Gostaríamos de agradecer a equipe administrativa do CIBIO (Universidade de Trento) e Instituto de Neurociências CNR para obter assistência. Giovanni Provenzano é apoiado por uma bolsa de pós-doutoramento da Fundação Veronesi (Milão, Itália). Este trabalho foi financiado pelo Ministério italiano da Universidade e da Pesquisa (PRIN 2008 bolsa # 200894SYW2_002 e PRIN 2010-2011 concessão # 2010N8PBAA_002 para YB), Universidade de Trento (CIBIO start-up subvenção para YB) e Fundação Telethon (concessão # GGP13034 para YB).

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com a directiva comunitária 2010/63 / UE e foram aprovados pelo Ministério da Saúde italiano. 1. Cuidado Animal, Habitação e Tratamento <ol><li> Realizar todos os protocolos experimentais utilizando ratos de acordo com as diretrizes do respectivo cuidados com os animais institucional. </li><li> Manter animais em um ciclo claro / escuro de 12 horas de luz com comida e água disponíveis ad libitum. </li><li> Casa os ratos em grupos de 2-4, em gaiolas de policarbonato rato de tamanho padrão com serragem e material de cama trocada semanalmente. </li><li> Utilize idade e ratos sexo correspondentes, porque a susceptibilidade à doença pode variar de acordo com idade e sexo em diferentes modelos de ratos com perturbações do desenvolvimento neurológico. </li><li> Escolha um número adequado de animais para alcançar significância estatística (um mínimo de 10 ratos por genótipo para o estudo comportamental e 4 ratinhos por genótipo para o experimento imuno-histoquímica). </li></ol> 2. Morris Water Maze (MWM) <ol><li> Use um tanque circular (com diâmetro de 100 cm, altura de 50 cm). <ol><li> Coloque algumas pistas visuais sobre os divisores de quarto ao redor do tanque. </li><li> Inserir uma plataforma de 10 cm de diâmetro dentro do tanque a um local fixo no centro de um dos quatro quadrantes imaginários. Mantenha a plataforma escondida no mesmo quadrante para todos os ensaios em todas as sessões de treinamento. </li><li> Encher a piscina com água da torneira até que a plataforma é de 1 cm acima da superfície da água. Equilibrar a temperatura da água deve ser perto de 22 ° C; esta etapa pode levar várias horas. Adicionar água quente para reduzir o tempo necessário para equilibrar a temperatura da água. </li><li> Adicionar cerca de 1,5-2 L de tinta branca, não-tóxico para tornar a água opaca. </li></ol></li><li> Rastrear Aquisição Procedimento <ol><li> Configure o sistema de rastreamento da MWM com câmeras CCD padrão e placas de vídeo. Escolha um sistema de vídeo-monitoramento para acompanhar e analisar diversas variáveis, tais como comprimento do caminho, escape latência eo tempo gasto em cada quadrante. </li><li> Divida a arena em quatro quadrantes e ajustar as configurações de detecção para garantir melhores níveis de contraste entre os animais eo fundo para o acompanhamento ao vivo. </li><li> Especificar a região de plataforma. </li><li> Definir o tempo de teste máxima de 60 segundos. </li></ol></li><li> Testes MWM <ol><li> Antes dos testes de comportamento, permitir que os ratos um período de adaptação de 20-25 min em uma área onde eles não podem ver a piscina ou pistas espaciais. </li><li> Treine cada rato durante 9 dias (duas tentativas consecutivas por dia, com 20-30 min intervalo entre elas). </li><li> Ligue o computador ea câmara e iniciar o software do sistema de monitoramento de vídeo. </li><li> Tome o rato pela cauda e colocá-lo na água, com sua cabeça apontada para o lado da piscina, a partir de uma das quatro posições de início (norte, sul, leste e oeste). Para cada rato, a posição de partida deve ser diferente e pseudorandomized em todos os ensaios. </li><li> Deixe o mergulho mouse e procurar o platfORM para um máximo de 60 seg. Uma vez que o animal atinge a plataforma, deixe-o ficar na plataforma por 20 s. </li><li> Se o mouse não conseguiu localizar a plataforma dentro desse tempo, gentilmente orientar o mouse para a plataforma, segurando-o pelo rabo e deixá-lo ficar lá por 20 s. Uma vez que o animal tenha completado todos os dois ensaios, seque-o com uma toalha e colocá-lo de volta na gaiola. </li><li> Cada dia do período de treinamento, repita o mesmo procedimento (passos 2.3.4-2.3.6). </li><li> Realizar o teste sonda no dia 9 após a última trilha de treinamento. </li><li> Remover a plataforma a partir da piscina. </li><li> Deixe o mergulho mouse e procurar a plataforma para um máximo de 60 segundos. </li><li> Periodicamente, verificar a temperatura da água de modo que deve ser a mesma (22 ° C) e limpar a piscina. </li></ol></li></ol> 3. Preparação de secções de perfused Animais <ol><li> Sacrifício dos ratinhos no final da MWM. Quatro ratinhos de cada genótipo deve ser anestesiado antes da euthanizAlienação de acordo com as directrizes locais e internacionais. </li><li> Perfundir o animal transcardialmente (cortado a direito auriclewith uma tesoura para permitir a hemorragia e introduzir uma cânula borboleta no ventrículo esquerdo para perfundir) com tampão fosfato salino (PBS) durante 4-5 