This work was supported by Ministerio de Econom&#236;a y competitividad (BFU2012-37146) and Junta de Castilla y Le&#242;n (BIO103/VA45/11, VA145U13 and BIO/VA33/13), Spain. MCR was supported by Junta de Castilla y Le&#242;n (Spain) and the European Social Fund. We thank the late Dr. Philippe Br&#251;let (1947-2013) for the mitochondrial GFP Aequorin plasmid.

Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais tenham sido manipuladas em protocolos aprovados pela instalação de alojamento dos animais Universidade Valladolid de acordo com a Convenção Europeia 123 / Conselho da Europa ea Directiva 86/609 / CEE. 1. Curto e Longo prazo Cultura de Rat neurônios do hipocampo <ol><li> Preparação de poli-D-lisina revestido, de 12 mm de lamelas de vidro. <ol><li> Esterilizar 12 mm de diâmetro lamelas de vidro em etanol durante pelo menos 24 horas. Deixe secar em condições estéreis. </li><li> Distribuir as lamelas sobre uma tira de parafilm numa placa de Petri. Cobrir a superfície de cada lamela com 200 ul de 1 mg / ml de poli-D-lisina. Permitir que o tratamento S / N. </li><li> No dia seguinte, lavar as lamelas com água estéril duplamente destilada a cada 15 min durante 90 min sob condições estéreis. </li><li> Encha uma placa de quatro bem multidish com 500 ul de meio de cultura Neurobasal por poço. Neurobasal Meio de Cultura deve ser complementada com10% de soro fetal bovino, 2% B27, 1 ug / ml de gentamicina e 2 mM de L-glutamina. </li><li> Coloque as lamelas na placa multidish. Mantê-los numa atmosfera humidificada com 37 ° C e 5% de CO2 até à sua utilização. </li></ol></li><li> Isolamento de neurónios do hipocampo de ratos recém-nascidos. <ol><li> Prepare a 1,8 ml de solução de papaína (adquiridas directamente) num frasco (20 ul / ml) sob condições estéreis: Para se obter uma concentração final de 20 ul / ml de adicionar cerca de 40 ul de papaína em 1,8 ml de Hank mais 0,6% de BSA (ul deve ser calculada dependendo das condições do fornecedor). 0,6% de BSA de Hank é preparado por mistura de 85 mL de meio HBSS com 15 ml de 4% de albumina de soro bovino (BSA, preparado solução 4 g de BSA em 100 mL de HBSS). Prepare-lo em um capuz estéril. </li><li> Incubar a papaína em Hank mais 0,6% de BSA durante 30 min a 37 ° C antes da utilização. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 um antes da utilização. </li><li> Prepare meio F-12 de Ham, acrescentando DulbeccoPó de Meio de Eagle (13,5 g por L) de modificação em 900 ml de água estéril duplamente destilada. Em seguida, adicionar 6 g de HEPES e 336 mg de NaHCO3 e ajustar o pH a 7,42 com NaOH 4 N. Adicionar água estéril para se obter uma solução de 1 L e filtrá-la usando uma polietersulfona 0.20 uM (PES) Frasco filtro superior. Leve este processo em uma capa estéril. Finalmente saturar a solução com CO2 em condições estéreis antes da utilização. Soluções armazenar a 4 ºC e usá-los refrigerados. </li><li> Euthanize recém-nascido (P0) filhotes de ratos por decapitação e lavar a cabeça em meio HBS estéril. Abra o crânio com a ajuda de uma tesoura esterilizada. Extrair o cérebro com uma espátula e lavá-lo rapidamente em meio F-12 de Ham. </li><li> Fazer um corte diagonal com o auxílio de um bisturi em cada hemisfério (Figura 1B), e transportá-lo para uma placa de Petri contendo meio F-12 de Ham. </li><li> Meninges Descartar cuidadosamente com a ajuda de uma pinça de dissecção e sob uma lupa. </li> &lt;li&gt; Identificar o hipocampo em um local côncava característica sobre o córtex utilizando lupa. Em seguida, separar o hipocampo a partir do córtex puxando cuidadosamente a partir de uma fronteira e removê-lo da sua posição usando uma tesoura olho. </li><li> Transferir o tecido do hipocampo a uma placa de 4 bem cheio com meio estéril de Hank sem Ca 2+ e Mg 2+, mais 0,6% de BSA e lavar o tecido do hipocampo. Sem retirar os meios cortar o tecido em pequenos pedaços (cerca de 2 x 2 mm), utilizando as mesmas tesouras olho. </li><li> Transferir peças do hipocampo para um frasco contendo 1,8 ml de solução de papaína pré-filtrado. Em seguida, incubar-los a 37 ºC com ocasional, agitação suave. 