Os autores gostariam de agradecer Dr. Isaac Zambrano e a equipe do Manchester Eye Hospital Banco de Olhos para o fornecimento de tecido ocular doador humano, e Mr. Pete Walker da Faculdade de Ciências da Vida Histologia facilidade para as imagens H &amp; E manchados. Um agradecimento especial vai para o Sr. Roger Meadows por sua ajuda com a microscopia. SJC é um receptor de um Conselho de Investigação Médica de Desenvolvimento (MRC) Carreira Fellowship (MR / K024418 / 1) e os autores reconhecem também outras fontes de financiamento recente pesquisa da RMC (G0900538 e K004441), Luta pela Sight (1866) e A Sociedade Macular.

Tecido do olho humano para fins de investigação consentido foi obtido a partir de Manchester Royal olho Hospital Banco olho a seguir à remoção da córnea para o transplante. O uso de tecidos humanos para a pesquisa foi de acordo com a Human Tissue Act (2004) orientações, e com aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade (referência 11305). 1. Enriquecimento da membrana de Bruch Whole <ol><li> Limpar o espaço de trabalho em torno e por baixo do microscópio de dissecação com um desinfectante% (v / v) e, em seguida, limpar com 70% (v / v) de etanol. </li><li> Garantir a seguir estão à mão: uma nova bisturi descartável, dois raspadores estéreis celulares (comumente utilizados na cultura de tecidos) e três pares de pinças (listadas aqui como A, B, e C, veja a lista de materiais). </li><li> Colocar o globo ocular descartável numa placa de petri, a tampa de retenção para uso posterior. Usando uma nova bisturi descartável, remover qualquer nervo óptico residual, o que pode interferir com a criação de um plano mount do tecido. Em seguida, fazem quatro incisões igualmente espaçadas para além de criar quatro quadrantes, se proceder à parte 3 (enriquecimento da membrana de Bruch macular) não cortar através da região da mácula. <ol><li> Assegurar que as incisões estendem-se através de toda a profundidade do tecido ocular - a partir da retina neurosensorial mais interna (NSR), através da da coróide e esclera (branco do olho). Continuar a incisão todo o caminho volta do olho a partir da margem da ocular para o nervo óptico. Isto irá permitir que a ocular para ser achatado (ver Figura 1B). </li></ol></li><li> Segurando um quadrante da ocular achatada usando pinça A (para evitar a separação coróide), utilizar o maior pinça B para agarrar o RSN vítreo e subjacente e puxar este tecido para longe do epitélio pigmentado da retina (RPE), a partir da periferia, movendo-se em direcção ao centro da ocular aberto e, em seguida, para o lado oposto. Geralmente, mas não sempre, tanto vítreo e NSR separar como um. Use a scalpel para excisar qualquer NSR residual ancorado no disco óptico. </li><li> Mais uma vez, enquanto se mantém um quadrante do tecido no local usando uma pinça, utilizar o raspador de células estéril para desalojar cuidadosamente a monocamada de EPR de toda a superfície interior da viseira. Estas células prontamente separar e pode ser visto aglomerados castanho-escuros como pigmentadas. Lavar com PBS para lavar delicadamente células RPE longe desalojado do ocular. </li><li> Em seguida, use pinça A descascar delicadamente fora do sobreposto tecido vermelho escuro (compreendendo tanto a membrana de Bruch e coróide) de todos os 4 quadrantes oculares. Colocar o tecido excisado em um prato limpo. </li><li> Usando a borda achatada de um raspador de células para manter o tecido extirpado no lugar, usar o segundo raspador para raspar suavemente o tecido. Vire o tecido e repetir, removendo o máximo de material possível excesso. Eventualmente, uma membrana translúcida permanecerá: é a membrana de Bruch grosseiramente enriquecido. O uso do microscópio de dissecação numa ampliação de 20X mínimo éessencial em auxiliar a remoção da coróide e enriquecimento da membrana de Bruch. </li><li> Usando uma pipeta de Pasteur, brevemente enxaguado membrana de Bruch com água ultrapura para remover sangue e coróide residual antes de colocar a membrana para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Suspender a membrana de Bruch enriquecido em cerca de 1 ml de água ultrapura e vortex brevemente (aproximadamente 15 segundos) para ajudar a lise celular contaminante qualquer matéria (ver Figura 2). Centrifugar a amostra a 500 xg durante 30 seg para sedimentar a membrana e aspirar o sobrenadante. Nota: Os restantes membrana de Bruch enriquecido está agora pronto para a solubilização (como descrito na secção 2 abaixo) ou de armazenamento a -80 ° C para uso posterior. </li></ol> 2. A solubilização de