min, seguido por paraformaldeído a 4% em PBS durante 10-15 22 min. </li><li> Dissecar e pós-corrigir os cérebros em paraformaldeído a 4% a 4 ° C durante pelo menos 12 h. </li><li> Colocar os cérebros em tubos de 50 ml de poliestireno cónico contendo 15 ml de 0,02% de azida sódica em 0,1 M PBS e armazenar a 4 ° C até serem necessárias para o corte. </li><li> Cortar e remover o cerebelo antes vibratome corte. </li><li> Cole o cérebro na posição vertical com o local de corte, usando super cola, sobre a placa titular do vibratome. </li><li> Corte o cérebro em 20-40 mm cortes coronais de espessura, a fim de série em toda hipocampo dorsal, em vibratome apropriado. </li><li> Coletar fatias vibratome com um pincel e transferir para um 24 placa multi-poços contendo 1 ml de PBS 0,1 M para cada poço. </li><li> Seções da loja para curto prazo em PBS ou a longo prazo em 0,02% de azida sódica em PBS a 4 ºC (tecido pode ser usado por até um ano). </li></ol> 4. A imuno-histoquímica <ol><li> 3-5 Transferência secções do hipocampo dorsal de cada rato, para placa de 24 multi-poços contendo 500 ul de PBS a 0,1 M para cada poço. </li><li> Lavam-se as secções contidas em cada poço com 500 ul de PBS a 0,1 M (5 minutos, 3 vezes, com agitação suave). </li><li> Extingue-se a actividade da peroxidase endógena, por incubação de secções em 1% de H 2 O 2 em PBS durante 20 min com agitação suave. </li><li> Lavar as secções em PBS a 0,1 M, com agitação suave (3 x 5 min). </li><li> Permeabilização de tecido: incubar secções durante 5 min em 0,2% de Triton X-100 em PBS. </li><li> Durante os passos acima (4.4; 4.5), fazer de tampão de bloqueio suficiente (10% soro de cabra e 0,1% de Triton-X100 em PBS) durante todo o experimento (númer de secções x 100 mL x 3 passos). </li><li> Nota: O uso de soro a partir das mesmas espécies em que o Ab secundário (conjugado com biotina) foi feita. </li><li> Impedir a ligação não específica do anticorpo, por incubação de secções em tampão (100 ^ l / secção) de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente (TA), com agitação suave. </li><li> Incubar em secções Ab primário (pERK) diluído em tampão de bloqueio, durante a noite a 4 ° C, com agitação suave. </li><li> Lavar as secções em PBS a 0,1 M, com agitação suave (3 x 5 min). </li><li> Incubar com o Ab secundário conjugado com biotina (1: 250) diluída em tampão de bloqueio (o mesmo que utilizado no passo 4.6) durante 1 hora à TA com agitação suave. </li><li> Preparar o reagente ABC, ao mesmo tempo, porque avidina e biotina exigem, pelo menos, 30 minutos à temperatura ambiente para o complexo. </li><li> Preparar o volume necessário de reagente ABC acordo com o protocolo dos fabricantes. </li><li> Lavar as secções em PBS a 0,1 M, com agitação suave (3 x 5 min). </li><li> Incubatsecções e durante 45 min à TA com o reagente ABC. </li><li> Lavar as secções em PBS a 0,1 M, com agitação suave (3 x 5 min). </li><li> Prepare a solução de trabalho de DAB, DAB envolvendo cada passo deve ser feito no exaustor como DAB é cancerígeno e teratogênico. </li><li> Transferir a solução DAB para uma nova placa com uma pipeta de transferência de plástico. </li><li> Seções Coloque no prato contendo solução DAB e placa lentamente redemoinho trabalhando com a mão, para permitir o máximo de exposição seções. </li><li> Monitorar reação DAB no microscópio até que o sinal adequado desenvolve (2-5 min). </li><li> Pare a reacção com a intensidade de cor desejada por lavagem do tecido em PBS a 0,1 M (3 x 5 min). </li><li> Use água sanitária para desativar qualquer solução restante substrato DAB no exaustor durante a noite e descartá-lo de acordo com as normas laboratoriais. </li><li> Seções montar em gelatina revestidos por lâminas flutuantes em PBS. Em seguida, seque-os à temperatura ambiente pelo menos 3-4 horas. </li><li> Desidratar o sequencialmente secções em 50%, 70%, 95%e etanol a 100% durante 2 min cada, e claro, a 100% de xileno durante 5 min. </li><li> Lamela utilizando meio de montagem e deixe na coifa para secar durante a noite. </li></ol> Contagem 5. celular <ol><li> Contagem de células pERK-positivos, 3-5 secções ao nível do hipocampo dorsal deve ser analisada por animal. </li><li> Adquirir múltiplas imagens de campo brilhante de cada seção com uma ampliação de 200X usando um microscópio apropriado e, em seguida, montá-los usando um software de processamento de imagem. </li><li> Realize contagens de células em imagens de mosaico convertido-tiff usando o ImageJ software livre. </li><li> Contagem de células pERK-coradas na camada de células de grânulos hilo e sobre 2-3 contando caixas de 100 x 100 mm cada. </li><li> As densidades celulares será expresso como o número de células marcadas por poço de contagem (100 x 100 mm). </li><li> Realizar a análise estatística para avaliar diferença significativa entre os genótipos. Isto pode ser conseguido com t de Studentteste ou análise de variância seguida do teste post hoc apropriada usando softwares comerciais. Definir o nível de significância estatística de p &lt;0,05. </li></ol>

