I thank Dr Adamantios Mamais for extracting &#945;-synuclein from human tissue and running of blots. This work was supported in part by a MRC Grant (MR/L010933/1) and in part by the Wellcome Trust/MRC Joint Call in Neurodegeneration award (WT089698) to the UK Parkinson's Disease Consortium (UKPDC) whose members are from the UCL Institute of Neurology, the University of Sheffield and the MRC Protein Phosphorylation Unit at the University of Dundee. RB received funding from MJFox foundation for this work and is also funded by the Reta Lila Weston Trust.

Tecido cerebral post-mortem foi doado para Queen Square Cérebro Banco para doenças neurológicas, University College London, Institute of Neurology utilizando protocolos e eticamente aprovados armazenada para a investigação sob uma licença emitida pela autoridade de tecido humano (HTA) Reino Unido (n. 12198). Veja a lista dos casos usados ​​para este protocolo (Tabela 1). 1. Preparação de buffers <ol><li> Prepare 1X TBS (solução salina Tris) buffer: <ol><li> Prepare 10X TBS como solução de reserva com 500 mM Tris-HCl pH 7,4 e 1500 mM de NaCl. <ol><li> Pesar 60,5 g de Tris-Cl pH 7,6 e 87,6 g de NaCl em 800 ml de água de elevada pureza. Ajustar o pH com HCl 1 M e perfazer o volume final para estoque 1 L. </li></ol></li><li> Preparar a concentração final de 1X TBS, diluindo o estoque 10 vezes em água destilada. </li><li> Adicionar inibidores de protease (PI), (1 comprimido por 50 ml de tampão) e Fos-stop comprimidos de inibidor de fosfatase (1 comprimido por 10 ml de tampão) arevogar os efeitos das ações enzimáticas não-específicas de proteases e fosfatases. Nota: Aqui, utilizamos a enzima inibidor comprimidos de Roche, mas igualmente outros inibidores disponíveis comercialmente podem ser utilizados de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol></li><li> Preparar tampão TBS-SDS por adição de 5% w / v de dodecilsulfato de sódio (SDS) a 1X TBS (pH 7,4) tampão. Aquece-se a solução a 60 ° C com agitação constante usando um agitador magnético para solubilizar SDS. </li><li> Preparar tampão TBS-SDS-ureia, adicionando ureia a uma concentração final de 8 M w / v de tampão TBS 1X-SDS (pH 7,4). Aquece-se a solução a 60 ° C com agitação constante num agitador magnético para dissolver a ureia. </li></ol> 2. A homogeneização da amostra e Ultracentrifugação Diferencial Nota: A parte seguinte do trabalho envolve a manipulação de tecido cerebral humano de acordo com as regras da HTA Reino Unido. Procedimentos operacionais padrão locais são seguidos em todos os times. Amostras do cérebro são dissecados a partir de blocos de cérebro congeladas e material de tecido homogeneizado num microcabinet mantido a pressão negativa. Vestidos de luvas descartáveis, máscaras, face-over-sapato protetores e óculos de segurança são usados ​​durante todo o procedimento. Resíduos de tecidos humanos é descartado após a autoclavagem a 121 ° C durante 20 minutos para a eliminação segura. Sharps (lâminas de bisturi) estão dispostos em um recipiente apropriado apropriado para contenção e eliminação segura. <ol><li> Pegue um pedaço de tecido humano congelado (cerca de 0,5 g no peso da região gânglios basais) e mediu-se rapidamente em pequenos fragmentos (aproximadamente 1 mm 2) em gelo usando um pequeno petri-prato e uma lâmina de bisturi estéril. Use uma placa de petri separada e lâmina de bisturi para cada amostra. Recolhe-se o tecido moído num tubo de 15 ml e adicionar 10 volumes de tampão arrefecido com gelo 1XTBS ao tubo. </li><li> Homogeneizar as amostras utilizando um homogeneizador mecânico a 20.000 rpm durante 10 segundos. Arrefecer em gelo durante 2 min. Repita este passo três vezess. Nota: Isso é feito de modo a que as amostras não são aquecidos durante a homogeneização. </li><li> Clarificar por centrifugação a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C. Descartar pelete de material não homogeneizado. </li><li> Tome sobrenadante (homogeneizado bruto), adicione a tubos de centrífuga de policarbonato (tamanho do tubo depende do tamanho do rotor) e equilibrar cuidadosamente. Centrifugar a 100.000 xg durante 1 h a 4 ° C. </li><li> Reter sobrenadante como esta é a fracção solúvel em TBS. </li><li> Lave o peletizado duas vezes em cinco volumes de tampão 1X TBS e centrífuga cada vez a 100.