membrana e Western Blot Análise da Whole Enriched Bruch <ol><li> Extracto de proteína de membrana de Bruch enriquecido por imersão do tecido em 500 ul 8 M urEA durante 6 h à TA, em 1,5 ml de tubos de microcentrífuga (Figura 3A). </li><li> Centrifugar as amostras solubilizadas a 10.000 xg durante 10 min para sedimentar qualquer matéria extracelular restante. Remover o sobrenadante e transferi-lo para 3500 da membrana de diálise de MWCO, em seguida, colocar a amostra em 1 L de PBS a diálise durante 16 horas a 4 ° C. </li><li> Para cada amostra, adicionar 40 ul de pérolas de isolamento de proteínas, e rodar amostra / mistura de esferas (20 rpm num misturador rotativo) à TA durante 30 min. </li><li> Centrifugar as amostras a 10.000 xg durante 5 min para sedimentar as pérolas. Remover o sobrenadante e solubilizar a proteína ligada a esferas em 30 ul de 2x tampão de carregamento de amostra (65,8 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,1% de SDS, 26,3% (w / v) de glicerol, 0,01% azul de bromofenol, 3% β-mercaptoetanol). </li><li> Incubar as amostras a 100 ° C durante 10 min, e depois centrifugar a 10000 xg durante 5 min para sedimentar as restantes grânulos. </li><li> Carrega-se o sobrenadante que contém as proteínas libertadas para um pré-molde SDS-gel página gradiente (ver lista de materiais) para separação das proteínas. </li><li> Visualize bandas de proteínas separadas usando um protocolo de coloração comum, por exemplo, azul de Coomassie. <ol><li> Em breve, adicionar 20 ml de azul brilhante mancha (0,1% de azul brilhante (w / v), 50% de metanol, 10% de ácido acético glacial, 40% de água) para o gel, e incubar durante 30 min à temperatura ambiente com agitação suave . </li><li> Descartar a solução de coloração e lavar o gel corado com água desionizada até que a coloração de fundo é suficientemente reduzida para permitir a visualização da banda de proteína manchada. </li><li> Alternativamente, as bandas de proteína de transferência separados para nitrocelulose para análise de Western, como descrito a seguir. </li></ol></li><li> Transferência de bandas de proteínas separadas para membrana de nitrocelulose a 80 mA durante 2,5 horas utilizando um aparelho de transferência semi-seco, em tampão de transferência (Tris 25 mM, glicina 192 mM, 10% [v / v] metanol). </li><li> Bloquear a membrana em 10 ml de PBS, 10% (w / v) de leite, e 0,02% (w / v) de BSA durante 16 h a 4 ° C antes de the adição dos anticorpos primários para a detecção de proteínas desejadas. Nota: A título de exemplo aqui, a Figura 3C mostra uma imunotransferência representante da membrana de Bruch solubilizado a partir de três dadores distintos sondadas para um regulador da cascata do complemento, o factor H como proteínas-1 (FHL-1). </li></ol> 3. O enriquecimento da membrana de Bruch Macular <ol><li> Siga os passos 1,1-1,3, como descrito anteriormente. </li><li> Embora o RSN ainda está no local, localizar a coloração foveal amarelo que representa a região central mácula (ver Figura 4). Usando um estéril 6 milímetros biópsia, colocá-lo acima da região foveal e firmemente cortar para a mácula. <ol><li> Mantendo o punção para biópsia no lugar, fazer uma incisão separada com um bisturi a partir da borda da ocular para a borda da lâmina de biópsia por punção, e em seguida, usando pinça B, descascar o material circundante do olho para conseguir uma biópsia limpo. </li></ol></li><li> Usando pinça C, removao disco de 6 milímetros de tecido do soco e lugar na tampa limpo placa de Petri. Coloque a tampa uma placa de Petri e soco macular sob o microscópio de dissecação. </li><li> Retire o disco NSR fina (para verificar a coloração amarela foveal para inferir a precisão da biópsia). Use um raspador de células esterilizado para remover suavemente as células RPE. </li><li> Fixe o disco macular através da esclera usando as pontas de pinça A, e, lentamente, retire o coróide e complexa membrana de Bruch usando pinça C. Mais uma vez, use o raspador de células para remover coróide indesejada e matéria de sangue de membrana de Bruch. </li><li> Colocar a membrana de Bruch macular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e suspender em 1 ml de água ultrapura. Vortex brevemente (cerca de 15 segundos) para ajudar a lisar qualquer matéria celular contaminante. Centrifugar a amostra a 500 xg durante 30 seg para sedimentar a membrana e aspirar o sobrenadante. Nota: A membrana de Bruch enriquecido isolado a partir da mácula pode agora ser utilizado para uma proteomicANÁLISE usando protocolos de digestão de preferência do usuário. </li></ol>