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+the+learning+and+memory+deficits+associated+with+neurofibromatosis+type.">A mouse model for the learning and memory deficits associated with neurofibromatosis type.</a> I. Nature. 15, 281-284 (1997).</li><li>Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Place+navigation+impaired+in+rats+with+hippocampal+lesions.">Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions.</a> Nature. 297, 681-683 (1982).</li><li>Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Maei, H. R., Zaslavsky, K., Teixeira, C. M., Frankland, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+Most+Sensitive+Measure+of+Water+Maze+Probe+Test+Performance.">What is the Most Sensitive Measure of Water Maze Probe Test Performance.</a> Frontiers in integrative neuroscience. 3, 4 (2009).</li><li>Guzowski, J. F., Setlow, B., Wagner, E. K., McGaugh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+gene+expression+in+the+rat+hippocampus+after+spatial+learning:+a+comparison+of+the+immediate-early+genes+Arc,+c-fos+and+zif268.">Experience-dependent gene expression in the rat hippocampus after spatial learning: a comparison of the immediate-early genes Arc, c-fos and zif268.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 5089-5098 (2001).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar

Aqui, nós fornecemos um protocolo de imuno-histoquímica pERK para revelar a ativação neuronal seguinte MWM em EN2 - / - ratos, um modelo de rato de desordens do desenvolvimento neurológico. Diminuição dos níveis de pERK foram detectadas no subcampo CA3 do EN2 - / - mutantes em comparação com WT. Diferentemente do que observado no subcampo CA3, um aumento geral de neurônios pERK-positivos em vez foi detectado em ambos hilo e GCL de EN2 - / - ratos em comparação com WT. Uma po...

Desordens do neurodesenvolvimento incluem um grupo de doenças, tais como a síndrome de Down, síndrome X frágil (SXF), síndrome de Rett, neurofibromatose, esclerose tuberosa e ASD, no qual o desenvolvimento e maturação do sistema nervoso central (SNC) é perturbado cedo durante largura e heterogénea o período pré-natal 1. Essas disfunções cerebrais de desenvolvimento podem causar profundas, efeitos ao longo da vida em função motora, linguagem, aprendizagem e processo de memória. Uma pletora de factores genéticos e ambientais têm sido implicados na patogénese de desordens do neurodesenvolvimento durante os últimos anos 2,3. Mesmo que os mecanismos moleculares subjacentes ao fenótipo clínico permanecem desconhecidos, os resultados acima mencionados têm permitido o desenvolvimento de vários modelos de ratinho destes distúrbios. De aprendizagem e défices de memória foram identificadas em vários destes modelos de murganho tais como TSC1 +/-, +/- TSC2,Nf1 +/- e EN2 - / - ratos 2,4-7. Um desafio importante no domínio dos distúrbios do neurodesenvolvimento é a identificação de processos celulares e moleculares subjacentes aprendizagem e memória disfunção. Vias de sinalização activados seleccionados durante a aprendizagem ou a memória podem induzir a transcrição de genes específicos e, em última análise conduzir à síntese de novo da proteína. Genes imediatos-iniciais (IEGs) de activação e dependentes de proteína modificações sinápticas são rapidamente induzida nos neurônios do cérebro em resposta à atividade neuronal ea formação comportamental 8,9. Déficits em vias de sinalização que envolvem neurofibromin têm sido associados com a aprendizagem prejudicada em desordens do desenvolvimento neurológico. Neurofibromina é o produto do gene NF1, cuja mutação faz com neurofibromatose de tipo 1, uma síndrome genética complexa, caracterizada por tumores no sistema nervoso, atraso comportamentais e motoras, cognitivas e DISAbilidades 10. Ratos heterozigotos para Nf1 eliminação restritas aos neurônios inibitórios mostrar déficits na fase inicial da potenciação de longa duração (LTP), bem como a aprendizagem espacial comprometida em MWM 5,11,12. Curiosamente, a deficiência Nf1 neste modelo de ratinho leva a uma sobre-activação de sinalização de Ras na interneurónios inibitórios durante a aprendizagem, resultando no aumento da fosforilação de ERK e, finalmente, em uma