li>Ngo, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+Bayesian+motor+unit+number+estimation+and+histological+measurements+of+motor+neurons+in+wild-type+and+SOD1+(G93A)+mice.">The relationship between Bayesian motor unit number estimation and histological measurements of motor neurons in wild-type and SOD1 (G93A) mice.</a> Clin Neurophysiol. 123 (10), 2080-2091 (2012).</li><li>Shefner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+MUNE+studies+in+animal+models+of+motor+neuron+disease.">Recent MUNE studies in animal models of motor neuron disease.</a> Supplements to Clinical neurophysiology. 60, 203-208 (2009).</li><li>Souayah, N., Potian, J. G., Garcia, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+unit+number+estimate+as+a+predictor+of+motor+dysfunction+in+an+animal+model+of+type+1+diabetes.">Motor unit number estimate as a predictor of motor dysfunction in an animal model of type 1 diabetes.</a> American journal of physiology Endocrinology and metabolism. 297 (3), E602-E608 (2009).</li><li>Zhou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+comparison+in+monitoring+disease+progression+of+G93A+mouse+model+of+ALS.">A method comparison in monitoring disease progression of G93A mouse model of ALS.</a> Amyotrophic lateral sclerosis: official publication of the World Federation of Neurology Research Group on Motor Neuron Diseases. 8 (6), 366-3672 (2007).</li><li>Feng, X. H., Yuan, W., Peng, Y., Ss Liu, M., Cui, L. 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The authors have nothing to disclose.