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante. <ol><li> Ressuspender o sedimento final a pelota por sonicação durante 10 segundos a 20 KHz em cerca de 5 volumes de TBS 1X-SDS a RT. Nota: Antes da adição das amostras de tampão contendo SDS deve ser levado a 10 ° C para evitar a precipitação de SDS. </li><li> Ultracentrífuga a 100.000 xg durante 30 min a 25 ° C. </li></ol></li><li> Reter sobrenadante como este é the SDS fracção solúvel. <ol><li> Lave o peletizado duas vezes em 5 volumes de tampão de TBS 1X-SDS a RT. Centrifugar cada vez a 100.000 xg durante 15 min a 25 ° C. </li><li> Solubiliza-se o sedimento final em 50 ul de tampão TBS-1X SDS-ureia usando um sonicador ajustada a 20 KHz durante 10 segundos para atingir a solubilização completa; este é denominado a fracção solúvel em ureia. </li></ol></li><li> Dosear cada fracção para teor de proteína total utilizando um kit de ensaio de proteínas comerciais de acordo com o protocolo do fabricante. Diluir as amostras de TBS-SDS-ureia 1: 1 com tampão 1X TBS para permitir a compatibilidade com os reagentes de ensaio de proteína. Congelar as amostras em pequenas alíquotas (20 ul) a -80 ° C para reduzir os ciclos de congelamento e descongelamento. Nota: A adição de glicerol a 10% para as amostras é recomendado para o armazenamento a longo prazo a -80 ° C. </li></ol> 3. Immunoblotting de amostras e os resultados da análise <ol><li> Executar a partir de amostras de TBS, TBS-SDS e extratos TBS-SDS-uréia em 10 poços 4-12% de gel de poliacrilamida Tris-Biscom MOPS como tampão de corrida usando técnicas padrão. Veja Gallagher e Chakravarti (2008) 29 para um protocolo de western blot detalhado. </li><li> Carga de 10 ug de proteína de cada amostra em cada pista, juntamente com um marcador de peso molecular para TBS e SDS e as fracções de ureia. </li><li> Executar gel a 200 V durante 1 h ou até que o corante azul de tampão de carregamento atingiu o fundo do gel. </li><li> Proteínas a partir de geles de transferir electroforeticamente para membranas de nylon 28, pré-humedecido pela primeira vez em 100% de metanol e em seguida em tampão de transferência contendo 20% de metanol. Proporcionar uma marca de identificação no lado blot para determinar a proteína e a orientação dos marcadores de tamanho de peso molecular. <ol><li> Sandwich o gel com a membrana ao lado de papel de filtro húmido. A colocação correcta da membrana é crucial com a membrana entre o gel e o ânodo. Realize a transferência durante 2 horas a 40 V. </li><li> Make up 1X PBS-tween (1X PBS-T) tampão: dissolver 1 comprimido de PBS em 200 mlágua, para se obter 0,01 M tampão fosfato, 0,0027 M de cloreto de potássio e cloreto de sódio 0,137 M, pH 7,4. </li><li> Bloquear a membrana em solução de BSA a 5% em 1X PBS-T, durante 30 min com agitação a 70 rpm. Isto evita a ligação não específica do anticorpo primário para a membrana. </li></ol></li><li> Sondar a mancha de proteína com 6 ml de-α syn anticorpo primário SIN-1 (BD Biosciences; anticorpo monoclonal de ratinho) a 1: 750 de diluição (O / N a 4 ° C), seguido por uma série de lavagens com 1x PBS-T ( 3 x 5 min de cada vez) 28. </li><li> Incubar a mancha com o conjugado de HRP apropriado anticorpo secundário de 1: 2000 de diluição durante 30 min. Executar uma série de lavagens (3 x 5 min de cada vez) com 1X PBS-T. <ol><li> Imergir blots em solução melhorada quimioluminescência durante 15 segundos num quarto escuro. Borrões Cubra com um filme plástico e coloque filmes autoradiografia contra a mancha com o lado proteína-se em uma fita à prova de luz para capturar os sinais apropriados (bandas de tamanho adequado). </li><li> Desenvolver filmes auto-radiografia em um desenvolvedor automatizado. Nota: As manchas também pode ser desenvolvido manualmente utilizando revelador e do fixador de uma fonte comercial no caso de uma máquina automatizada programador não está disponível. </li></ol></li><li> Incubar a Western blot com 6 ml de tampão de extracção de western blot, durante 10 min com agitação constante para remover a mancha de sinal do anticorpo syn-α. Siga as etapas de 3,43 até 3.6.2 usando beta-actina anticorpo primário (mouse monoclonal) a 1: 8000 diluição. </li><li> Digitalizar e converter a imagem final em uma imagem TIFF e medir as densidades usando NIH ImageJ para fins de quantificação (um software de download gratuito). Nota: O software permite a leitura das densidades de área relativa de interesse (as bandas de tamanho adequado) e os dados podem ser expressos como uma razão de α-syn densidade / β-actina (um gene de manutenção da casa) como unidades arbitrárias ou sobre quando a sua própria casa mantendo um gene não é válido (como no caso de amostras solúveis em ureia). </li&gt; </ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+quantitative+immunoblotting+of+endogenous+&#945;-synuclein.">A new method for quantitative immunoblotting of endogenous &#945;-synuclein.</a> PLoS ONE. 8 (11), e81314 (2013).</li></ol>

