Este protocolo pode ser usado para correlacionar padrões de atividade de cálcio com expressão genética no nível único celular capacitando pesquisadores a investigar novas questões sobre as relações entre essas duas características. Em contraste com abordagens anteriores, que normalmente estudam tecidos inteiros, nossa técnica se aproxima do nível celular único, permitindo-nos avaliar as relações autônomas celulares entre a atividade de cálcio e a expressão genética. Comece por UV esterilizando duas placas de Petri de plástico de 35 milímetros e uma placa de cultura celular de 35 milímetros por aproximadamente 30 minutos.
Trabalhando na capa de fluxo laminar, adicione 10 mililitros de duas soluçãos de cálcio milimil para cada um dos dois tubos cônicos plásticos de 50 mililitros, uma placa de Petri esterilizada por UV e a placa de cultura celular esterilizada por UV. Adicione dois mililitros de solução livre de cálcio e magnésio à outra placa de Petri esterilizada por UV e encha duas placas de Petri de plástico de 100 milímetros e uma placa de Petri de plástico de 35 milímetros com 0,1X MMR suplementada com gentamicina. Em seguida, encha uma placa de Petri de plástico de 60 milímetros com 70% de etanol.
Imediatamente antes da dissecção, misture completamente 0,01 gramas de colágeno B em um tubo de solução de cálcio. Adicione a solução a uma nova placa de Petri de plástico de 60 milímetros e use um microscópio de dissecação para identificar embriões do estágio de desenvolvimento desejado. Use uma pipeta de transferência estéril para mover pelo menos seis embriões apropriados em uma placa de 100 milímetros contendo MMR mais gentamicina.
Em seguida, mova um embrião da placa de retenção para a segunda placa de 100 milímetros de MMR mais gentamicina e coloque esta placa de dissecção sob o microscópio. Usando um par de fórceps contundentes para estabilizar o embrião, retire cuidadosamente a membrana vitelline ao redor do embrião com um par de fórceps finos. Quando toda a membrana tiver sido removida, use os fórceps finos para beliscar o embrião ao longo do eixo posterior anterior para separar as regiões dorsal e ventral.
Use a nova pipeta de transferência estéril para transferir a porção dorsal para a placa de 60 milímetros de solução colágena por um a dois minutos antes de transferir cuidadosamente o espécime de volta para a placa de dissecção. Para completar a dissecção, remova cuidadosamente toda a contaminação endodérmica e mesodérmica residual do tecido neural presunçoso do ectoderme e transfira suavemente a explanta para a placa de 35 milímetros de solução de cálcio. Quando mais três explantas forem coletadas, use uma micropipette P1000 para transferir todas as quatro explantas para a placa de 35 milímetros de solução livre de cálcio e magnésio, tomando cuidado para evitar qualquer contato entre as explantas e a interface de água do ar.
Em seguida, gire suavemente o prato de modo que todas as explantas se aglomeram no centro da placa e incubam os espécimes por uma hora em temperatura ambiente para permitir que os tecidos se dissociem. Durante esta incubação, transfira os dois últimos embriões para o segundo prato de RMM com gentamicina, e cubra o prato para permitir que esses espécimes se desenvolvam sem serem perturbados. No final da incubação, use super cola para anexar um deslizamento de cobertura micro-governado ao fundo do prato de cultura celular de 35 milímetros e use uma micropipette P100 para coletar as explantas dissociadas.
Segurando a pipeta em um ângulo raso perto da superfície do prato de cultura celular, posicione a ponta da pipeta no canto da grade voltada para dentro e expulse firmemente a suspensão celular através da área gridded. Idealmente, as células se estabelecerão em um aglomerado apertado e denso. Deixe as células aderirem à placa durante uma hora em temperatura ambiente.
Enquanto as células estão se instalando, determine e regise o estágio de desenvolvimento dos embriões de controle de irmãos. No final da incubação, mova o prato de amostra para um local protegido pela luz e aspire 100 microliters de solução a partir da borda do prato. Misture esta solução com sete microlitadores de uma solução de ácido Fluo-4 AM Pluronic F127 recém-preparada com tubos para cima e para baixo antes de devolver o volume total ao prato de amostra.
Gire suavemente para misturar e cobrir a placa com papel alumínio. Depois de uma hora em temperatura ambiente, substitua um mililitro do prato de cultura de plantas com três mililitros de dois milimiliar frescos de solução de cálcio. Em seguida, substitua três mililitros de supernascentes por três mililitros de solução de cálcio fresco mais duas vezes.
Para a imagem de atividade de cálcio dentro das explantas, coloque a placa de amostra no estágio de um microscópio confocal invertido protegido da exposição à luz ambiente e use um marcador para rotular o ponto frontal da placa para que o mesmo campo de visão possa ser encontrado em sessões de imagem subsequentes. Use os objetivos 10 e 20 vezes para localizar uma amostra sob o microscópio e selecionar um campo de visão apropriado que seja denso celular, mas não tão denso que as células sejam agrupadas ou difíceis de distinguir individualmente. Ajuste o foco do microscópio para que o deslizamento de cobertura regido pela grade seja visível, alterando o campo de visão original até que um número identificável esteja no quadro conforme necessário.
Obtenha uma imagem de campo brilhante do campo de visão selecionado com o deslizamento de cobertura regido pela grade em foco e uma imagem de campo brilhante do campo de visão selecionado com as células em foco. Sem uma imagem clara do deslizamento de cobertura gridded e do campo de visão, você não será capaz de co-registrar suas células com aquelas nas imagens de peixe que você vai gerar mais tarde. Em seguida, ilumine as amostras com um laser de 488 nanômetros.
Durante uma imagem de duas horas, modifique a configuração de imagem para gravar 901 quadros com um tempo de varredura de 3,93 segundos em um intervalo de oito segundos antes de executar a configuração para adquirir a imagem. Uma vez que a imagem esteja completa, remova a placa do estágio do microscópio e substitua o supernascer de cultura por um mililitro de 1X MEMFA para uma incubação de duas horas à temperatura ambiente, tomando o cuidado de registrar o estágio de desenvolvimento dos embriões de controle de irmãos no início da incubação. A visualização de uma trama composta contendo traços para todas as células registradas em um experimento revela o grau em que as medições em massa ou populacionais podem obscurecer padrões mais nuances de comportamento spiking.
Quando os perfis registrados de células individuais são isolados, podem ser claramente identificados exemplos da atividade irregular de espigão característica das células progenitoras neurais. Para quantificar essa complexidade, diferentes métodos de análise de dados podem ser aplicados, incluindo parâmetros diversos para definir um pico. Se as placas forem manuseadas aproximadamente ou as lavagens forem executadas com muita força durante a hibridização fluorescente in situ, as células podem ser desalojadas das superfícies da placa, impossibilitando que as células sejam combinadas através de imagens.
Se essa interrupção afetar apenas algumas das células do campo de visão, ainda pode ser possível detectar e atribuir algumas das células dentro da imagem. No entanto, a quantidade máxima de dados é obtida a partir de um experimento no qual a hibridização é realizada cuidadosamente e poucas células são perdidas ou reposicionadas entre imagens. Os resultados de experimentos que colam atividade de cálcio com a expressão de genes marcadores progenitores neurais podem revelar inúmeras associações entre padrões específicos de atividade de cálcio e fenótipos neurotransmissores.
Com esses dados, os pesquisadores podem sondar características mais complexas desses padrões dinâmicos de cálcio e as relações com a expressão genética, em vez de ficarem restritos à simples contagem de picos.