MUNE e CMAP são medidas clinicamente relevantes freqüentemente utilizados em estudos de investigação e no monitoramento de pacientes com doenças neuromusculares, como a ALS e atrofia muscular espinhal (AME) 9, 10. Por exemplo, no SMA, CMAP e MUNE correlacionam-se bem com a idade, gravidade e clínica medidas de função 10-14. Ambas as medidas são minimamente invasivos e permitir a avaliação da função longitudinalmente no mesmo indivíduo. É importante ressaltar que estas medidas não se pode medir a ativação ou recrutamento da unidade motora por neurônios do córtex motor, mas eles fornecem uma avaliação clinicamente relevante da integridade do neurônio motor eo seu homólogo funcional, a unidade do motor. Os modelos animais de doença neuromuscular são críticas para a compreensão dos mecanismos patogénicos da doença humana e para o desenvolvimento pré-clínico de agentes terapêuticos potencialmente eficazes. A capacidade de traduzir medidas de resultados e biomarcadores que podem serutilizado em várias espécies podem facilitar e acelerar a concretização dos resultados pré-clínicos promissores para testes clínicos em humanos. Vários grupos já utilizou as duas medidas eletrofisiológicas e de força (mecânicos) para estimar função unidade do motor em modelos do rato 2-4, 15-22. Devido à relativa complexidade das medidas, temos refinado estas técnicas em um formato visual para permitir o uso mais disseminado e implementação em camundongos. O formato de vídeo de demonstração e instrução, permite principais etapas do procedimento a ser destacado e potenciais armadilhas a serem abordados. A aplicação destas técnicas para testes pré-clínicos de terapias potenciais em doenças motoras neuronais pode melhorar a tradução de terapias putativos dos ratos para a doença humana. Há vários passos críticos no processo de aquisição das respostas CMAP e MUNE. A colocação do eletrodo de gravação adequada e consistente e contato suficiente com o eletrodo traseiramembro são críticos para a medição da amplitude e reprodutível para diminuir o ruído de fundo. Portanto, um contacto estreito entre traseira da pele do membro e eletrodos devem ser consistentemente confirmado. Descobrimos que eletrodos de superfície oferecem mais consistentes gravações CMAP e MUNE do que eletrodos de agulha. Devido aos tecidos subcutâneos muito finos, pequenos movimentos da superfície de gravação agulha pode levar a grande variação na amplitudes CMAP. Além disso, a natureza mais invasiva de eletrodos de agulha não é o ideal para os ratos neonatais ou estudos longitudinais devido ao rompimento potencial muscular e lesões. Uma desvantagem potencial de eléctrodo de superfície, gravações não selectivos relaciona-se com a possibilidade de resolução fenótipo enfraquecidas se um músculo em particular é mais ou menos envolvido em comparação com outro, e esta tem sido relatada em um modelo de ratinho de ALS 21. Adquirir o tamanho médio SMUP é tecnicamente mais difícil em comparação com a CMAP. Devido às menores responsTamanho E (na gama de mais do que mV mV) o ruído de fundo pode ser mais problemático. O ruído de fundo pode ser reduzido, ajustando o eletrodo terra, cátodo, ânodo, e verificando outros equipamentos eléctricos perto da configuração experimental. Uma gaiola de Faraday, normalmente utilizados para aplicações de electrofisiologia intracelulares, não é necessária. A determinação visual das respostas SMUP individuais é a habilidade mais difícil de adquirir e requer prática para resultados consistentes com repetibilidade adequada. É importante assegurar que as SMUPs que estão a ser gravados iniciar dentro da duração da resposta máxima CMAP. Nós definimos critérios para a aceitação de respostas incrementais individuais para tornar esse processo mais simples de executar e para aumentar a confiabilidade intra e inter-avaliadores. Uma desvantagem potencial da técnica MUNE incrementais inclui a possibilidade de superestimar o número de unidades motoras funcionais devido a alternância de motounidades r. Nós usamos uma técnica semelhante para Shefner et al. em que cada resposta deve ser visto de forma reprodutível um total de 3 vezes para reduzir o impacto deste fenómeno 3. Em nossa experiência, os sistemas electrodiagnostic clínicos são otimizados para os estudos aqui descritos devido à ergonomia melhorada interface do sistema examinador-electrodiagnostic permitindo facilidade de controle. O sistema de dois canais, utilizados no nosso laboratório está equipado com dois canais não comutado amplificador usando um amplificador com 24 bits conversor analógico para digital e uma taxa de amostragem de 48 kHz por canal. Ganho de Hardware pode ser ajustado de 10nV a 100 mV / divisão. O filtro de baixa freqüência tem um alcance de 0,2 Hz-5 kHz, e as configurações de filtro de alta freqüência variar de 30 Hz-10 kHz. Um estimulador de corrente constante é usada (intensidade: 0-100 mA; duração: 0,02-1 ms). A maioria dos sistemas clínicos têm características apropriadas semelhantes e pode ser ajustado para gravar adequadamente CMAP e MUNE respostas. UMAdditionally, sondas electrofisiológicos padrão podem ser montadas adequadamente para gravar e CMAP MUNE, mas a interface pode necessitar de ser ajustada para facilitar o ajuste da estimulação e a rápida identificação de CMAP SMUP e respostas. Temos anteriormente utilizadas as técnicas de CMAP e MUNE descrito aqui para permitir a avaliação rápida e reprodutível do ciático muscular inervado do membro posterior em ratos durante o período pós-natal precoce para a idade adulta 5. Estas técnicas permitem a avaliação em modelos do rato quando o teste comportamental para a função motora não é viável ou é menos confiável. A aplicação desta técnica para ratos neonatal facilita o estudo do desenvolvimento da unidade motora e tem o potencial para expandir nossa compreensão da inervação do neurônio motor e poda. Por exemplo, demonstramos que o número de unidades motoras funcionais gravados com MUNE irá aumentar durante a poda de polyneuronal a inervação mononeuronal durante as duas primeiras semanass de vida em ratos neonatal 5. A capacidade para testar ratinhos durante longos períodos de tempo com esta técnica presta-se para o estudo da resposta da unidade motora para a lesão do nervo periférico, distúrbios neuromusculares hereditárias e envelhecimento.