O autor não tem nada a divulgar.

Este artigo descreve um protocolo de bioquímica para extração e análise das propriedades de solubilidade diferencial de monoméricos, oligoméricos e agregados α-syn de cérebros doentes usando desnaturação condições gel de funcionamento. Esta é uma técnica bem estabelecida para estudar agregada α syn-17, 18, ​​20, 21, uma proteína que é normalmente solúvel na sua forma nativa, mas obter propriedades de agregação amiloidogénicos ou aumentou com a progressão da doença ou com mutações genéticas. No entanto, alguns grupos usaram pequenas variações nas concentrações de SDS em respectivas memórias intermédias (8% ou 10%, em vez de 5%) 21,22, 30. O SDS é um detergente aniónico e solubiliza α-syn oligómeros que podem incluir formas de membrana ligada α-syn, enquanto a ureia, um reagente caotrópico desnatura as formas agregadas e fibrilares insolúveis ou amiloidogénicos de α-syn 20. A este respeito um estudo sistemático por Paleologou et al 31 examinaram a estabilidadee oligómeros de fibrilas com diferentes concentrações de ureia Syn-a- (6,5 - 8 M) ou SDS (0,25-2%) e relataram que concentrações de oligómeros estáveis ​​em SDS mas não com concentrações elevadas de ureia. A sua Fila-1 anticorpo, específico para oligómeros e fibrilas de Syn-ct detectadas concentrações mais elevadas de fibrilas em 6.5 M concentrações de ureia em condições não desnaturantes. As concentrações de tampão utilizado no presente protocolo espelha o que tem sido descrito em Culvenor et ai. (1999) 32. As regiões cerebrais anatômicas para a extração de bioquímica da insolúvel α-syn deve ser cuidadosamente selecionado e isso deve refletir carga LB e LN syn-α dependendo a progressão da doença 33,34. Os casos usados ​​aqui são amostras dos gânglios da base dos subtipos neocortical e límbicas do PD refletem estágios finais e intermediários de progressão PD de acordo com McKeith ctriteria 34. No cérebro Banco Queen Square, uma metade do cérebro érotineiramente fixados em formol para análise histoquímica e a outra metade é cuidadosamente dissecado em diferentes regiões anatômicas e flash congelados e armazenados em freezers -80 ° C durante mais bioquímica e estudos de análise de DNA / RNA. Após a fixação de formalina dos cérebros e dissecção por neuropathologists, imuno-histoquímica é realizada utilizando anticorpo α-syn e resultados arquivados. Além disso, como um procedimento de rotina, o pH do tecido do cérebro é medida na chegada como uma medida do estado agonal do tecido cerebral. Esta constitui uma base sólida para a qualidade da preservação de tecido para análise bioquímica. Os nossos dados apresentados mostram que há mais de SDS monómero solúvel α-syn em casos de DP comparação com os controlos; em particular os casos de PD neocortical tem maior carga α-syn comparados com a variedade PD límbico. Os casos neocorticais representar uma maior progressão da DP α-syn patologia nas regiões neocorticais tais como frontal e parietal CRcas 33,34. Os casos de DP límbicas têm maiores escores LB nas áreas frontais do cérebro basal / regiões límbicas tais como a amígdala, transentorrinal e as regiões do cíngulo. Para dados e análise estatística significativa, deve-se executar, pelo menos, 4 casos de cada coorte. Da mesma forma que não se tentou a análise estatística dos dados aqui apresentados blot. Deve também notar-se que os anticorpos podem reconhecer diferentes formas diferentes / composição de ordem superior ct-syn oligómeros e cada um pode ter a sua própria sensibilidade relativa e preferências. Isto é evidente a partir dos resultados de Tong et al. 29, onde eles mostram que 4 anticorpos syn-alfa diferentes (SIN-1, SS, Onco e LB509) dão resultados mutáveis, pelo menos, para sin-alfa oligômeros / agregados. Os monómeros α-SYN