<ol>
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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+factor+H+variant+increases+the+risk+of+age-related+macular+degeneration.">Complement factor H variant increases the risk of age-related macular degeneration.</a> Science. 308 (5720), 419-421 (2005).</li><li>Edwards, A. O., Ritter, R., Abel, K. J., Manning, A., Panhuysen, C., Farrer, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+factor+H+polymorphism+and+age-related+macular+degeneration.">Complement factor H polymorphism and age-related macular degeneration.</a> Science. 308 (5720), 421-424 (2005).</li><li>Fritsche, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+new+loci+associated+with+age-related+macular+degeneration.">Seven new loci associated with age-related macular degeneration.</a> Nat Genet. 45 (4), 433-439 (2013).</li><li>Clark, S., Bishop, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Factor+H+and+Related+Proteins+in+Regulating+Complement+Activation+in+the+Macula,+and+Relevance+to+Age-Related+Macular+Degeneration.">Role of Factor H and Related Proteins in Regulating Complement Activation in the Macula, and Relevance to Age-Related Macular Degeneration.</a> J Clin Med. 4 (1), 18-31 (2014).</li><li>Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+the+complement+control+protein+factor+H+(beta+1+H).">Monoclonal antibodies against the complement control protein factor H (beta 1 H).</a> Biosci Rep. 3 (12), 1119-1131 (1983).</li><li>Ripoche, J., Day, A. J., Harris, T. J., Sim, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+amino+acid+sequence+of+human+complement+factor+H.">The complete amino acid sequence of human complement factor H.</a> Biochem J. 249 (2), 593-602 (1988).</li><li>Moore, D. J., Clover, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+age+on+the+macromolecular+permeability+of+human+Bruch&#8217;s+membrane.">The effect of age on the macromolecular permeability of human Bruch&#8217;s membrane.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. I. 42 (12), 2970-2975 (2001).</li><li>McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration+and+the+role+of+the+complement+system.">Age-related macular degeneration and the role of the complement system.</a> Mol Immunol. 67 (1), 43-50 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Aqui descrevemos o enriquecimento da membrana de Bruch, para posterior análise permitir análises subsequentes, incluindo Western blotting 11, espectrometria de massa e as propriedades de difusão da membrana de Bruch, utilizando câmaras de Ussing modificada 11,14. As etapas críticas incluem: a) a raspagem completa e a lavagem da superfície interior do olho para remover todas as células RPE b) a raspagem repetida e cuidadosa da coroideia subjacente sem causar o de Bruch a desintegrar-se e c) lavagem do Bruch excisado do em água ultrapura para assegurar a lise das células residuais. Além disso, se a membrana de Bruch enriquecido é para ser utilizado para análise proteómica, extracção da proteína por tratamento com ureia é o mais eficaz na quebra deste tecido resiliente, em comparação com outros métodos, como a homogeneização mecânica. Histologia de membrana de Bruch enriquecido indica no ECM do coriocapilar não é removido. Isso é para ser exrados como a camada externa da membrana de Bruch, a pentilaminar é formado por coriocapilar membranas basais de células endoteliais. Com efeito, pode ser vantajoso que a ECM do coriocapilar permanece quando ocorrem alterações nesta em AMD, incluindo a deposição do complexo terminal do complemento complexo de ataque / membrana (MAC) 15. Deve notar-se que, para análise histológica detalhada da membrana de Bruch, a sua estrutura seria melhor preservada se seccionado na presença da esclerótica, coróide e a membrana de Bruch. Com efeito, a histologia apresentado na Figura 2 destina-se apenas para demonstrar o grau de enriquecimento resultante da técnica descrita neste manuscrito. Enriquecimento de Bruch do macular requer dissecção cuidadosa do ocular, assegurando que o RSN e particularmente a fóvea não são danificadas; outra forma de identificação e, assim, o isolamento da mácula não são possíveis. A integridade do tissue também é importante para o presente processo e, por conseguinte, recomenda-se que as amostras com menos de 48 horas de tempo de pós-mortem ser utilizado. O grau de enriquecimento requerido varia entre dadores e pode ser afectada pela idade do doador, tempo post-mortem, e a presença de qualquer patologia do olho. O uso do termo enriquecido é deliberada em reconhecer uma limitação da técnica, sendo que esta &quot;purificação&quot; ou &quot;isolamento&quot; de membrana de Bruch usando este método não é simplesmente possível. Com efeito, dado que a ECM do coriocapilar se funde com a membrana de Bruch há separação completa não é viável. Compreender as alterações bioquímicas dos respectivos tecidos oculares é essencial para compreender a progressão da doença ocular. Este enriquecimento única de membrana de Bruch facilita esse entendimento; estudos em curso estão a investigar o proteoma de macular enriquecido membrana de Bruch utilizando espectrometria de massa em diferentes fases da AMDe em amostras provenientes de indivíduos com diferentes genótipos para melhorar a compreensão da patologia molecular da AMD. Já a técnica descrita aqui foi usada com sucesso para identificar FHL-1 como o regulador de complemento predominante na membrana 11 e mais estudos sobre membrana de Bruch enriquecido de Bruch são susceptíveis de resultar em mais novas perspectivas sobre a patologia molecular da AMD.