Número da unidade Motor estimativa (MUNE) foi originalmente descrito por McComas et al. mais de três décadas atrás 1. A técnica original era uma modificação da técnica de gravação do potencial de ação muscular composto (CMAP), que empregou um aumento gradual de estimulação para obter incrementos submáximas. Estes incrementos foram somados e média para determinar um tamanho estimado de um potencial de unidade único motor (SMUP). Esta foi dividida em tamanho a resposta CMAP para estimar o número de unidades motoras que inervam o músculo a ser testado. Na sequência da descrição original, numerosas variações e com as duas reacções electrofisiológicas e força medições incrementais (mecânicos) têm sido utilizados em ambos os estudos humanos e modelos animais 2. A técnica de MUNE foi modificado pela Shefner e colegas para investigar modelos de ratos com Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS) 3, 4. Na descrição atual, detalhamos Simplifmodificações IED do MUNE técnicas que são rápidos para executar. Importante, CMAP e MUNE permitir medidas de confiança em ambos os ratos recém-nascidos e adultos 5-8. Indivíduos experientes podem executar essas medidas em 10-20 min por animal, e medidas repetidas são viáveis ​​que permite a aquisição de dados longitudinais 5. Nos estudos atuais, que empregam um sistema electrodiagnostic clínica. Em nossa experiência, os sistemas electrodiagnostic clínicos são otimizados para a captura rápida e eficiente de dados eletrofisiológicos in vivo, plataformas eletrofisiológicos no entanto padrão pode facilmente ser adaptado para esta aplicação.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pro trimmer Pet Grooming Kit</td>
			<td>Oster</td>
			<td>078577-010-003</td>
			<td>clippers for hair removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy T2 EMG system</td>
			<td>Natus Neurology</td>
			<td>Model no longer available</td>
			<td>portable electrodiagnostic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monopolar needles 28 gauge</td>
			<td>Teca</td>
			<td>017K121</td>
			<td>cathode and anode stimulating electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpine Biomed Digital Ring Electrode with twisted wires and 1.5 mm TP connectors.</td>
			<td>Alpine Biomed</td>
			<td>9013S0312</td>
			<td>recording electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helping Hands alligator clip with iron base</td>
			<td>Radio Shack</td>
			<td>64-079</td>
			<td>Maintaining recording electrode placement&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra 360 Electrode Gel&#160;</td>
			<td>Parker Laboratories</td>
			<td>9013G5012</td>
			<td>applied to reduce skin impedance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoject curved tip irrigating syringe</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>81412012</td>
			<td>utilized for application of electrode gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMG needle cable</td>
			<td>Teca</td>
			<td>902-RLC-TP&#160;</td>
			<td>to connect monopolar electrodes to electrodiagnostic stimulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 2&#34; x 2&#34; Electrode or similar trimmed as needed</td>
			<td>Carefusion</td>
			<td>019-415000&#160;</td>
			<td>ground electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Heating Plate with built-in RTD sensor, 15x10cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>61830</td>
			<td>warming plate used with animal temperature controller to transmit heat to animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone pad for use with ATC2000</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503573</td>
			<td>conductive removable pad to cover warming plate for easy cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal temperature controller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>ATC2000</td>
			<td>low noise animal heating system for maintaining animal temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veterinarian petroleum-based ophthalmic ointment&#160;</td>
			<td>Puralube</td>
			<td>26870</td>
			<td>applied during anesthesia to avoid corneal injury</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological motor unit number estimation (mune) measuring compound muscle action potential (cmap) in mouse hindlimb muscles

Compound muscle action potential (CMAP) and motor unit number estimation (MUNE) are electrophysiological techniques that can be used to monitor the functional status of a motor unit pool in vivo. These measures can provide insight into the normal development and degeneration of the neuromuscular system. These measures have clear translational potential because they are routinely applied in diagnostic and clinical human studies. We present electrophysiological techniques similar to those employed in humans to allow recordings of mouse sciatic nerve function. The CMAP response represents the electrophysiological output from a muscle or group of muscles following supramaximal stimulation of a peripheral nerve. MUNE is an electrophysiological technique that is based on modifications of the CMAP response. MUNE is a calculated value that represents the estimated number of motor neurons or axons (motor control input) supplying the muscle or group of muscles being tested. We present methods for recording CMAP responses from the proximal leg muscles using surface recording electrodes following the stimulation of the sciatic nerve in mice. An incremental MUNE technique is described using submaximal stimuli to determine the average single motor unit potential (SMUP) size. MUNE is calculated by dividing the CMAP amplitude (peak-to-peak) by the SMUP amplitude (peak-to-peak). These electrophysiological techniques allow repeated measures in both neonatal and adult mice in such a manner that facilitates rapid analysis and data collection while reducing the number of animals required for experimental testing. Furthermore, these measures are similar to those recorded in human studies allowing more direct comparisons.