foram reconhecidos em graus semelhantes por todos os 4 anticorpos embora estes podem ter variações dependendo de se o epitopo do anticorpo syn-α está localizado quer na extremidade N-terminal ou C-terminal 29. Do mesmo modo, anticorpos específicos para fosfo-alfa sinucleína determinar o peso molecular elevado distinta α-sinucleína espécies 20,21. No protocolo aqui descrito, o anticorpo altamente caracterizado SIN-1 tem sido usada 19-21. No entanto, é importante considerar a validar qualquer novo anticorpo em transferências de Western com as experiências pré-absorção de anticorpos e também sobre-expressão e knockdown da proteína nas células. É importante considerar outras variações que foram aplicados pelos pesquisadores para determinar fragmentos menores de formas alfa-syn e instáveis ​​ou tetraméricas alfa-syn. Isto pode incluir fixação leve de membranas com 0,4% de PFA em PBS para manter as formas truncadas de α-syn 35 ou tratamento de homogenatos de exemplo com agentes de reticulação para estabilizar tetrâmeros 36. Avaliação bioquímica de proteínas precisas usando post-mortem tissue requer a minimização da degradação enzimática e modificação de proteínas. Por isso, é aconselhável a utilização de tecido com os menores atrasos post mortem e / ou selecionar amostras pareadas dentro das coortes de casos. A imuno-histoquímica utilizando anticorpos para o padrão α-syn imunohistoquímica deve ser realizado antes de se iniciar o protocolo de isolamento. A extensão da patologia α-syn é altamente variável e pode variar de acordo com regiões seleccionadas. É aconselhável para selecionar regiões com patologia abundante como um controlo positivo para o rendimento ideal com cada corrida. O uso de inibidores de protease e inibidores de fosfatase, se necessário para prevenir a degradação enzimática indesejada após a libertação de proteases intracelulares ou fosfatases que ocorrem durante a lise celular e mantendo as amostras a 4 ° C é crucial. É importante que todas as amostras dentro do lote de experiências são tratadas de maneira uniforme e consistente para evitar as variações intra-utilizador; fre múltiplaciclos eze-descongelação deve ser evitada, pois esta pode retrair potencialmente modificações pós-translacionais, tais como a fosforilação. Um ponto crítico para ter em conta quando se analisa um grande número de amostras é que os dados de imunomanchas deve ser normalizada para uma amostra, o qual deve ser executado em paralelo com todas as outras amostras sobre os géis, e todos os dados de referência para aquela amostra. Isto é feito para assegurar a normalização dos dados entre várias manchas de imunotransferência. Este é o método adotado em nosso estudo recente 22. Deve notar-se que, a fim de manter o ECL de fundo baixo, as manchas não devem ser deixadas a secar fora em qualquer momento durante o protocolo de transferência de Western. Além disso, a exposição muito longas (&gt; 10 min) em filmes auto-radiografia deve ser evitado pois isso irá conduzir à saturação do sinal de ECL e conduzirá a quantificação imprecisa. Este protocolo acima é uma técnica relativamente simples, utilizando reagentes de laboratório comuns e emtrumentos e pode ser uma ferramenta valiosa para estudar a patofisiologia da proteína α-syn em investigação PD. Esta metodologia não só pode ser prorrogado com as modificações apropriadas para o estudo da biologia α-syn em animais transgênicos syn-alfa, mas também para outras doenças neurodegenerativas que caracterizam depósitos anormais de proteínas agregadas, como AD, MSA, DLB, HD e frontotemporaldementias. No entanto, os dados de transferência de Western aqui descrita poderia também ser validada utilizando ensaios de imunoabsorção enzimática, utilizando anticorpos específicos para as formas de α-syn 31.