15 min depois, adicionar 90 ul de ADNase I (solução 50 ug / ml final) e incubar durante 15 min adicionais. </li><li> Transferir o tecido para um tubo de centrífuga de 10 ml e lava-se os fragmentos com Neurobasal fresco Meio de Cultura. Obter suspensão celular por passagem do tecido através de fragmentos de 5 ml de semente de plásticoette. </li><li> Centrifuga-se a suspensão de células 160 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante utilizando uma pipeta de Pasteur de plástico estéril e suspender sedimento cuidadosamente com uma pipeta de 1 mL automatizados em 1 ml de meio de cultura Neurobasal. </li><li> Medir a densidade celular utilizando uma câmara de contagem de Neubauer. Coloque a lamela de vidro através da câmara de Neubauer. Adicionar 10 ul de suspensão de células. Certifique-se a suspensão de células entra de maneira uniforme e sem fazer bolhas na câmara. Contar o número de células ao microscópio e executar cálculos correspondentes para obter uma gota de 40-80 ul adequado contendo 30 x 10 3 células. O número total de células irá depender do número de animais utilizados. </li></ol></li><li> A curto prazo e a cultura de longo prazo de neurónios de hipocampo de rato. <ol><li> Sobre a placa de quatro bem multidish contendo 500 ul de meio de cultura Neurobasal preparado antes e mantido na incubadora, placa de cerca de 30 x 10 3 em células de uma gota de cerca de 50 ul de cadapoço da placa de multidish contendo um poli-D-lisina-revestidas, 12 mm de diâmetro lamela de vidro. </li><li> Manter as células primárias de hipocampo numa atmosfera humidificada com 37 ° C e 5% de CO2 durante 2-5 dias in vitro (DIV, a curto prazo, as culturas jovens) ou&gt; 15 DIV (de longo prazo, as culturas envelhecidas) antes de experiências sem alterar a cultura mídia. </li></ol></li></ol> 2. imagens de fluorescência de Ca2 + citosólico Concentração <ol><li> Preparação de soluções de teste para imagens de fluorescência. <ol><li> Prepara-se uma solução salina externa tamponada com HEPES (HBS) contendo, em mM: NaCl 145, KCl 5 mM, MgCl2 1, CaCl2 1, glucose 10, HEPES de sódio-10 (pH 7,42). </li><li> Prepara-se uma solução externa -livre, Mg 2+, solução salina tamponada com HEPES (HBS) contendo, em mM: NaCl 146, KCl 5 mM, CaCl2 1, glucose 10 e HEPES 10 (pH 7,42). </li><li> Resolver soro fisiológico NMDA em Mg 2 + livre, HEPES (HBS) a uma final concentração de 100 mM e completá-lo com 10 mM de glicina. </li><li> Prepara-se uma solução de HBS contendo KCl em vez de NaCl através da resolução de (em mM): KCl 145, MgCl2 1, CaCl2 1, glucose 10 e HEPES 10 (pH 7,42). </li></ol></li><li> Carregando de células do hipocampo com sonda fluorescente cálcio fura2 / AM. <ol><li> Pegue a cultura de células contendo lamelas de fora da incubadora e lave-os com meio HBS à RT, transferindo-os para uma nova placa de quatro bem multidish contendo 500 ul de HBS por poço. </li><li> Incubar as células com fura2 / AM 4 uM (preparados no mesmo meio HBS) durante 60 min à temperatura ambiente (25 ° C) em um local escuro. </li><li> Após 60 minutos, lave lamelas com meio HBS fresco. </li></ol></li><li> Gravação de imagens de fluorescência de cytosolic [Ca 2+] em células cultivadas. <ol><li> Acender a luz, microscópio, sistema de perfusão, câmera de fluorescência e computador. </li><li> Coloque as lamelas em uma plataforma com termostato paraabertas 12 mm lamelas de vidro sobre a fase de microscópio invertido e seleccionar um campo microscópico usando uma objectiva de 40x (óleo, NA: 1,3). Perfundir continuamente com células pré-aquecido (37 ° C) forma HBS na ausência ou na presença das substâncias de ensaio. Manter o fluxo a uma velocidade de cerca de 5-10 ml / min. Nota: sistema de perfusão celular para células vivas é montado em uma plataforma com termostato para abrir 12 mm lamelas de vidro. 