As técnicas de CMAP e MUNE descrito neste relatório permitem o registo da função neuromuscular dos músculos dos membros posteriores ciáticos inervado utilizando a colocação do eléctrodo minimamente invasiva (figura 1). Supramáxima CMAP tamanho, o que representa a produção total de um grupo muscular, pode ser descrito utilizando os parâmetros de amplitude e área (Figura 2), no entanto, nos métodos correntes, usamos amplitude para quantificar a CMAP e os tamanhos SMUP. Uma vez que as medidas de resposta CMAP summated despolarização das fibras musculares dentro de um músculo, patologia em qualquer lugar do neurónio motor para a fibra muscular pode resultar na redução do tamanho CMAP. Portanto, CMAP dá uma excelente medida do estado funcional total. Como esperado, o tamanho CMAP irá aumentar durante o desenvolvimento 5. Devido a mudanças compensatórias que podem ocorrer após a desnervação (ou seja, garantia de germinação), tamanho CMAP podem ser mantidas apesar processos de neur do motorou perda axonal motora. Portanto, a técnica de MUNE é necessário para determinar o neurónio motor axon entrada ou ao músculo ou grupo de músculos que estão sendo testadas. Gravação de incrementos individuais (Figura 3) permite estimar a produção média de unidades motoras individuais (tamanho SMUP) para dar informações mais detalhadas sobre o estado funcional das unidades motoras. CMAP MUNE e pode ser utilizado para medir a função neuromuscular em vários modelos de rato de doença neuromuscular. Na Figura 4, conclusões de um rato controle de adultos e um rato adulto 11 semanas após esmagamento do nervo ciático são contrastados. Na sequência de esmagamento do nervo ciático, MUNE é severamente reduzida a 50 unidades motoras funcionais estimadas em comparação com resultados normais de 278 unidades motoras funcionais no rato controle. Em contraste, a amplitude de CMAP no animal esmagado (39,6 mV linha de base-a-pico, 74,9 mV pico-a-pico) mostra apenas uma redução ligeira em comparação com o controlo (49,0 mV a linha de base--Pico, 84,2 mV pico-a-pico), devido à garantia de germinação. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/52899/52899fig1.jpg" /> Figura 1. Colocação de eletrodos. O preto (E1) eletrodo &quot;ativo&quot; (A) e vermelha (E2) eletrodo &quot;referência&quot; de gravação (B) são colocadas sobre o gastrocnêmio na porção proximal do gastrocnêmio no joelho. O estimulante cátodo (preto) (C) e o ânodo (vermelho) (D) são inseridos subcutaneamente proximal para os eléctrodos de registo para gerar respostas distais. Um eletrodo de disco descartável (D) é colocado no membro, cauda ou sacro posterior como um terreno para minimizar artefato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52899/52899fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 2. Composto potencial de acção do músculo. Na foto é uma ilustração de uma resposta representativa CMAP. (A) A amplitude da linha de base-a-pico é medida a partir da linha de base isoeléctrico para o pico negativo inicial (tensão negativa é representado acima da linha de base). ( B) A amplitude pico-a-pico é medida a partir da tensão de pico negativo para pico de voltagem positiva. A área a cinzento indica a área de pico negativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52899/52899fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52899/52899fig3.jpg" /> Figura 3. Respostas incrementais. Duas respostas incrementais representativos são mostrados sobrepostos e em Isolação. Para amplitudes de cálculo MUNE de cada incremento são medidos pico-a-pico. Incremento # 1 é a primeira tudo-ou-nada resposta registada e representa um potencial única unidade motora (SMUP). Cada incremento subsequente (# 2-10) representa um aumento quantal sobreposta sobre a resposta anterior. Portanto, para obter as amplitudes SMUP para incrementos de 2-10, a amplitude da resposta anterior é subtraído da amplitude do incremento obtido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52899/52899fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52899/52899fig4.jpg" /> Figura 4. Exemplo ciático CMAP e MUNE. (A) potencial de ação muscular composto ciático (CMAP) em um adulto (6 meses de idade) do mouse controle com amplitude da linha de base a pico de 49,0 mV e pico-a-amplitude do pico de 84,2 mV. Sensibilidade da tela = 10 mV por divisão e duração ecrã 10 ms. (B) Dez correspondentes respostas incrementais (no rato controle) com amplitude total de 3,028 mV são divididos por 10 para determinar o tamanho médio SMUP (0,3028 mV). Sensibilidade da tela = 0,5 mV e velocidade de varredura de 1 ms por divisão. Calculado MUNE = 278 (MUNE = CMAP / SMUP média (84,2 mV / 0,3028 mV)) (C) ciático CMAP 11 semanas seguintes esmagamento do nervo isquiático de um rato adulto (6 meses de idade), mostrando ligeira redução da amplitude da linha de base a pico ( 39,6 mV) e a amplitude pico-a-pico (74,9 mV). Sensibilidade da tela = 10 mV por divisão e velocidade de varredura de 1 ms por divisão. (D) Ten correspondente respostas incrementais (no rato com esmagamento do nervo), com amplitude total do pico-a-pico de 14,923 mV dividido por 10 para obter uma SMUP média tamanho de 1,4923 mV. Sensibilidade da tela = 2 mV por divisão e uma velocidade de varredura de 1 ms por divisão. Calculado MUNE = 50 (MUNE = CMAP/ SMUP média (74,9 mV / 1,4923 mV)). (** Observe a sensibilidade diferente para as respostas incrementais do mouse esmagamento ciático). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52899/52899fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Electrophysiological Motor Unit Number Estimation MUNE Measuring Compound Muscle Action Potential CMAP in Mouse Hindlimb Muscles

Nós apresentamos protocolos que permitem refinados no monitoramento vivo da função motor no mouse. Técnicas para medir o potencial de ação muscular composto (CMAP) eo número de unidade motora de estimativa (MUNE) nos músculos dos membros posteriores do mouse inervados pelo nervo ciático são descritos.