Uma das características patológicas comuns fundamentais entre várias doenças neurodegenerativas é a formação de agregados de proteínas anormais que ocorre numa proteína / doença modo específico 1. Assim, existem as características de placas de amilóide-beta e extraneuronais depósitos agregados tau hiperfosforiladas dentro de neurónios na doença de Alzheimer (AD); os depósitos syn-alfa agregados em Lewy Corpos (LBS), que são inclusões intraneuronais, e também no âmbito de processos distróficos neuronal chamado Lewy neurites (LNs) em PD, PD demência e demência com corpos de Lewy (DLBs) 2-4. Depósitos syn-alfa anormais também são vistas nas lesões da indicação de inclusões citoplasmáticas gliais em MSA 5. Na doença de Huntington, existem os depósitos de poli-Q característicos, e de ligação de ADN anormal Tar-43 e proteína fundidas em proteínas de sarcoma (FUS) são depositados na demência fronto-temporal. Importante para a DP, mutações no gene α-syn foram encontrados para cause autossômica dominante PD 11/06. Além disso, o gene triplicação α-syn 12 e 13 também causa a duplicação PD familiar ligando deste modo o aumento da expressão α-syn para os patomecanismos de PD. Notavelmente, casos de DP tanto esporádica e familiar abrigar depósitos anormais de α-syn patologia 14. Atuais tratamentos disponíveis para PD são apenas paliativos e não têm nenhum efeito sobre como travar ou atrasar a progressão da doença inexorável. α-syn é expressa abundantemente no cérebro humano e torna-se cerca de 1% da proteína total do cérebro. Ela está presente, mais especificamente, dentro dos neurônios, mas pode existir embora em quantidades menores dentro das células gliais. Um ponto controverso é a estrutura nativa de α-syn que pode existir como um monómero ou aleatória 15 como um tetrâmero dobrado 16. Durante a doença, α-syn muda a sua conformação que lhe permite obter misfolded e este processo é pensado para ser a causa da doença pathogenesis. Apesar de vários anos de investigações sobre os aspectos fisiopatológicos da α-syn e da doença, as causas exatas da doença mecanismos permaneceram indescritíveis 14. Estudos utilizando análise post-mortem dos cérebros de Parkinson têm até agora forneceu pistas importantes sobre a biologia normal e anormal de ambos em PD esporádica e também syn-α PD associado com mutações no gene LRRK2 17-22. Aqui, um protocolo de extracção bioquímica (ver esquema apresentado na Figura 1) para depósitos de syn-ct cada vez mais insolúveis no período de pós-mortem de tecido PD cérebro humano que abrigam agregados α-syn em diferentes graus tem sido descrita. Esta técnica também pode ser adaptada, com modificações em composições de tampão para estudar proteínas agregadas a partir de outras doenças neurodegenerativas 23,24 e também a partir de tecido cerebral animal transgénico 25-27. A principal consideração para as adaptações são as diferenças de solubilidade e os montantes totais das respectivas proteínas, algumas das quais são principalmente nuclear e pode precisar de buffers de elevado-sal para a extração ideal como mostrado para FUS 28.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="800">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Tris-HCL</td>
			<td style="width:216px;">Sigma</td>
			<td style="width:145px;">T5912</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27800.291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease inhibitor tablets&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04 693 116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase inhibitor tablets&#160;</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>04 906 837001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline tablets&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE MOPS SDS running buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE transfer buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0006-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hybond-P membrane&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN303F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Whatman 3MM filter paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA30306185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bis-tris gels 4-12%&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Supersignal West Pico Chemiluminescent substrate</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>34080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bio-RAD DC protein assay kit&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thickwall Beckman Polycarbonate tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Western blot stripping buffer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>46430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syn-1 primary antibody (mouse monoclonal)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">beta-actin primary antibody (mouse monoclonal&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HRP cojugated goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Instrument</td>
			<td>Company</td>
			<td>Rotor/ model no&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benchtop Ultracentrifuge Optima Max</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>MLA-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sonicator</td>
			<td>Heat Systems</td>
			<td>XL20-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Homogeniser</td>
			<td>Jenke and Kunkel</td>
			<td>TP18/10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequential extraction of soluble and insoluble alpha-synuclein from parkinsonian brains