8-linhas do sistema de perfusão conduzido por gravidade equipado com um controlador de válvula é utilizado para perfundir as soluções. Uma bomba de vácuo é responsável pela remoção de qualquer excesso de meio. As soluções são aquecidas usando um sistema de aquecimento no tubo. </li><li> Capturar uma imagem de fundo com o obturador fechado em ambos os comprimentos de onda de excitação. </li><li> Epi-iluminarem células alternadamente a 340 e 380 nm. Luz da ficha emitida a 520 nm a cada 5-10 segundos com uma câmara de fluorescência, que é filtrado por um espelho dicróico Fura-2. </li><li> Quando o período de gravação terminar, guarde a sequência completa oimagens de f emitida a 520 nm no computador para análise posterior. </li></ol></li><li> A análise das imagens gravadas fluorescentes. <ol><li> Abra o arquivo experimento. Usando o software aquacosmos, clique em &#39;Razão&#39; e selecione o intervalo proporção desejada. Calcula-se a relação pixel por pixel das imagens resultantes, a fim de se obter uma sequência de imagens de relação. </li><li> Subtrair fundo, ajustando a &quot;eliminação de fundo&quot;. Prima &#39;cálculo start&#39;. </li><li> Prima &#39;todas as vezes sequência de&#39; botão e apagar as antigas regiões de interesse (ROI). Para a análise quantitativa das células individuais, estabelecer novas regiões de interesse ou ROIs correspondentes aos neurônios individuais. Média de todos os valores de relação em cada pixel correspondente a cada ROI e cada imagem para obter uma gravação dos valores de fluorescência relação para ROIs individuais (células). </li><li> Para representar graficamente as gravações individuais exportar os valores proporção de fluorescência correspondentes a cada ROI a um progr gráficasou. </li><li> Adicione os cálculos correspondentes para estimar o tamanho dos aumentos na razão de fluorescências em resposta a cada estimulação usando uma análise de dados e gráficos de software adequado. </li></ol></li></ol> 3. Bioluminescência imagem das mitocondrial concentração de Ca2 + <ol><li> A transfecção de neurónios do hipocampo em cultura com o plasmídeo mitGAmut. NOTA: As células são primeiro transfectadas com o plasmídeo contendo uma sequência mitGAmut segmentada por mitocôndrias e aequorina uma mutação sem um local de ligação ao Ca2 + fundida à proteína fluorescente verde (GFP). Esta construção detecta grandes aumentos de Ca2 + mitocondrial na absorção e permite a identificação de células transfectadas pela fluorescência de GFP. O plasmídeo foi desenvolvido e gentilmente fornecida por P. brulet e colegas de trabalho 18 (CNRS, Paris). <ol><li> Prepare Neurobasal TF, contendo meio de cultura Neurobasal, sem soro fetal de bovino, B27, gentamice 2 mM de L-glutamina. </li><li> Preparar 50 ul de TF Neurobasal mais 2,5 mL de reagente de transfecção num frasco (solução A). Preparar 50 ul de TF Neurobasal mais 4 ^ g de plasmídeo mitGAmut num frasco (Solução B). Adicionar suavemente solução B durante solução A. Permitir a mistura, durante 20 min, sem agitação. </li><li> Transferir as lamelas contendo neurônios do hipocampo para novas placas multidish contendo 200 mL de TF Neurobasal fresco. </li><li> Adicionar gota a gota 100 ml de solução de A + B sobre cada lamela. Incubar durante 30 min. Remover o meio. Lavar uma vez com células TF Neurobasal fresco. Retorne as lamelas ao original Neurobasal Meio de Cultura. </li><li> Neurónios de cultura durante mais 24 horas adicionais a 37 ° C e 5% de CO 2 ap a transfeco para permitir a expressão eficiente e segmentação da sonda. </li></ol></li><li> Preparação de soluções de teste para imagem de bioluminescência. <ol><li> Preparar soluções de HBS contendo 100 | iM de NMDA ou KCl 145 mM comoacima (Passo 2.1). Preparar a solução de HBS contendo 10 mM Ca 2+ mais digitonina 100 uM. </li></ol></li><li> Reconstituição de aequorin segmentada por mitocôndrias com coelenterazina n. <ol><li> Lamelas de transferência contendo neurónios do hipocampo transfectadas para uma placa de quatro poços contendo 200 ul de HBS. </li><li> Adicionar 4 ul de coelenterazina N (200 uM) para 200 ul de HBS para uma concentração final de 4 | iM e misturar suavemente. Incubar durante 2 horas à temperatura ambiente (25 ° C) e no escuro. </li></ol></li><li> A gravação de imagens bioluminescência de mitocondrial [Ca 2+]. <ol><li> Ligue o microscópio, a lâmpada, o sistema de perfusão, a bioluminescência e a câmara de computador. </li><li> Transferir para um lamelas reconstituídos (37 ºC) câmara de perfusão termostatado e perfundir continuamente com uma solução pré-aquecida de HBS a uma taxa de 5-10 ml / min. </li><li> Utilizando uma objectiva de 40X (óleo, NA: 1,3), seleccionar um campo do microscópio que contém células que expressam o umpoaequorins como mostrado pela emissão de fluorescência associada com a expressão de proteína fluorescente verde (GFP) usando os filtros FITC. Um campo típico pode conter 1-2 células transfectadas. Capturar a imagem GFP fluorescência, usando uma câmera CCD. </li><li> Desligue a luz do microscópio. Retire a caixa contendo o dicróicas localizado na via de luz. Desligue a luz de excitação e fechar o dark-caixa para completa escuridão. </li><li> Perfundir células a 5-10 ml / min com meio de HBS com ou sem soluções de ensaio pré-aquecido a 37 ° C. </li><li> Capturar imagens de emissão fotônica a cada 10 segundos com uma câmera de fóton-contagem manuseados com um processador de imagem. </li><li> No final de cada experiência, permeabilizar as células com digitonina 0,1 mM em 10 mM de CaCl2 em HBS, a fim de libertar todos os restantes emissões fotónicas. Nota: Estas emissões fotônicas, devem ser adicionadas a fim de estimar o total de emissões fotônicas, um valor necessário para a calibração em concentrações de Ca2 + &lt;./ li&gt; <li> Imagens bioluminescência loja no computador a imagem de fluorescência da GFP associado com a imagem capturada antes de contagem de fótons. </li></ol></li><li> Análise de imagens bioluminescência reflectindo mitocondrial [Ca 2+]. <ol><li> Quantificar as emissões fotônicas usando software específico. Emissões fotónicas pode ser convertida em Ca 2+ concentração livre mitocondrial ([Ca 2+] MIT) utilizando o algoritmo descrito por Brini et al. 15. </li><li> Abra a imagem fluorescência da GFP e experiência. Seleccionarem regiões de interesse (ROI) com a ajuda de um software específico por o desenho da forma das células transfectadas de acordo com as imagens de fluorescência capturados no início da experiência. </li><li> Cole os mesmos ROIs em cada imagem. As emissões totais de fotônicos em cada ROI são calculadas com software específico para obter o valor de emissão de luminescência (L) para cada célula em cada ponto no tempo. </li><li> Adicione-se toda a Emiss fotônicoiões nas imagens bioluminescência, incluindo os obtidos após permeabilização digitonina, utilizando o software específico, para obter uma imagem de bioluminescência contendo todas as emissões fotónicas. </li><li> Os valores das exportações de emissões fotônicas para todas as regiões de interesse para um software específico para cálculos. Para fazer isso, clique em &#39;Gráfico&#39;, a fim de calcular os valores bioluminescência para cada ROI em cada momento. Selecione &quot;valor total&quot; e &quot;usar ROI atual para todas as imagens. Pressione &quot;calcular&quot;. Salve o &#39;txt.file&#39; e exportar dados para uma planilha. Para cada ROI [Ca 2+] mit é calculado usando o seguinte algoritmo: [Ca 2+] (m) = [I + (R · K TR) - 1] / [K R - (R K · R)]; Onde, R = [G / (G λ total)] 1 / n L é o luminescência emitida no momento da medição em cada região de interesse. L no total éa luminescência total restante após a adição das contagens presentes no tecido em que o tempo na altura da medição para cada região de interesse. λ, TR K, K R e n são constantes cujos valores dependem da combinação de aequorina (tipo selvagem ou mutado) e coelenterazin utilizado (do tipo selvagem ou de tipo n), bem como a temperatura de 16 gravação. Para a combinação usada aqui (mutado AEQ e coelenterzine n), a 37 ºC, foram utilizados os seguintes valores: R K = 8,47 x 10 7, K TR = 165,6 x 10 3, n = 1.204 e λ = 0138. </li></ol></li><li> Adicione os cálculos correspondentes para estimar o tamanho dos aumentos na bioluminescência em resposta a cada estímulo usando uma análise de dados e gráficos de software adequado. </li></ol>