ampliação anormal de libertação de GABA de neurónios destes cinco. Com base nestes resultados, a visualização da actividade neuronal após tarefas comportamentais representa uma forma de reconstruir circuitos específicos envolvidos em doenças do neurodesenvolvimento. O protocolo de imuno-histoquímica descrito aqui tem o objetivo de avaliar e quantificar os níveis de fosforilação ERK hipocampo seguintes MWM em um modelo de rato ASD com déficits cognitivos. MWM é amplamente utilizado para investigar a aprendizagem espacial dependente do hipocampo e memória em roedores 13,14 </sup&gt;. Nós decidir usar ERK como leitura molecular de aprendizagem hipocampo-dependente tarefa, uma vez que ERK mostrou ter um papel essencial na aprendizagem e memória formação 15. Além disso, a via ERK é necessário para dependente da experiência plasticidade no córtex visual desenvolvimento 16. Finalmente, camundongos sem uma das duas isoformas (ERK ERK2) no show CNS marcado anomalias em comportamentos cognitivos, emocionais e sociais 17, indicando que a sinalização ERK pode desempenhar um papel crítico na patogênese de desordens do desenvolvimento neurológico, tais como ASD. Nós usamos Engrailed 2 nocaute (EN2 - / -) camundongos como modelo de desordens do desenvolvimento neurológico. EN2 - / - ratos mostram características anatômicas e comportamentais &quot;ASD-like&quot;, incluindo a perda de 18 interneurons cérebro anterior, redução da expressão de genes relacionados com o ASD 19, diminuição da sociabilidade e flexibilidade cognitiva prejudicada 6,7,20. Learni espacialng e defeitos de memória, como os detectados na MWM, são especialmente robusta em EN2 - / - ratos e 6,7 pode ser relevante para as deficiências cognitivas observadas em pacientes com TEA 21. Além disso, mostramos que a aprendizagem espacial prejudicada em MWM está associada à redução da expressão neurofibromin e aumentou os níveis de pERK no hilo de EN2 - / - ratos adultos 7. Aqui nós apresentamos o protocolo detalhado para a caracterização imuno-histoquímica de pERK seguinte MWM neste modelo de ratinho ASD.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>EthoVision XT 8</td>
			<td>Noldus Information Technology</td>
			<td></td>
			<td>This software platform is not a requirement &#8211; there are many other behavioral softwares on the market.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempera Paint</td>
			<td>Giotto - Fila Group Company</td>
			<td></td>
			<td>White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200</td>
			<td>Equivalent models from other companies can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A406-20</td>
			<td>Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66004-950</td>
			<td>Toxic - to be used under hood. Change xylene every month depending on use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>G9023-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC kit Vectastain&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB peroxidase substrate</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td>4370</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-1000&#160;</td>
			<td>Dilution 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Slides&#160;</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>1879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-548-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>317616</td>
			<td>Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss&#160;</td>
			<td>Axio Imager.M2</td>
			<td>Equivalent microscope can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe Systems, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td>To assemble images.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot 11.0</td>
			<td>Systat Software Inc. (USA)</td>
			<td></td>
			<td>Equivalent softwares for statistical analysis can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 6</td>
			<td>GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA)</td>
			<td></td>
			<td>Equivalent softwares for statistical analysis can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemical visualization of hippocampal neuron activity after spatial learning in a mouse model of neurodevelopmental disorders