Eletrofisiológico Unidade Motor Número Estimação (MUNE) Medição Potencial Composto Muscle Ação (CMAP) nos músculos dos membros posteriores Rato

Compound muscle action potential (CMAP) and motor unit number estimation (MUNE) are electrophysiological techniques that can be used to monitor the ...

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Education

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JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Behavior

Unit 1

Electrophysiological Motor Unit Number Estimation (MUNE) Measuring Compound Muscle Action Potential (CMAP) in Mouse Hindlimb Muscles

Muscle Tissue

SCIENTISTS IN ACTION

20.9K visualizações.  The Ohio State University Wexner Medical Center.  Nós apresentamos protocolos que permitem refinados no monitoramento vivo da função motor no mouse. Técnicas para medir o potencial de ação muscular composto (CMAP) eo número de unidade motora de estimativa (MUNE) nos músculos dos membros posteriores do mouse inervados pelo nervo ciático são descritos. 

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Inchworming: A Novel Motor Stereotypy in the BTBR T+ Itpr3tf/J Mouse Model of Autism

Autism Spectrum Disorder (ASD) is a behaviorally defined neurodevelopmental disorder characterized by decreased reciprocal social interaction, abnormal communication, and repetitive behaviors with restricted interest. As diagnosis is based on clinical criteria, any potentially relevant rodent models of this heterogeneous disorder should ideally recapitulate these diverse behavioral traits. The BTBR T+ Itpr3tf/J (BTBR) mouse is an established animal model of ASD, displaying repetitive behaviors such as increased grooming, as well as cognitive inflexibility. With respect to social interaction and interest, the juvenile play test has been employed in multiple rodent models of ASD. Here, we show that when BTBR mice are tested in a juvenile social interaction enclosure containing sawdust bedding, they display a repetitive synchronous digging motion. This repetitive motor behavior, referred to as &#34;inchworming,&#34; was named because of the stereotypic nature of the movements exhibited by the mice while moving horizontally across the floor. Inchworming mice must use their fore- and hind-limbs in synchrony to displace the bedding, performing a minimum of one inward and one outward motion. Although both BTBR and C56BL/6J (B6) mice exhibit this behavior, BTBR mice demonstrate a significantly higher duration and frequency of inchworming and a decreased latency to initiate inchworming when placed in a bedded enclosure. We conclude that this newly described behavior provides a measure of a repetitive motor stereotypy that can be easily measured in animal models of ASD.

Inchworming: A Novel Motor Stereotypy in the BTBR T+ Itpr3tf/J Mouse Model of Autism

Inchworming is a highly repetitive synchronous digging motion displayed by BTBR T+ Itpr3tf/J (BTBR) mice when placed in a testing cage with sufficient sawdust bedding. The procedure is a modification of the juvenile social interaction protocol and is used here to assess repetitive motor stereotypies relevant to Autism Spectrum Disorder.

Inchworming: A Novel Motor Estereotipia no BTBR<em&gt; T<sup&gt; +</sup&gt; Itpr3<sup&gt; Tf</sup</em&gt; / J Rato modelo de autismo

Autism Spectrum Disorder (ASD) is a behaviorally defined neurodevelopmental disorder characterized by decreased reciprocal social interaction, abnormal ...

Comportamento

Corticospinal Excitability Modulation During Action Observation

This study used the transcranial magnetic stimulation/motor evoked potential (TMS/MEP) technique to pinpoint when the automatic tendency to mirror someone else's action becomes anticipatory simulation of a complementary act. TMS was delivered to the left primary motor cortex corresponding to the hand to induce the highest level of MEP activity from the abductor digiti minimi (ADM; the muscle serving little finger abduction) as well as the first dorsal interosseus (FDI; the muscle serving index finger flexion/extension) muscles. A neuronavigation system was used to maintain the position of the TMS coil, and electromyographic (EMG) activity was recorded from the right ADM and FDI muscles. Producing original data with regard to motor resonance, the combined TMS/MEP technique has taken research on the perception-action coupling mechanism a step further. Specifically, it has answered the questions of how and when observing another person's actions produces motor facilitation in an onlooker's corresponding muscles and in what way corticospinal excitability is modulated in social contexts.

Single-pulse transcranial magnetic stimulation over the primary motor cortex, neuronavigation, and registration of electromyographic activity of hand muscles were used in this study to explore corticospinal excitability while participants were observing action sequences.