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None of the authors have competing interests or conflicting interests.

A remodelação de Ca2 + intracelular homeostase no cérebro de envelhecimento tem sido relacionada à perda cognitiva, aumento da susceptibilidade à lesão isquêmica, excitotoxicidade e neurodegeneração. Para investigar esta hipótese in vitro, procedimentos de imagem Ca 2+ estão disponíveis. Infelizmente, culturas viáveis ​​de neurônios do hipocampo antigos não são confiáveis. Recentemente, tem-se observado que as culturas de longo prazo de neurónios de hipocampo de rato ...

A excitotoxicidade é um dos mecanismos mais importantes que contribuem para o dano neuronal e morte celular em insultos neurológicos tais como a isquémia, e em algumas doenças neurodegenerativas tais como a doença de Alzheimer 1. Este tipo de neurotoxicidade é mediada principalmente pela glutamato atuação no Ca 2+ -permeable, receptores NMDA (NMDAR ionotrópica) 2. A exposição de culturas de neurónios ao glutamato pode levar a excitotoxicidade 3, o que provoca a apoptose neuronal 4. Nós e outros autores relataram anteriormente que a vulnerabilidade neuronal para a apoptose induzida por NMDA podem mudar com o desenvolvimento in vitro e envelhecimento 5-8. É amplamente aceito que um aumento do free-citosólico concentração de Ca2 + ([Ca2 +] cit) leva à ativação de células. No entanto, se este aumento é muito elevada e / ou sustentada suficiente, pode desencadear a morte celular 9. Além disso, foi propostoexcitotoxicity que requer Ca 2+ mitocondrial captação de 10, uma vez que o tratamento de neurônios com um neurônios desacoplador mitocondrial protegidas contra a morte celular induzida pelo glutamato 11. Se mitocôndrias ocupam muito Ca2 +, a abertura do poro de transição da permeabilidade mitocondrial pode ocorrer, conduzindo à libertação de citocromo c e outros factores pró-apoptóticos, e induzindo a apoptose. Mostrámos recentemente que esta absorção de Ca2 + mitocondrial está directamente relacionado com a sensibilidade dependente da idade à excitotoxicidade, medindo directamente induzida por NMDA mitocondrial absorção Ca2 + nos neurónios do hipocampo individuais 5, um método que é relatado neste artigo. O hipocampo, envolvida em processos fisiológicos, tais como aprendizagem, memória e outros processos cognitivos 12, é altamente vulnerável ao envelhecimento e doenças neurodegenerativas 13. Tem sido proposto que, após várias semanas in vitro, em culturaneurônios do hipocampo mostrar uma série de características típicas de neurônios com 14. Assim, a longo prazo neurônios do hipocampo em cultura pode fornecer um modelo abrangente para investigar Ca2 + mecanismos mediados do reforço da excitotoxicidade no envelhecimento. O objectivo geral do presente método é, por conseguinte, para investigar mudanças substanciais na homeostase intracelular de Ca2 + ou Ca2 + remodelação envelhecimento no cérebro incluindo o diferencial de Ca 2+ induzidos por agonistas de respostas de receptor de NMDA em um longo prazo neurónios do hipocampo em cultura . O método inclui uma descrição detalhada da cultura de neurónios de hipocampo de rato e a monitorização das concentrações citosólicas e mitocondriais Ca 2+ por fluorescência e imagem de bioluminescência em neurónios individuais, respectivamente. Imagiologia de fluorescência de Ca2 + citosólico em culturas de neurónios é um procedimento padrão. No entanto, este método é menos fiável para a subcelular de Ca2 + mitocondrial incluindo medições de Ca 2+. As razões para isso incluem a falta de direcionamento adequado de sondas sintéticas e afinidade inadequado para as concentrações de Ca2 + que podem mudar na mitocôndria do nível mM baixa, mesmo com o nível mM. O uso de sondas de Ca 2+ com base em proteínas como por exemplo a aequorina, tem permitido o direccionamento para organelos subcelulares e a utilização de derivados diferentes afinidades de Ca2 + utilizando diferentes sondas coelenterazines ou mutadas falta Ca 2+ sítios de ligação específica 15. Desta forma, a bioluminescência de imagem de células que expressam aequorin segmentada por mitocôndrias pode permitir o controlo das concentrações de Ca2 + mitocondrial em neurônios individuais. No entanto, este procedimento pode exigir o uso de câmeras de contagem de fótons ou câmeras CCD ultra-sensíveis para a bioluminescência de imagem 16-18. Este método pode produzir novos resultados que devem ser confirmados em mais established modelos de envelhecimento do cérebro como, por exemplo, fatias de cérebro de animais velhos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurobasal Culture Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31330-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I (from bovine pancreas)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bobine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE14-801E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm glass coverslips</td>
			<td>Labolan</td>
			<td>0111520/20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well multidish plaques</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petry dishes</td>
			<td>JD Catalan s.l.</td>
			<td>2120044T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>431030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura2-AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine n</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>BT-10115-2250 uG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDA</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>M3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovert S100 TV microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcite ilumination system</td>
			<td>EXFO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA ER fluorescence camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIM photon counting CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VC-8 valve controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-27B heating system&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquacosmos Software</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence and bioluminescence imaging of subcellular ca2+ in aged hippocampal neurons

