Este procedimento fornece acesso óptico repetido ao hipocampo dorsal de camundongos vivos para estudar os mecanismos de formação da memória e recordar enquanto realizam tarefas de aprendizagem. Esta técnica permite o uso de microscopia leve para estudar o hipocampo dorsal de camundongos vivos a resolução espacial de nível micrometer longitudinalmente ao longo de várias semanas. A perda de memória é uma marca geral de algumas doenças cerebrais, como a doença de Alzheimer.
Entender o mecanismo de formação e recordação da memória poderia, em última análise, ajudar os pacientes que sofrem dessas doenças. Este método poderia ser aplicado a outros sistemas animais com um crânio, como pequenos mamíferos. Monitorar sinais vitais durante uma cirurgia de sobrevivência pode ser perturbador e estressante.
Pode ser útil primeiro realizar o procedimento em um animal morto, a fim de se concentrar nos aspectos mais cruciais do procedimento. Para preparar a cânula de imagem, primeiro corte um tubo de aço inoxidável de três milímetros de diâmetro em um anel de metal de 1,6 milímetros de comprimento. Se as bordas do anel não forem bruscas após o corte, arquive as irregularidades.
Em seguida, use um par de fórceps para mergulhar um lado do anel de metal em um adesivo óptico de cura UV. Em seguida, posicione o anel de metal no centro de uma mancha de vidro com a lateral do anel coberta por adesivo tocando o deslizamento de tampa. Ligue a unidade do driver led de cura UV e brilhe a luz de comprimento de onda de 365 nanômetros sobre o adesivo por um minuto para curar o adesivo.
Certifique-se de que todos os lados do anel estejam igualmente iluminados alterando a direção da fonte de luz. Depois que o adesivo endureceu por pelo menos duas horas, segure firmemente a cânula da extremidade aberta do anel de metal por meio de um hemostat. Usando uma broca dentária equipada com um arquivo rotativo, arquive o excesso de tampas de vidro até que ele seja lavado com as laterais do anel.
Prepare os instrumentos necessários e anestesia o mouse conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, remova o cabelo e desinfete a pele sobre a cabeça do rato. Em seguida, use tesouras e fórceps para fazer um pequeno corte no couro cabeludo na posição próxima à lambda.
Mova-se lateralmente na direção das orelhas e, em seguida, rostrally na direção do olho orbita para formar um triângulo no eixo sagital aproximadamente quatro milímetros rostral para bregma. Aplique uma única gota de lidocaína no crânio. Depois de dois minutos, limpe o periósteo e seque o crânio usando um cotonete.
Em seguida, posicione as barras de ouvido para fixar a cabeça do mouse. Usando uma micro broca com uma rebarba de largura de 0,5 milímetros, faça um pequeno buraco no osso frontal em frente ao hipocampo imageado aproximadamente 1,5 milímetros da sutura sagital e dois milímetros de distal da sutura coronal. Em seguida, enrosque um parafuso de osso de aço inoxidável de largura de 0,86 milímetros no orifício do crânio.
Fixá-lo no lugar usando cimento adesivo. Deixe o cimento secar por 30 segundos a um minuto. Em seguida, use uma broca de trefina de três milímetros de diâmetro para fazer um pequeno furo no osso parietal.
Posicione o orifício aproximadamente 1,5 milímetros distal da sutura sagital e dois milímetros distal da sutura lambdoide. Remova cuidadosamente a aba óssea. Em seguida, remova as meninges usando fórceps Dumont.
Ablato matéria cortical para alcançar a cápsula externa. Use uma agulha cega de calibre 19 conectada a uma bomba de vácuo e irrigar com soro fisiológico para evitar a desidratação do tecido exposto e lavar qualquer sangue residual após a resolução do sangramento. Suem lentamente o tecido cortical de cerca de 50 a 100 mícrons de cada vez até que o córtex se desprende da cápsula expondo as fibras do cingulum ou do corpo caloso.
Em seguida, descasque cuidadosamente as fibras dorsais até que as fibras mais profundas, o alvéolo do hipocampo sejam expostos. Quando terminar, enxágue o tecido com soro fisiológico. Em seguida, use fórceps finos para mergulhar a cânula inferior em soro fisiológico e posicioná-la sobre o orifício do crânio.