Modulação de excitabilidade corticospinal durante a observação de ação

This study used the transcranial magnetic stimulation/motor evoked potential (TMS/MEP) technique to pinpoint when the automatic tendency to mirror someone ...

Methods to Explore the Influence of Top-down Visual Processes on Motor Behavior

Kinesthetic awareness is important to successfully navigate the environment. When we interact with our daily surroundings, some aspects of movement are deliberately planned, while others spontaneously occur below conscious awareness. The deliberate component of this dichotomy has been studied extensively in several contexts, while the spontaneous component remains largely under-explored. Moreover, how perceptual processes modulate these movement classes is still unclear. In particular, a currently debated issue is whether the visuomotor system is governed by the spatial percept produced by a visual illusion or whether it is not affected by the illusion and is governed instead by the veridical percept. Bistable percepts such as 3D depth inversion illusions (DIIs) provide an excellent context to study such interactions and balance, particularly when used in combination with reach-to-grasp movements. In this study, a methodology is developed that uses a DII to clarify the role of top-down processes on motor action, particularly exploring how reaches toward a target on a DII are affected in both deliberate and spontaneous movement domains.

It is unclear how top-down signals from the ventral visual stream affect movement. We developed a paradigm to test motor behavior towards a target on a 3D depth inversion illusion. Significant differences are reported in both deliberate, goal-directed movements and automatic actions under illusory and veridical viewing conditions.

Métodos para pesquisar a influência de cima para baixo processos visuais em Comportamento Motor

Kinesthetic awareness is important to successfully navigate the environment. When we interact with our daily surroundings, some aspects of movement are ...

Irrelevant Stimuli and Action Control: Analyzing the Influence of Ignored Stimuli via the Distractor-Response Binding Paradigm

Selection tasks in which simple stimuli (e.g. letters) are presented and a target stimulus has to be selected against one or more distractor stimuli are frequently used in the research on human action control. One important question in these settings is how distractor stimuli, competing with the target stimulus for a response, influence actions. The distractor-response binding paradigm can be used to investigate this influence. It is particular useful to separately analyze response retrieval and distractor inhibition effects. Computer-based experiments are used to collect the data (reaction times and error rates). In a number of sequentially presented pairs of stimulus arrays (prime-probe design), participants respond to targets while ignoring distractor stimuli. Importantly, the factors response relation in the arrays of each pair (repetition vs. change) and distractor relation (repetition vs. change) are varied orthogonally. The repetition of the same distractor then has a different effect depending on response relation (repetition vs. change) between arrays. This result pattern can be explained by response retrieval due to distractor repetition. In addition, distractor inhibition effects are indicated by a general advantage due to distractor repetition. The described paradigm has proven useful to determine relevant parameters for response retrieval effects on human action.

The distractor-response binding paradigm is described. It can be used to shed light on the influence irrelevant stimuli, competing with targets for a response, can have on human action. Both response retrieval effects and distractor inhibition effects can be analyzed within the paradigm.

Estímulos irrelevantes e Controle Ação: analisar a influência da Ignorado estímulos através do distrator-Resposta Encadernação Paradigm

Selection tasks in which simple stimuli (e.g. letters) are presented and a target stimulus has to be selected against one or more distractor stimuli are ...

The Modified Hole Board - Measuring Behavior, Cognition and Social Interaction in Mice and Rats

This protocol describes the modified hole board (mHB), which combines features from a traditional hole board and open field and is designed to measure multiple dimensions of unconditioned behavior in small laboratory mammals (e.g., mice, rats, tree shrews and small primates). This paradigm is a valuable alternative for the use of a behavioral test battery, since a broad behavioral spectrum of an animal&#8217;s behavioral profile can be investigated in one single test.
The apparatus consists of a box, representing the &#8216;protected&#8217; area, separated from a group compartment. A board, on which small cylinders are staggered in three lines, is placed in the center of the box, representing the &#8216;unprotected&#8217; area of the set-up. The cognitive abilities of the animals can be measured by baiting some cylinders on the board and measuring the working and reference memory. Other unconditioned behavior, such as activity-related-, anxiety-related- and social behavior, can be observed using this paradigm. Behavioral flexibility and the ability to habituate to a novel environment can additionally be observed by subjecting the animals to multiple trials in the mHB, revealing insight into the animals&#8217; adaptive capacities.
Due to testing order effects in a behavioral test battery, na&#239;ve animals should be used for each individual experiment. By testing multiple behavioral dimensions in a single paradigm and thereby circumventing this issue, the number of experimental animals used is reduced. Furthermore, by avoiding social isolation during testing and without the need to food deprive the animals, the mHB represents a behavioral test system, inducing if any, very low amount of stress.