Alfa-sinucleína (α-syn) proteína é abundantemente expresso principalmente nos neurónios, e existe num número de formas diferentes - monómeros, oligómeros, tetrâmeros e fibrilas. Durante a doença, α-syn sofre alterações conf ormacionais para formar oligómeros e agregados de peso molecular elevado que tendem a tornar a proteína mais insolúvel. Anormalmente agregada α-syn é uma característica neuropatológica da doença de Parkinson (DP), demência com corpos de Lewy (DLB) e atrofia de múltiplos sistemas (MSA). Caracterização e análise de buffers usando Syn-ct insolúveis com o aumento da força do detergente e ultracentrifugação alta velocidade Biochemical proporciona uma ferramenta poderosa para determinar o desenvolvimento da patologia α-syn associada com a progressão da doença. Este protocolo descreve o isolamento de cada vez mais insolúveis / agregado α-syn partir de tecido de cérebro humano post-mortem. Esta metodologia pode ser adaptada, com modificações para estudos de α normal e anormalbiologia -syn em modelos animais transgénicos que albergam diferentes mutações Syn-ct, bem como em outras doenças neurodegenerativas que apresentam depósitos de proteínas fibrilares aberrantes relacionadas com as respectivas patologias.

TBS, SDS e as proteínas extraídas a partir de ureia solúvel em gânglios da base, seguindo o protocolo mostrado na Figura 1 foram corridas em géis e imunotransferidas com o SIN-1 monoclonal de murganho α-syn anticorpo primário. As fracções solúveis em TBS apresentada a presença de monomérico α-SYN (~ 14 espécies kDa) nos casos de DP e de controlo examinados (Figura 2A). As fracções solúveis em SDS mostrou também abundante monomérica α-syn em todos os três subtipos de casos estudados como exibido na baixa exposição blot (Figura 2C). Os casos de PD também apresentaram maiores espécies de peso molecular (MW) SYN-alfa como pode ser visto no alto blot exposição, que são susceptíveis de ser oligômeros (Figura 2C). As frações solúveis de uréia a partir de casos PD mostraram valores elevados de monómeros syn-a, oligômeros e espécies agregadas comparadas para controlar casos. Os casos DP idiopática neocortical demonstrar maior quantidade de AGGREG<html> espécies ated α-syn, enquanto os casos límbicas mostrar níveis intermediários de insolúvel α-syn. Ambos os SDS e uréia frações de casos DP idiopática demonstram níveis variáveis ​​de produtos syn-alfa truncadas em 12 kDa e 6 kDa, conforme descrito 20. Em contraste, os casos de controlo não mostraram qualquer α-syn insolúvel ou agregados (Figura 2E). Medidas semiquantitativos densidade de reflectir a quantidade de carga de LB como categoriesd usando α-syn imunohistoquímica demonstra a natureza do agregado insolúvel α-SYN (Figura 2B, 2D, 2F), em casos de DP neocorticais e límbicas. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53415/53415fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama esquemático do α insolúvel procedimento de extração -syn.rPegue = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53415/53415fig2.jpg" /> Figura 2. immunoblots representativos de níveis -syn alfa de PD e controlar o tecido humano. TBS, SDS e as fracções solúveis de uréia a partir de gânglios basais (uma região que abriga α-syn patologia em casos PD) dos casos DP idiopática e neurologicamente normal (controle) cérebros foram analisados ​​para a presença de α-syn utilizando imunotransferência de Western. 10 ug de proteína foi carregada sobre cada pista. Em TBS fracções (A), monómeros principalmente α-syn estão presentes em todos os casos. Em SDS fracções (C), alguns oligómeros de α-syn são vistos juntamente com monómeros principalmente no tecido PD. Em frações de ureia (C), monômeros, oligômeros e agregados α-syn são variavelmente expressas no casos de DP reflecting respectiva carga LB. As amostras de controlo neurologicamente normais mostram a presença de apenas pequenas quantidades de monomérico α-syn. Por favor note possíveis produtos de degradação de α-syn são vistas em alguns dos casos, com elevada carga de LB. A ponta de seta sólida representa a forma monomérica da α-syn. O *, possivelmente, representa uma forma truncada no terminal C de α-syn como previamente descrito 20,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53415/53415fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Caso </td><td> Sexo </td><td> idade em anos de morte </td><td> atraso post-mortem (hrs) </td><td> pH de tecido </td></tr><tr><td> Neocortical 1 </td><td> M </td><td> 82 </td><td> 40 </td><td> 6.3 </td></tr><tr><td> Neocortical 2 </td><td> F</td><td> 75 </td><td> 35,3 </td><td> 6.4 </td></tr><tr><td> Límbico 1 </td><td> M </td><td> 81 </td><td> 28,5 </td><td> 6.2 </td></tr><tr><td> Límbico 2 </td><td> F </td><td> 79 </td><td> 36,5 </td><td> 6.2 </td></tr><tr><td> Controlo 1 </td><td> M </td><td> 80 </td><td> 38 </td><td> 6.1 </td></tr><tr><td> Control 2 </td><td> F </td><td> 83 </td><td> 32,5 </td><td> 6.3 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. demografia limitada dos casos usados