O uso de post mortem tecido ocular humano na investigação oftalmológica é um recurso inestimável para a compreensão da patogênese da doença do olho. Análise de doadores olhos humanos tem feito importantes contribuições para discernir os mecanismos subjacentes relacionadas com a idade degeneração macular (AMD), que é a principal causa de cegueira no mundo ocidental 1. Globalmente, a AMD é responsável por aproximadamente 8,7% de toda a cegueira e com uma população cada vez mais envelhecida, prevê-se a afectar 196 milhões de pessoas por resultados de 2020 2. AMD na perda da visão central e tem um profundo impacto sobre a independência ea qualidade de vida do paciente 3. Cedo AMD é caracterizada pela formação de drusas e pode progredir para atrofia geográfica (por vezes referido como &quot;seco&quot; AMD), ou a neovascularização coroidal (também referido como neovascular ou &quot;húmida&quot; AMD). Enquanto anti-VEGF injeções pode estabilizar ou melhorar a visão em DMRI neovascular que iNão é curativa, e no presente, não existe nenhum tratamento para a atrofia geográfica. Embora certas variantes genéticas têm sido mostrados para modificar a AMD risco 4 - 8, pouco é conhecido sobre como essas variantes afectam a mácula a um nível bioquímico. Um local importante na patogênese AMD é a membrana de Bruch. Forma drusas dentro desta estrutura e vários estudos têm fornecido evidências de ativação do complemento e em torno de membrana de Bruch em 9 AMD. Membrana de Bruch é uma folha de matriz extracelular, que separa as células do epitélio pigmentado da retina (RPE) da coróide, e é de aproximadamente 4 mm de espessura. Membrana de Bruch se funde com as coriocapilar, uma camada da coróide que contém capilares fenestradas e externo a este são camadas que contêm vasos sanguíneos maiores 10 (Figura 1A). Membrana de Bruch é uma folha pentilaminar de extrasmatriz celular (ECM), e esta metodologia detalhes como isolar a membrana de Bruch, juntamente com o ECM dos coriocapilares subjacentes (doravante referida membrana de Bruch enriquecido), o qual é em grande parte descelularizado e livre de células vermelhas do sangue. Enriquecido membrana de Bruch foi então usado para secar e histologia experimentos ocidentais. Além disso, a metodologia para enriquecer a membrana de Bruch unicamente a partir da região macular do olho é descrito, que será de particular interesse para aqueles investigar os aspectos bioquímicos da AMD.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Auxillary objective 0.5x</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>3638</td>
			<td>Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch 6mm</td>
			<td>Oncall Medical Supplies</td>
			<td>SCH-33-36</td>
			<td>6mm Biopsy Punches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.183</td>
			<td>For membrane enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyroPure Cyrovials</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12387999</td>
			<td>Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Gooseneck LED spot lights on 30cm arms</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>0153</td>
			<td>Flexible light source essential for dissection and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(A) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4280</td>
			<td>(A) Fine (100mm) and straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(B) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4272</td>
			<td>(B) Broad and blunt (150mm). Useful for lifting large portions of sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(C) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4323</td>
			<td>(C) Straight fine points</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>G1345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GXCAM 5 digital colour camera &#38; GT-Vision software</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M/4000/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>90mm, used as a dish for samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein isolation beads (Strataclean resin)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400714-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7x-45x)</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>5595</td>
			<td>Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of bruch's membrane from human donor eyes