Suscetibilidade a morte celular neuronal associada a neurodegeneração e isquemia são extremamente aumentada no cérebro envelhecido mas os mecanismos responsáveis ​​são mal conhecidos. A excitotoxicidade, um processo que se acredita contribuir para a lesão neuronal induzida por ambos os insultos, é mediada pela activação de receptores de glutamato que promove influxo de Ca2 + mitocondrial e sobrecarga de Ca2 +. Uma mudança substancial na homeostase intracelular de Ca2 + ou remodelação de Ca2 + intracelular homeostase pode favorecer danos aos neurônios nos neurônios velhos. Para investigar Ca 2+ remodelação no envelhecimento temos usado imagens de células vivas em culturas de longo prazo de neurônios do hipocampo de ratos que se assemelham em alguns aspectos neurônios in vivo com idade. Para este fim, as células do hipocampo são, em primeiro lugar, recém-dispersa de novas hipocampo de ratos recém nascidos e semeadas em lamelas revestido, vidro poli-D-lisina. Em seguida, as culturas são mantidas em meios controlada durante vários dias ou vários weeks para investigar jovens e velhos neurônios, respectivamente. Em segundo lugar, os neurónios em cultura são carregados com fura2 e submetido à medição da concentração citosólica de Ca2 + utilizando imagiologia digital de relação de fluorescência. Em terceiro lugar, neurônios cultivados são transfectadas com plasmídeos que expressam um conjunto de aequorin baixa afinidade e GFP alvejado a mitocôndria. Após 24 horas, aequorin dentro das células é reconstituído com coelenterazina e neurônios são sujeitas a imagem de bioluminescência para monitorização da concentração de Ca2 + mitocondrial. Este processo de três passos permite a monitorização de citosólica e respostas de Ca 2+ mitocondriais a estímulos relevantes como, por exemplo, o agonista do receptor de glutamato NMDA e comparar se estas e outras respostas são influenciadas pelo envelhecimento. Este processo pode produzir novos conhecimentos sobre a forma como o envelhecimento e influência citosólica de Ca2 + mitocondrial respostas a estímulos seleccionados, bem como o teste de fármacos seleccionados que visam prevenir células neuronaismorte em doenças relacionadas à idade.