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Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Here, we present a protocol for the isolation of increasingly insoluble/aggregated alpha-synuclein (&#945;-syn) from post-mortem human brain tissue. Through the utilization of buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation techniques, the variable properties of &#945;-syn aggregation in diseased and non-diseased tissue can be examined.

Extração seqüencial de solúveis e insolúveis alfa-sinucleína de Brains parkinsonianos

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

sequential-extraction-soluble-insoluble-alpha-synuclein-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.1K visualizações.  UCL Institute of Neurology. Here, we present a protocol for the isolation of increasingly insoluble/aggregated alpha-synuclein (α-syn) from post-mortem human brain tissue. Through the utilization of buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation techniques, the variable properties of α-syn aggregation in diseased and non-diseased tissue can be examined.

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Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, the olfactory bulb (OB), the dorsal motor nucleus of the vagus (DMV)3, the intermediolateral nucleus of the spinal cord 4 and the substantia nigra, providing the basis for the neuropathological staging of the disease4,5. The ENS and the OB are the most exposed nervous structures and the first ones to be affected. Interestingly, PD has been related to pesticide exposure6-8. Here we show in detail two methods used in our previous study 9. In order to analyze the effects of rotenone acting locally on the ENS, we administered rotenone using a gavage to one-year old C57/BL6 mice. Rotenone is a widely used pesticide that strongly inhibits mitochondrial Complex I 10. It is highly lipophylic and poorly absorbed in the gastrointestinal tract 11. Our results showed that the administration of 5 mg/kg of rotenone did not inhibit mitochondrial Complex I activity in the muscle or the brain. Thus, suggesting that using our administration method rotenone did not cross the hepatoportal system and was acting solely on the ENS. Here we show a method to administer pesticides using a gavage and the image analysis protocol used to analyze the effects of the pesticide in alpha-synuclein accumulation in the ENS. The first part shows a method that allows intragastric administration of pesticides (rotenone) at a desired precise concentration. The second method shows a semi-automatic image analysis protocol to analyze alpha-synuclein accumulation in the ENS using an image analysis software.

Parkinson's disease has been related to the exposure to pesticides. Here we show a method to deliver pesticides using a gastric tube at the desired concentration and a method to analyze their effect in alpha-synuclein accumulation in the enteric nervous system.

Administração oral de rotenona usando um Gavage e Análise de Imagem de Alpha-sinucleína Inclusões no sistema nervoso entérico