Degeneração macular (AMD) relacionada à idade é a principal causa de deficiência visual no mundo desenvolvido. A doença manifesta-se pela destruição do centro da retina, chamado a mácula, o que resulta na perda da visão central. No início AMD é caracterizada pela presença de lesões pequenas, amareladas chamados drusas moles que pode progredir para DMRI tardia, tais como atrofia geográfica (secar AMD) ou neovascularização (DMRI úmida). Embora as alterações clínicas estão bem descritos, ea compreensão das influências genéticas sobre conferindo risco AMD estão ficando cada vez mais detalhada, uma área carente grande progresso é uma compreensão das conseqüências bioquímicas de risco genético. Isto é em parte devido à dificuldade em compreender a bioquímica da membrana de Bruch, uma matriz extracelular muito fino que funciona como um filtro biológico do material a partir do fornecimento de sangue e um andaime sobre o qual o pigmento retiniano epitelial (EPR) monocamada de células reside. Drusas form dentro de membrana de Bruch e sua presença perturba o fluxo de nutrientes para as células RPE. Só por investigar a composição de proteína de membrana de Bruch, e de fato como outras proteínas interagem com ele, pode pesquisadores esperam desvendar os mecanismos bioquímicos que sustentam a formação de drusas, desenvolvimento da AMD e perda de visão subsequente. Este artigo apresenta metodologias para o enriquecimento de qualquer membrana de Bruch conjunto, ou apenas a partir da região da mácula, para que ele possa ser utilizado para análise bioquímica jusante, e proporcionam exemplos de como isto já está a mudar a compreensão da bioquímica membrana de Bruch.

