Os papéis da microglia no hipocampo ainda não são totalmente compreendidos. Esse protocolo pode visualizar diretamente como a microglia entra em contato e regula os neurônios. A obtenção de imagens in vivo da micróglia e dos neurônios em repouso no hipocampo tem sido muito difícil.
Este método pode resolver este problema. Para implantar a janela de observação, faça um sulco circular de três milímetros no crânio usando um punch dérmico, garantindo o alinhamento do sulco com a área previamente marcada. Quando o punch dérmico atingir a camada mais interna do crânio antes de tocar a dura-máter subjacente, levante suavemente a ilha óssea central usando uma agulha de calibre 30.
Em seguida, remova cuidadosamente a dura-máter usando um seletor de dura. Aspirar a pia, os vasos piais e o tecido cortical da superfície. Manter homogênea a profundidade da superfície tecidual exposta em toda a janela craniana e aprofundar gradualmente a aspiração até que as fibras da cápsula externa sejam expostas.
Após o posicionamento da ponta de sucção na cápsula externa, próximo ao ventrículo lateral, na extremidade rostrolateral da janela craniana, remova a camada superficial da cápsula externa que corre no sentido caudomedial para o rostrolateral. Em seguida, remova a camada interna que corre na direção médio-lateral. Confirmar a remoção de toda a cápsula externa verificando a exposição total da superfície do alvéolo e da comissura hipocampal dorsal.
Depois de garantir que o sangramento parou completamente, preencha o orifício com soro fisiológico estéril até o nível da superfície do crânio. Em seguida, insira o tubo metálico de fundo de vidro verticalmente no orifício enquanto aspira o excesso de água que transborda das laterais do tubo até que o fundo de vidro pressione levemente contra o alvéolo e achate parcialmente o CA1 subjacente. Usando o cimento de resina dental, fixe a parede do tubo inserido ao crânio circundante.
Coloque o mouse no dispositivo de retenção da cabeça sob a lente objetiva do microscópio de dois fótons e no estágio de varredura XY motorizado. Em seguida, preencha o espaço entre o fundo de vidro e a lente objetiva com água sem criar bolhas de ar. Ajustar o foco para CA1 com a orientação da fluorescência emitida pelo parênquima cerebral e a luz refletida da borda do tubo metálico sob iluminação contínua pelo laser pulsado.
Ajuste o ângulo da cabeça do mouse inclinando o dispositivo de fixação da cabeça para que o fundo de vidro fique paralelo ao plano de imagem. Em seguida, ajuste o colar de correção do objetivo para alcançar a mais alta resolução em uma profundidade da estrutura alvo no CA1. Em seguida, confirme se as células fluorescentes na camada molecular do giro denteado ou DG a uma profundidade de 500 micrômetros do fundo de vidro são fotografadas em todo o campo de visão.
Somente em caso de cirurgia bem-sucedida, os sinais de DG podem ser detectados imediatamente. Levante o rato pós-operatório em alojamento individual durante várias semanas. Coloque o camundongo anestesiado sob o microscópio de dois fótons.
Realizar a imagem do hipocampo. Confirmar se a qualidade e a intensidade das imagens captadas após a redução do edema pós-operatório são melhores ou comparáveis àquelas captadas no dia da cirurgia. Certifique-se de que a micróglia recuperou sua morfologia ramificada.
Em seguida, realizar imagens in vivo na camada de interesse no CA1. A microglia em camundongos CX3CR1-GFP capturados imediatamente após a cirurgia não mostrou ativação proeminente. Após cirurgia bem-sucedida sem indução de edema, as profundidades de imagem de dois fótons excederam todas as camadas de CA1 e atingiram 500 micrômetros da superfície cirúrgica.
A microglia na fase crônica de mais de três semanas após a cirurgia exibiu maior intensidade e resolução fluorescente e distribuição mais homogênea devido à redução do edema e inflamação. Microglia em todas as camadas já restaurou sua morfologia ramificada e exibiu corpos celulares imóveis e processos altamente modais. As imagens de alta resolução ao longo de todo o CA1 foram fornecidas por vários meses.
Os sinais da microglia fluorescente ajudam a identificar as camadas hipocampais. Microglia no alvéolo tinha corpos celulares alongados e processos que se estendiam ao longo dos tratos axonais. Microglias no estrato piramidal podem ser distinguidas pela menor densidade de seus processos.
A fronteira entre o CA1 e o GD pôde ser reconhecida por vasos sanguíneos espessos correndo ao longo da fronteira, o que foi melhor reconhecido pela marcação dos vasos com sulforrodamina 101. Como exemplo de aplicação, microglia positiva para GFP e neurônios piramidais marcados com tdTomato foram fotografados simultaneamente. A marcação neuronal ajudou a entender as estruturas exatas da camada do CA1.
O ponto mais importante é reduzir os danos da cirurgia. Evitar dano tecidual por aspiração. Aplique uma pressão suave ao inserir o fundo de vidro e evite que o cimento dental toque a superfície cerebral.
Esta abordagem ajudará a identificar o papel da microglia no hipocampo. Por exemplo, como a microglia interage com os neurônios, como eles estão envolvidos no aprendizado e como controlam doenças cerebrais.