This protocol describes the modified hole board, which is a behavioral test set-up that comprises the characteristics of an open field and a traditional hole board. This set-up enables the differential analysis of unconditioned behavior of small laboratory mammals as well as the analysis of cognitive abilities.

The Hole Board Modificado - Medir Comportamento, Cognição e Interação Social em camundongos e ratos

This protocol describes the modified hole board (mHB), which combines features from a traditional hole board and open field and is designed to measure ...

The "Motor" in Implicit Motor Sequence Learning: A Foot-stepping Serial Reaction Time Task

This protocol describes a modified serial reaction time (SRT) task used to study implicit motor sequence learning. Unlike the classic SRT task that involves finger-pressing movements while sitting, the modified SRT task requires participants to step with both feet while maintaining a standing posture. This stepping task necessitates whole body actions that impose postural challenges. The foot-stepping task complements the classic SRT task in several ways. The foot-stepping SRT task is a better proxy for the daily activities that require ongoing postural control, and thus may help us better understand sequence learning in real-life situations. In addition, response time serves as an indicator of sequence learning in the classic SRT task, but it is unclear whether response time, reaction time (RT) representing mental process, or movement time (MT) reflecting the movement itself, is a key player in motor sequence learning. The foot-stepping SRT task allows researchers to disentangle response time into RT and MT, which may clarify how motor planning and movement execution are involved in sequence learning. Lastly, postural control and cognition are interactively related, but little is known about how postural control interacts with learning motor sequences. With a motion capture system, the movement of the whole body (e.g., the center of mass (COM)) can be recorded. Such measures allow us to reveal the dynamic processes underlying discrete responses measured by RT and MT, and may aid in elucidating the relationship between postural control and the explicit and implicit processes involved in sequence learning. Details of the experimental set-up, procedure, and data processing are described. The representative data are adopted from one of our previous studies. Results are related to response time, RT, and MT, as well as the relationship between the anticipatory postural response and the explicit processes involved in implicit motor sequence learning.

The &quot;Motor&quot; in Implicit Motor Sequence Learning: A Foot-stepping Serial Reaction Time Task

We introduce the foot-stepping serial reaction time (SRT) task. This modified SRT task, complementing the classic SRT task that involves only finger-pressing movement, better approximates daily sequenced activities and allows researchers to study the dynamic processes underlying discrete response measures and disentangle the explicit process operating in implicit sequence learning.

O "Motor" em Motor implícita sequência de aprendizagem: uma reação Serial depuração pé tempo tarefa

This protocol describes a modified serial reaction time (SRT) task used to study implicit motor sequence learning. Unlike the classic SRT task that ...

A Simple and Low-cost Assay for Measuring Ambulation in Mouse Models of Muscular Dystrophy

Measuring functional outcomes in the treatment of muscular dystrophy is an essential aspect of preclinical testing. The assessment of voluntary ambulation in mouse models is a non-invasive and reproducible activity assay that is directly analogous to measures of patient ambulation such as the 6-minute walk test and related mobility scores. Many common methods for testing mouse ambulation speed and distance are based on the open field test, where an animal&#39;s free movement within an arena is measured over time. One major downside to this approach is that commercial software and equipment for high-resolution motion tracking is expensive and may require transferring mice to specialized facilities for testing. Here, we describe a low-cost, video-based system for measuring mouse ambulation that utilizes free and open-source software. Using this protocol, we demonstrate that voluntary ambulation in the dystrophin-null mdx mouse model for Duchenne muscular dystrophy (DMD) is decreased relative to wild-type mouse activity. In mdx mice expressing the utrophin transgene, these activity deficits are not observed and the total distance traveled is indistinguishable from wild-type mice. This method is effective for measuring changes in voluntary ambulation associated with dystrophic pathology, and provides a versatile platform that can be readily adapted to diverse research settings.

This protocol describes a flexible, low-cost system for measuring mouse ambulation in an open field activity assay. We show that a 6-minute ambulation assay based on this system detects a decrease in voluntary movement in mdx mice, and accurately distinguishes improvement in a muscle-specific rescue of these animals.

Um ensaio simples e de baixo custo para medir a deambulação em modelos de Mouse de Distrofia Muscular

Measuring functional outcomes in the treatment of muscular dystrophy is an essential aspect of preclinical testing. The assessment of voluntary ambulation ...