Indução da quinase extracelular regulado fosforilada (pERK) é uma leitura molecular confiável de ativação neuronal dependente de aprendizagem. Aqui, descrevemos um protocolo de imuno-histoquímica pERK estudar o perfil de ativação dos neurônios do hipocampo após a exposição a uma tarefa de aprendizagem espacial em um modelo de rato caracterizado por déficits cognitivos de origem do desenvolvimento neurológico. Especificamente, nós usamos immunostaining pERK para estudar a ativação neuronal seguinte labirinto aquático de Morris (MWM, uma tarefa clássica de aprendizagem dependente do hipocampo) em Engrailed-2 nocaute (EN2 - / -) ratos, um modelo de transtornos do espectro do autismo (ASD). Em comparação com o tipo selvagem (WT) controles, EN2 ​​- / - ratos mostraram déficits significativos de aprendizagem espacial na MWM. Após MWM, diferenças significativas no número de neurónios positivos pERK foram detectadas em subcampos do hipocampo específicas de EN2 - / - ratos, em comparação com animais WT. Assim, o nosso protocolo pode detectar diferenças de forma robustaneurônios pERK-positivos associados à deficiência de aprendizagem dependente do hipocampo em um modelo do rato da ASD. Mais geralmente, o nosso protocolo pode ser aplicado para estudar o perfil de activação neuronal no hipocampo em ambos os modelos genéticos ou farmacológicos de ratinho caracterizadas por disfunções cognitivas.