O protocolo descrito acima para produzir resultados membrana de Bruch enriquecido no isolamento da membrana de Bruch, a matriz extracelular da camada coreocapilar e remove a maior parte das células / detritos celulares, incluindo todos os EPR (Figura 2). A lavagem da membrana de Bruch enriquecido em água é um passo fundamental na lise qualquer restantes células coróide. A pressão exercida durante a demolição do coróide aparece para compactar alguns dos poucos núcleos de células remanescente para a região definida como membrana de Bruch (Figura 2B). A solubilização da membrana de Bruch enriquecido permite a análise a jusante do seu teor de proteína. A separação de bandas de proteína a partir solubilizado enriquecido membrana de Bruch com um 4 - em gel de gradiente de SDS-PAGE a 12%, enquanto não é útil por direito próprio para identificar o conteúdo de proteína, faz demonstrar a capacidade desta técnica para minimizar a proteínas do sangue contaminantes que ARe não especificamente ligado (Figura 3B). A este respeito, uma notável ausência do gel proteico de execução é uma banda considerável de albumina de soro humano (~ 66 kDa) que podem de outra forma tornar subsequentes Western Blotting mais difíceis de interpretar: A análise histológica da membrana enriquecida de Bruch mostrado na Figura 2 também suporta esta. Com efeito, como parte do trabalho descrito previamente 11, membrana de Bruch solubilizado a partir de uma série de dadores individuais foram sondadas por um número de proteínas utilizando anticorpos específicos através de Western blotting (Figura 3C). No caso mostrado aqui, um anticorpo (denominado OX23) 12 dirigido contra um 155 kDa regulador de imunidade inata, denominado factor H do complemento (FH), foi usada e demonstraram a presença de uma banda de menor peso molecular em amostras de membrana de Bruch de três separados dadores (Figura 3C). Este, posteriormente, acabou por ser o factor H-como proteína 1 (FHL-1), Uma proteína de 49 kDa relacionada com FH e resultante de uma variação de splicing do gene da 13 mesma. FHL-1 parece ser o principal regulador do complemento presentes na membrana de Bruch 11. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig1.jpg" /> Figura 1. Dissecção do olho humano e enriquecimento da membrana de Bruch. (A) da membrana de Bruch é uma barreira de matriz extracelular. A coróide contém uma camada de capilares fenestradas que se fundem continuamente na membrana de Bruch (chamado o coriocapilar) e estes separar do resto da coróide (contendo grandes vasos sanguíneos) a partir do epitélio pigmentado da retina (RPE) monocamada de células, que, fisiologicamente, suporta as células fotorreceptoras da retina neurossensorial (NSR). (B) Quatro incisões na ocular humano são feitos permitindo que ele seja aberto para criar uma montagem plana. ovítreo pode ser removido com a utilização de uma pinça. O NSR podem soltar-se juntamente com o vítreo, mas também pode ser removida com uma pinça. Um raspador de células é utilizado para remover a camada de células EPR da membrana de Bruch, enquanto ele ainda está ancorada na coróide e esclera. Complexo membrana / A coróide de Bruch pode ser retirado da esclera e usando um novo raspador de células, a coróide exterior pode ser removida. A lavagem final em água ultrapura lisa qualquer matéria celular restante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig2.jpg" /> Figura 2. A histologia da membrana de Bruch e as secções coróide. Coradas com H &amp; E antes (A) e após (B) raspando as estruturas de membrana exteriores da coróide e lavagem de Bruch em WA ultrapurater enriquecido para gerar membrana de Bruch. Barras de escala representam 20 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig3.jpg" /> Figura 3. A solubilização da membrana de Bruch enriquecido pela análise de conteúdo de proteína. (A) A proteína pode ser extraída a partir da membrana de Bruch enriquecido por incubação em ureia 8 M para 6 horas à TA, antes de ser dialisada contra PBS. Para análise de Western, as proteínas provenientes de todo o dialisado da membrana de Bruch pode ser isolado utilizando esferas de isolamento de proteína e eluiu-se por ebulição com Laemmli reduzindo tampão de carregamento de amostra. (B) Um representante azul de Coomassie corados em gel de SDS-PAGE, mostrando tanto puro e diluída solubilizada de membrana de Bruch (BM), utilizando o método d. escribed em (A) (C) Um western blot representante da membrana de Bruch solubilizado a partir de 3 doadores individuais (pistas 1-3). sondado para o factor H-como proteína 1 (FHL-1) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior este valor.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig4.jpg" /> Figura 4. Isolamento da membrana de Bruch enriquecido da mácula. A região macular da retina é uma área de 5 mm que podem ser prontamente identificadas pela coloração amarela da fóvea sobrejacente, e a sua proximidade ao disco óptico adjacente. Usando a fóvea como um guia, coloque uma biópsia por punção 6 mm no olho humano plana montada para excisar um bloco de tecido mácula 6 mm. Remova a NSR sobrejacente e raspar células EPR a partir da mácula extirpado. Complexo membrana / coróide O restante de Bruch pode on ser retirado da esclera e completamente raspada para remover coróide, lyse restante material celular por submersão em água ultrapura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes

Identifying proteins specifically associated with Bruch&#8217;s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

Enriquecimento da membrana de Bruch de Olhos dador humano

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of visual impairment in the developed world. The disease manifests itself by the destruction of ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.0K visualizações.  University of Manchester. Identifying proteins specifically associated with Bruch’s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

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Isolation, Enrichment, and Maintenance of Medulloblastoma Stem Cells