Aqui, descrevemos um método simples para avaliar Ca2 + remodelação e os efeitos de NMDA no citosol e mitocondrial [Ca2 +], em neurónios envelhecidos. A Figura 1 mostra o diagrama esquemático do processo para o isolamento e a cultura de neurónios de hipocampo de ratos recém-nascidos. Antes de começar, precisamos preparar estéreis, revestidos, lamelas de vidro poli-D lisina e localizá-los em um 4-bem prato. Então, ratos recém-nascidos são mortos eo cérebro removido. Ap?...

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Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Fluorescência e imagem de bioluminescência subcelular Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Aged em neurônios do hipocampo

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

fluorescence-bioluminescence-imaging-subcellular-ca2-aged-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

8.3K visualizações.  Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas. Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging. 

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Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection e Cultura Primária de Neurônios do hipocampo do rato embrionárias e Cortical

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Neurociência

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Recuperação de fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) de fluorescência Proteínas Tagged em espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo Cultivadas

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Neuromodulação e Transportes mitocondrial: Imagens ao vivo em neurônios do hipocampo durante muito tempo

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Isolamento e Cultura de neurônios do hipocampo de ratos pré-natal

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

Ensaio danos no DNA em neurônios do hipocampo Usando o Ensaio Cometa

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Fosfato de cálcio transfecção de primário neurônios do hipocampo

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

Imagiologia espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo de rato primária usando Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

In Situ Ca 2+ Imagem do Sistema Nervoso Entérico

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

Avaliação da complexidade dendrítica do hipocampo em ratos idosos usando o método de Golgi-Cox

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.