O protocolo aqui descrito foi concebido para visualizar, por imuno-histoquímica, a expressão de um marcador específico da actividade de neurónios do hipocampo após MWM num modelo de ratinho de desordens do neurodesenvolvimento. Todos os dados experimentais aqui apresentados foram obtidos a partir nossa recente trabalho 7. Foram utilizados obtidos a partir de cruzamentos heterozigotos; ninhada da mesma idade adultos (25-35 g de peso = 3-5 meses de idade) - Macho e fêmea WT e EN2 - /.</sup...

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Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Nós descrevemos um protocolo de imuno-histoquímica para estudar o perfil de ativação dos neurônios do hipocampo após a exposição a uma tarefa de aprendizagem espacial em um modelo de rato caracterizado por déficits cognitivos de origem do desenvolvimento neurológico. Este protocolo pode ser aplicado a ambos os modelos genéticos ou farmacológicos de ratinho caracterizadas por disfunções cognitivas.

A visualização imuno-histoquímica de Hippocampal Neuron Atividade Após Spatial Aprendizagem em um rato modelo de desordens do desenvolvimento neurológico

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

immunohistochemical-visualization-hippocampal-neuron-activity-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K visualizações.  University of Trento.  Nós descrevemos um protocolo de imuno-histoquímica para estudar o perfil de ativação dos neurônios do hipocampo após a exposição a uma tarefa de aprendizagem espacial em um modelo de rato caracterizado por déficits cognitivos de origem do desenvolvimento neurológico. Este protocolo pode ser aplicado a ambos os modelos genéticos ou farmacológicos de ratinho caracterizadas por disfunções cognitivas. 

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Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Recuperação de fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) de fluorescência Proteínas Tagged em espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo Cultivadas

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Neurociência

Using MazeSuite and Functional Near Infrared Spectroscopy to Study Learning in Spatial Navigation

MazeSuite is a complete toolset to prepare, present and analyze navigational and spatial experiments1. MazeSuite can be used to design and edit adapted virtual 3D environments, track a participants' behavioral performance within the virtual environment and synchronize with external devices for physiological and neuroimaging measures, including electroencephalogram and eye tracking.
Functional near-infrared spectroscopy (fNIR) is an optical brain imaging technique that enables continuous, noninvasive, and portable monitoring of changes in cerebral blood oxygenation related to human brain functions2-7. Over the last decade fNIR is used to effectively monitor cognitive tasks such as attention, working memory and problem solving7-11. fNIR can be implemented in the form of a wearable and minimally intrusive device; it has the capacity to monitor brain activity in ecologically valid environments. 
Cognitive functions assessed through task performance involve patterns of brain activation of the prefrontal cortex (PFC) that vary from the initial novel task performance, after practice and during retention12. Using positron emission tomography (PET), Van Horn and colleagues found that regional cerebral blood flow was activated in the right frontal lobe during the encoding (i.e., initial na&iuml;ve performance) of spatial navigation of virtual mazes while there was little to no activation of the frontal regions after practice and during retention tests. Furthermore, the effects of contextual interference, a learning phenomenon related to organization of practice, are evident when individuals acquire multiple tasks under different practice schedules13,14. High contextual interference (random practice schedule) is created when the tasks to be learned are presented in a non-sequential, unpredictable order. Low contextual interference (blocked practice schedule) is created when the tasks to be learned are presented in a predictable order.
Our goal here is twofold: first to illustrate the experimental protocol design process and the use of MazeSuite, and second, to demonstrate the setup and deployment of the fNIR brain activity monitoring system using Cognitive Optical Brain Imaging (COBI) Studio software15. To illustrate our goals, a subsample from a study is reported to show the use of both MazeSuite and COBI Studio in a single experiment. The study involves the assessment of cognitive activity of the PFC during the acquisition and learning of computer maze tasks for blocked and random orders. Two right-handed adults (one male, one female) performed 315 acquisition, 30 retention and 20 transfer trials across four days. Design, implementation, data acquisition and analysis phases of the study were explained with the intention to provide a guideline for future studies.