Em seguida, empurre a cânula para dentro do crânio até que a tampa de vidro esteja em contato com as fibras. Seque o crânio e aplique um cimento adesivo rápido sobre o crânio para manter a cânula no lugar. Certifique-se também de aplicar adesivo na borda da cânula, mas tenha cuidado para não deixar o adesivo correr para a cânula.
Uma vez seco, use um braço estereotaxista para posicionar uma placa de porta-cabeças sobre a cânula em contato com o crânio. Prepare uma mistura de acrílico dentário e, em seguida, aplicá-lo em todo o crânio. Cubra todo o crânio exposto, o parafuso e a pele aberta com acrílico dentário para estabilizar a preparação.
Após 15 minutos, aplique uma película adesiva removível na placa do suporte da cabeça para evitar que os detritos entrem na cânula. Quando estiver pronto para imagem do cérebro, siga novamente no protocolo de texto que acompanha os detalhes sobre a anestesia. Uma vez suficientemente sedado, use fórceps para remover cuidadosamente o filme adesivo da placa do suporte da cabeça.
Remova o filme suavemente para evitar danificar a preparação. Em seguida, posicione o mouse sob o microscópio sobre o tapete de aquecimento e fixe a placa da cabeça no suporte. Aplique pomada nos olhos do animal.
Em seguida, limpe a cânula de imagem usando uma seringa e uma agulha fina para jogar água deionizada na cânula seguida de remoção com uma bomba de vácuo. Utilize objetivos de longa distância de trabalho de baixa ampliação para verificar visualmente a cânula quanto à água residual, sujeira, integridade e presença de fluorescência. Em seguida, alinhe a cânula ao eixo óptico ajustando os ângulos dos braços do porta-cabeça.
Mude para um objetivo de 25X com uma abertura numérica de 1,0 e uma distância de trabalho de quatro milímetros. Em seguida, adicione água deionizada suficiente à cânula para preenchê-la e manter o excesso de água em cima da cânula. Por fim, use dois sinais de excitação de fótons e imagem dos sinais de fluorescência.
Mostrado aqui é uma pilha de imagem 2P de um cérebro de camundongo transgênico de teu1-GFP. Os ratos thy1-GFP expressam GFP citoplasmado aumentado sob o controle do promotor Thy1 em uma população aleatória e esparsa de neurônios piramidários. Geralmente, o principal eixo dos neurônios piramihistas no hipocampal dorsal CA1 é aproximadamente perpendicular ao plano de imagem XY.
Essas regiões são mapeadas manualmente para uma pilha tridimensional de baixa ampliação mostrando o padrão de expressão GFP no volume abaixo da cânula de imagem. Para o rastreamento longitudinal, várias regiões cerebrais no campo de visão da cânula são definidas. Cada região corresponde a uma área de aproximadamente 240 por 240 micrômetros e contém entre um e sete segmentos dendríticas.
A série de imagens aqui mostra uma pilha de imagens de passo z de micrômetros de neurônios piramimais ca1 e dendritos basais adquiridos em intervalos de tempo diferentes por 14 dias. No entanto, durações e intervalos de imagem mais longos são possíveis. Embora a maioria das imagens sejam de espinhas dendríticas nos oriens estrato, também é possível imaginar espinhos dendráticos nos dendritos oblíquos do radiador estrato.
Outra extensão dessa técnica é a plasticidade evocada pela atividade em neurônios piramimis CA1, injetando a área hipocampal dorsal ca1 com um vetor viral. Isso permite que a plasticidade de centenas de neurônios piramimais ca1 em cada animal seja medida aqui como uma pilha de imagens 2P. É crucial evitar danos ao hipocampo ao remover o tecido sobreoleita.
Além disso, deve-se colocar a cânula corretamente para garantir uma preparação estável. A preparação descrita permite o uso de diferentes tipos de imagens ópticas, como microscópios em miniatura que podem ser implantados na cabeça do animal. Isso permite que o pesquisador siga a atividade neuronal em animais em movimento livre.
Originalmente, a técnica foi usada para estudar a plasticidade estrutural em neurônios hipocampais. Hoje, é implementado no estudo da atividade neuronal também em outras áreas cerebrais.