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been generally adopted to study the nature of neural stem cells, including those derived from normal and tumorous tissues. However, appreciable amounts of differentiation and cell death are common in cultured neurospheres likely due to sub-optimal condition such as accessibility of all cells within sphere aggregates to culture medium.
Medulloblastoma, the most common pediatric CNS tumor, is characterized by its rapid progression and tendency to spread along the entire brain-spinal axis with dismal clinical outcome. Medulloblastoma is a neuroepithelial tumor of the cerebellum, accounting for 20% and 40% of intracranial and posterior fossa tumor in childhood, respectively1. It is now well established that Shh signaling stimulates proliferation of cerebellar granule neuron precursors (CGNPs) during cerebellar development 2-4. Numerous studies using mouse models, in which the Shh pathway is constitutively activated, have linked Shh signaling with medulloblastoma 5-9.
A recent report has shown that a subset of medulloblastoma cells derived from Patched1LacZ/+ mice are cancer stem cells, which are capable of initiating and propogating tumors 10. Here we describe an efficient method to isolate, enrich and maintain tumor stem cells derived from several mouse models of medulloblastoma, with constitutively activated Shh pathway due to a mutation in Smoothened (11, hereon referred as SmoM2), a GPCR that is critical for Shh pathway activation. In every isolated medulloblastoma tissue, we were able to establish numerous highly proliferative colonies. These cells robustly expressed several neural stem cell markers such as Nestin and Sox2, can undergo serial passages (greater than 20) and were clonogenic. While these cultured tumor stem cells were relatively small, often bipoar with high nuclear to cytoplasmic ratio when cultured under conditions favoring stem cell growth, they dramatically altered their morphology, extended multiple cellular processes, flattened and withdrew from the cell cycle upon switching to a cell culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum. More importantly, these tumor stem cells differentiated into Tuj1+ or NeuN+ neurons, GFAP+ astrocytes and CNPase+ oligodendrocytes, thus highlighting their multi-potency. Furthermore, these cells were capable of propagating secondary medulloblastomas when orthotopically transplanted into host mice.

This protocol describes the isolation, enrichment, and maintenance of medulloblastoma tumor stem cells derived from mutant mice with ectopic Sonic hedgehog pathway activity.

Enriquecimento de isolamento, e Manutenção de Células-Tronco Meduloblastoma

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been ...

Neurociência

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

Geração de células-tronco neurais de Discarded tecido fetal humano Cortical

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Análise quantitativa de Reposição da vesícula sináptica Piscina em Cultured neurônios granulares do cerebelo usando Dyes FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell lineage development. In vitro expansion of neural progenitors from fetal CNS tissue has been well characterized. Despite the identification and isolation of glial progenitors from adult human sub-cortical white matter and development of various culture conditions to direct differentiation of fetal neural progenitors into myelin producing oligodendrocytes, acquiring sufficient human oligodendrocytes for in vitro experimentation remains difficult. Differentiation of galactocerebroside+ (GalC) and O4+ oligodendrocyte precursor or progenitor cells (OPC) from neural precursor cells has been reported using second trimester fetal brain. However, these cells do not proliferate in the absence of support cells including astrocytes and neurons, and are lost quickly over time in culture. The need remains for a culture system to produce cells of the oligodendrocyte lineage suitable for in vitro experimentation.
Culture of primary human oligodendrocytes could, for example, be a useful model to study the pathogenesis of neurotropic infectious agents like the human polyomavirus, JCV, that in vivo infects those cells. These cultured cells could also provide models of other demyelinating diseases of the central nervous system (CNS). Primary, human fetal brain-derived, multipotential neural progenitor cells proliferate in vitro while maintaining the capacity to differentiate into neurons (progenitor-derived neurons, PDN) and astrocytes (progenitor-derived astrocytes, PDA) This study shows that neural progenitors can be induced to differentiate through many of the stages of oligodendrocytic lineage development (progenitor-derived oligodendrocytes, PDO). We culture neural progenitor cells in DMEM-F12 serum-free media supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF), platelet derived growth factor (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), neurotrophic factor 3 (NT-3), N-2 and triiodothyronine (T3). The cultured cells are passaged at 2.5e6 cells per 75cm flasks approximately every seven days. Using these conditions, the majority of the cells in culture maintain a morphology characterized by few processes and express markers of pre-oligodendrocyte cells, such as A2B5 and O-4. When we remove the four growth factors (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) and add conditioned media from PDN, the cells start to acquire more processes and express markers specific of oligodendrocyte differentiation, such as GalC and myelin basic protein (MBP). We performed phenotypic characterization using multicolor flow cytometry to identify unique markers of oligodendrocyte.