MazeSuite is a complete toolset to prepare, present and analyze navigational and spatial experiments. Functional near-infrared spectroscopy (fNIR) is an optical brain imaging technique that enables noninvasive and portable monitoring of cerebral blood oxygenation changes. This paper summarizes collective use of MazeSuite and fNIR within a cognitive processing learning paradigm.

Usando MazeSuite e Funcional espectroscopia no infravermelho próximo para o Estudo Aprendizagem em navegação espacial

MazeSuite is a complete toolset to prepare, present and analyze navigational and spatial experiments1. MazeSuite can be used to design and edit adapted ...

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance imaging. However, use of such methods in animal models requires anesthesia and hence both alters the brain state and prevents behavioral measures. An alternative method is the use of in vivo microdialysis to take continuous measurement of brain extracellular fluid concentrations of glucose, lactate, and related metabolites in awake, unrestrained animals. This technique is especially useful when combined with tasks designed to rely on specific brain regions and/or acute pharmacological manipulation; for example, hippocampal measurements during a spatial working memory task (spontaneous alternation) show a dip in extracellular glucose and rise in lactate that are suggestive of enhanced glycolysis1-3,4-5, and intrahippocampal insulin administration both improves memory and increases hippocampal glycolysis6. Substances such as insulin can be delivered to the hippocampus via the same microdialysis probe used to measure metabolites. The use of spontaneous alternation as a measure of hippocampal function is designed to avoid any confound from stressful motivators (e.g. footshock), restraint, or rewards (e.g. food), all of which can alter both task performance and metabolism; this task also provides a measure of motor activity that permits control for nonspecific effects of treatment. Combined, these methods permit direct measurement of the neurochemical and metabolic variables regulating behavior.

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Modulation of hippocampally-dependent spatial working memory by direct intrahippocampal microinjection, accompanied and followed by in vivo microdialysis for metabolites in conscious, behaving animals.

Microinjeção insulina hipocampal e<em&gt; Em vivo</em&gt; Microdiálise Durante um teste de memória espacial

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance ...

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and thus current therapeutic treatment strategies are not curative. Through the use of whole exome sequencing, an increasing number of genes have been identified to play a role in human locomotion. Despite identifying these genes, it is not known how these genes are crucial to normal locomotive functioning. Therefore, a reliable assay, which utilizes model organisms to elucidate the role of these genes in order to identify novel targets of therapeutic interest, is needed more than ever. We have designed a sensitized version of the negative geotaxis assay that allows for the detection of milder defects earlier and has the ability to evaluate these defects over time. The assay is performed in a glass graduated cylinder, which is sealed with a wax barrier film. By increasing the threshold distance to be climbed to 17.5 cm and increasing the experiment duration to 2 min&#160;we have observed a greater sensitivity in detecting mild mobility dysfunctions. The assay is cost effective and does not require extensive training to obtain highly reproducible results. This makes it an excellent technique for screening candidate drugs in Drosophila mutants with locomotion defects.

We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.