Measuring Active and Passive Tameness Separately in Mice

Domesticated animals such as dogs and laboratory mice show a high level of tameness, which is important for humans to handle them easily. Tameness has two behavioral components: a reluctance to avoid humans (passive tameness) and a motivation to approach humans (active tameness). To quantify these components in mice, we previously developed behavioral tests for active tameness, passive tameness, and the willingness to stay on a human hand, each designed to be completed within 3 min. The data obtained were used for selective breeding, with a large number of mice analyzed per generation. The active tameness test measures the movement of the mouse toward a human hand and the contact it engages in. The passive tameness test measures the duration of time that a mouse tolerates human touch. In the stay-on-hand test, a mouse is placed on a human hand and touched slowly using the thumb of that hand; the duration of time that the animal remains on the hand is measured. Here, we describe the test set-up and apparatus, explain the procedures, and discuss the appropriate data analysis. Finally, we explain how to interpret the results.

Tameness in animals includes a reduction of avoidance responses to humans (passive tameness) and an increase in active approaches to humans (active tameness). Here, we describe detailed protocols for three behavioral tests (active tameness, passive tameness, and stay-on-hand tests) to separately measure the active and passive tameness of mice.

Medição de ativa e passiva domesticidade separadamente em ratos

Domesticated animals such as dogs and laboratory mice show a high level of tameness, which is important for humans to handle them easily. Tameness has two ...

Continuous Noninvasive Measuring of Crayfish Cardiac and Behavioral Activities

A crayfish is a pivotal aquatic organism that serves both as a practical biological model for behavioral and physiological studies of invertebrates and as a useful biological indicator of water quality. Even though crayfish cannot directly specify the substances that cause water quality deterioration, they can immediately (within a few seconds) warn humans of water quality deterioration via acute changes in their cardiac and behavioral activities.
In this study, we present a noninvasive method that is simple enough to be implemented under various conditions due to a combination of simplicity and reliability in one model.
This approach, in which the biological organisms are implemented into environmental evaluation processes, provides a reliable and timely alarm for warning of and preventing acute water deterioration in an ambient environment. Therefore, this noninvasive system based on crayfish physiological and ethological parameter recordings was investigated for the detection of changes in an aquatic environment. This system is now applied at a local brewery for controlling&#160;quality of the water used for beverage production, but it can be used at any water treatment and supply facility for continuous, real-time water quality evaluation and for regular laboratory investigations of crayfish cardiac physiology and behavior.

This article presents a noninvasive biomonitoring system for the continuous recording and analyses of crayfish cardiac and locomotor activities. This system consists of a near-infrared optical sensor, a video-tracking module, and software for evaluating crayfish heartbeats that reflects its physiological condition and characterizes crayfish behavior during heartbeat fluctuations.

Medição não invasiva contínua das atividades cardíaca e comportamental de lagostins

A crayfish is a pivotal aquatic organism that serves both as a practical biological model for behavioral and physiological studies of invertebrates and as ...

Measuring Skeletal Muscle Thermogenesis in Mice and Rats

Skeletal muscle thermogenesis provides a potential avenue for better understanding metabolic homeostasis and the mechanisms underlying energy expenditure. Surprisingly little evidence is available to link the neural, myocellular, and molecular mechanisms of thermogenesis directly to measurable changes in muscle temperature. This paper describes a method in which temperature transponders are utilized to retrieve direct measurements of mouse and rat skeletal muscle temperature.
Remote transponders are surgically implanted within the muscle of mice and rats, and the animals are given time to recover. Mice and rats must then be repeatedly habituated to the testing environment and procedure. Changes in muscle temperature are measured in response to pharmacological or contextual stimuli in the home cage. Muscle temperature can also be measured during prescribed physical activity (i.e., treadmill walking at a constant speed) to factor out changes in activity as contributors to the changes in muscle temperature induced by these stimuli.
This method has been successfully used to elucidate mechanisms underlying muscle thermogenic control at the level of the brain, sympathetic nervous system, and skeletal muscle. Provided are demonstrations of this success using predator odor (PO; ferret odor) as a contextual stimulus and injections of oxytocin (Oxt) as a pharmacological stimulus, where predator odor induces muscle thermogenesis, and Oxt suppresses muscle temperature. Thus, these datasets display the efficacy of this method in detecting rapid changes in muscle temperature.

Mice and rats are surgically implanted with remote temperature transponders and then habituated to the testing environment and procedure. Changes in muscle temperature are measured in response to pharmacological or contextual stimuli in the home cage or during prescribed physical activity (i.e., treadmill walking at a constant speed).

Medindo a termogênese do músculo esquelético em camundongos e ratos

Skeletal muscle thermogenesis provides a potential avenue for better understanding metabolic homeostasis and the mechanisms underlying energy expenditure. ...