Primary, human fetal brain-derived, multipotential progenitor cells proliferate in vitro while maintaining the capacity to differentiate into neurons and astrocytes. This work shows that neural progenitors can be induced to differentiate through stages of the oligodendrocytic lineage by conditioning with select growth factors.

Progenitor derivado Sistema de Cultura oligodendroglial Cérebro Fetal Humano

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The differentiation process is initiated by breaking the human PSCs into clumps which round up to form aggregates when the cells are placed in a suspension culture. The aggregates are then grown in hESC medium from days 1-4 to allow for spontaneous differentiation. During this time, the cells have the capacity to become any of the three germ layers. From days 5-8, the cells are placed in a neural induction medium to push them into the neural lineage. Around day 8, the cells are allowed to attach onto 6 well plates and differentiate during which time the neuroepithelial cells form. These neuroepithelial cells can be isolated at day 17. The cells can then be kept as neurospheres until they are ready to be plated onto coverslips. Using a basic medium without any caudalizing factors, neuroepithelial cells are specified into telencephalic precursors, which can then be further differentiated into dorsal telencephalic progenitors and glutamatergic neurons efficiently. Overall, our system provides a tool to generate human glutamatergic neurons for researchers to study the development of these neurons and the diseases which affect them.

This procedure yields telencephalic neurons by going through checkpoints which are similar to those observed during human development. The cells are allowed to spontaneously differentiate, are exposed to factors which push them towards the neural lineage, are isolated, and are plated onto coverslips to allow for terminal differentiation and maturation.

A especificação de telencefálicos neurónios glutamatérgicos de células-tronco pluripotentes humanas

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Derivação sem alimentador de células da crista neural progenitoras pluripotentes humanas de células-tronco

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

Dirigido neurônios dopaminérgicos Diferenciação de Células-Tronco pluripotentes humanas

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of Parkinson&#39;s disease is not pathologically confirmed in up to 25% of clinically diagnosed Parkinson&#39;s disease. Therefore, tissue collected from clinically diagnosed patients with idiopathic Parkinson&#39;s disease can have a high rate of misdiagnosis; hence in vitro studies from such tissues to study Parkinson&#39;s disease as a preclinical model can become futile.
By collecting postmortem human leptomeninges with a confirmed neuropathological diagnosis of Parkinson&#39;s disease and characterized by nigrostriatal cell loss and intracellular protein inclusions called Lewy bodies, one can be certain that clinically observed parkinsonism is not caused by another underlying disease process (e.g. tumor, arteriosclerosis).
This protocol presents the dissection and preparation of postmortem human leptomeninges for derivation of a meningeal fibroblast culture. This procedure is robust and has a high success rate. The challenge of the culture is sterility as the brain procurement is generally not performed under sterile conditions. Therefore, it is important to supplement the culture media with a cocktail of penicillin, streptomycin, and amphotericin B.
The derivation of meningeal fibroblasts from autopsy-confirmed cases with Parkinson&#39;s disease provides the foundation for in vitro modeling of Parkinson&#39;s disease. Meningeal fibroblasts appear 3-9 days after sample preparation and about 20-30 million cells can be cryopreserved in 6-8 weeks. The meningeal fibroblast culture is homogenous and the cells express fibronectin, a commonly used marker to identify meninges.

The leptomeninges explant culture protocol from human postmortem brain is a technically robust and simple way to derive fibronectin-positive meningeal fibroblasts within 6-8 weeks and cryopreserve approximately 20-30 million cells.

Derivação de culturas leptomeninges explantes de Postmortem Cérebro humano Doadores

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Desenvolvimento de um protocolo refinado para Trans-escleral apresentam transplante de células epiteliais de pigmento Retinal humano nos olhos de rato

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

Isolamento dos capilares cerebrais do tecido do cérebro humano fresco

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...