Análise Quantitativa de Defeitos de escalada em um modelo de Drosophila de doenças neurodegenerativas

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies indicate that the severity of brain injury appear to be sex dependent, and that the male neonates are more susceptible to the effects of HI-related brain injury, resulting in more severe neurological outcomes as compared to females with comparable brain injuries. The development of reliable methods to isolate and maintain highly enriched populations of sexed hippocampal astrocytes is essential to understand the cellular basis of sex differences in the pathological consequences of neonatal HI. In this study, we describe a method for creating sex specific hippocampal astrocyte cultures that are subjected to a model of in-vitro ischemia, oxygen-glucose deprivation, followed by reoxygenation. Subsequent reactive astrogliosis was examined by immunostaining for the Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and S100B. This method provides a useful tool to study the role of male and female hippocampal astrocytes following neonatal HI, separately.

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Astrocytes are one of the most important key players in the central nervous system (CNS). Here, we are reporting a practical method of sexed hippocampal astrocyte culture protocol in order to study the mechanisms underlying the astrocyte function in male and female neonate pups after in-vitro ischemia.

As diferenças sexuais no mouse do hipocampo astrócitos após<em&gt; In-Vitro</em&gt; Isquemia

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to na&#239;ve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment. 
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/na&#239;ve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

Alta resolução quantitativa Synaptic Proteome Profiling de rato regiões cerebrais Depois Auditivo Discriminação Aprendizagem

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

Low-Density hipocampo Cultura Neuron primária

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Assessing Spatial Learning and Memory in Small Squamate Reptiles

Clinical research has leveraged a variety of paradigms to assess cognitive decline, commonly targeting spatial learning and memory abilities. However, interest in the cognitive processes of nonmodel species, typically within an ecological context, has also become an emerging field of study. In particular, interest in the cognitive processes in reptiles is growing although experimental studies on reptilian cognition are sparse. The few reptilian studies that have experimentally tested for spatial learning and memory have used rodent paradigms modified for use in reptiles. However, ecologically important aspects of the physiology and behavior of this taxonomic group must be taken into account when testing for spatially based cognition. Here, we describe modifications of the dry land Barnes maze and associated testing protocol that can improve performance when probing for spatial learning and memory ability in small squamate reptiles. The described paradigm and procedures were successfully used with male side-blotched lizards (Uta stansburiana), demonstrating that spatial learning and memory can be assessed in this taxonomic group with an ecologically relevant apparatus and protocol.

This paper describes a modification of the Barnes maze, a standard rodent paradigm used to assess spatial memory and learning, for use in small squamate reptiles.

Avaliando a aprendizagem espacial e memória em pequenas Squamata Répteis

Clinical research has leveraged a variety of paradigms to assess cognitive decline, commonly targeting spatial learning and memory abilities. However, ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain undergoes rapid organizational change and is similar to accelerated brain changes that occur during the third trimester in humans. This model of fetal alcohol spectrum disorders (FASDs) produces severe brain damage, mimicking the amount and pattern of binge-drinking that occurs in some pregnant alcoholic mothers. We describe the use of trace eyeblink classical conditioning (ECC), a higher-order variant of associative learning, to assess long-term hippocampal dysfunction that is typically seen in alcohol-exposed adult offspring. At 90 days of age, rodents were surgically prepared with recording and stimulating electrodes, which measured electromyographic (EMG) blink activity from the left eyelid muscle and delivered mild shock posterior to the left eye, respectively. After a 5 day recovery period, they underwent 6 sessions of trace ECC to determine associative learning differences between alcohol-exposed and control rats. Trace ECC is one of many possible ECC procedures that can be easily modified using the same equipment and software, so that different neural systems can be assessed. ECC procedures in general, can be used as diagnostic tools for detecting neural pathology in different brain systems and different conditions that insult the brain.

Trace eyeblink classical conditioning (ECC) was used to assess hippocampal-dependent associative learning in adult rats that were administered a high concentration (11.9% v/v) of alcohol during early neonatal brain development. In general, ECC procedures are sound diagnostic tools for detecting brain dysfunction across many psychological and biomedical settings.

O uso do condicionamento de rastreamento Eyeblink clássico para avaliar disfunção Hippocampal em um modelo do rato de transtornos do espectro do álcool Fetal

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.