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Neurociência

Targeted Training of Ultrasonic Vocalizations in Aged and Parkinsonian Rats

Voice deficits are a common complication of both Parkinson disease (PD) and aging; they can significantly diminish quality of life by impacting communication abilities. 1, 2 Targeted training (speech/voice therapy) can improve specific voice deficits,3, 4 although the underlying mechanisms of behavioral interventions are not well understood. Systematic investigation of voice deficits and therapy should consider many factors that are difficult to control in humans, such as age, home environment, age post-onset of disease, severity of disease, and medications. The method presented here uses an animal model of vocalization that allows for systematic study of how underlying sensorimotor mechanisms change with targeted voice training. The ultrasonic recording and analysis procedures outlined in this protocol are applicable to any investigation of rodent ultrasonic vocalizations.
The ultrasonic vocalizations of rodents are emerging as a valuable model to investigate the neural substrates of behavior.5-8 Both rodent and human vocalizations carry semiotic value and are produced by modifying an egressive airflow with a laryngeal constriction.9, 10 Thus, rodent vocalizations may be a useful model to study voice deficits in a sensorimotor context. Further, rat models allow us to study the neurobiological underpinnings of recovery from deficits with targeted training.
To model PD we use Long-Evans rats (Charles River Laboratories International, Inc.) and induce parkinsonism by a unilateral infusion of 7 &mu;g of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the medial forebrain bundle which causes moderate to severe degeneration of presynaptic striatal neurons (for details see Ciucci, 2010).11, 12 For our aging model we use the Fischer 344/Brown Norway F1 (National Institute on Aging).
Our primary method for eliciting vocalizations is to expose sexually-experienced male rats to sexually receptive female rats. When the male becomes interested in the female, the female is removed and the male continues to vocalize. By rewarding complex vocalizations with food or water, both the number of complex vocalizations and the rate of vocalizations can be increased (Figure 1).
An ultrasonic microphone mounted above the male's home cage records the vocalizations. Recording begins after the female rat is removed to isolate the male calls. Vocalizations can be viewed in real time for training or recorded and analyzed offline. By recording and acoustically analyzing vocalizations before and after vocal training, the effects of disease and restoration of normal function with training can be assessed. This model also allows us to relate the observed behavioral (vocal) improvements to changes in the brain and neuromuscular system.

Voice disorders are debilitating in aging and Parkinson disease. The ultrasonic vocalizations of rats, also affected by these conditions, can be used to study these voice disorders, their neural substrates, and the nature of functional recovery with behavioral intervention.

Formação específica de vocalizações ultra-som em ratos idosos e Parkinson

Voice deficits are a common complication of both Parkinson disease (PD) and aging; they can significantly diminish quality of life by impacting ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

A cultura Ex vivo de todo, o desenvolvimento cerebral de Drosophila

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolamento, cultura e Long-Term Manutenção da Primária mesencefálico Dopaminergic neurônios dos cérebros de roedores Embryonic

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein prionoids, which cause neuropathology within the central nervous system (CNS). Here we describe that intraglossal or intraperitoneal injection of alpha-synuclein fibrils into bigenic Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which overexpress human alpha-synuclein with the A53T mutation from the prion protein promoter and firefly luciferase from the promoter for glial fibrillary acidic protein (Gfap), is sufficient to induce neuropathologic disease. In comparison to homozygous Tg(M83+/+) mice that develop severe neurologic symptoms beginning at an age of 8 months, heterozygous Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) animals remain free of spontaneous disease until they reach an age of 22 months. Interestingly, injection of alpha-synuclein fibrils via the intraperitoneal route induced neurologic disease with paralysis in four of five Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice with a median incubation time of 229 &#177;17 days. Diseased animals showed severe deposits of phosphorylated alpha-synuclein in their brains and spinal cords. Accumulations of alpha-synuclein were sarkosyl-insoluble and colocalized with ubiquitin and p62, and were accompanied by an inflammatory response resulting in astrocytic gliosis and microgliosis. Surprisingly, inoculation of alpha-synuclein fibrils into the tongue was less effective in causing disease with only one of five injected animals showing alpha-synuclein pathology after 285 days. Our findings show that inoculation via the intraglossal route and more so via the intraperitoneal route is suitable to induce neurologic illness with relevant hallmarks of synucleinopathies in Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice. This provides a new model for studying prion-like pathogenesis induced by alpha-synuclein prionoids in greater detail.

Peripheral injection of alpha-synuclein fibrils into the peritoneum or tongue of Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which express human alpha-synuclein with the familial A53T mutation and firefly luciferase, can induce neuropathology, including neuroinflammation, in their central nervous system.

Imagem de bioluminescência de Neuroinflammation em Ratinhos Transgénicos Após inoculação periférica de alfa-sinucleína fibrilas

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Isolamento e extração de RNA de neurônios, macrófagos e Microglia de Zebrafish Larval cérebros

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the study of &#945;S aggregation in Parkinson&#39;s Disease (PD). Recently, the development of new animal models through the exogenous inoculation of brain extracts from diseased &#945;S transgenic mice or PD patients has given new hopes to the possibility of creating more adequate cell models of &#945;S aggregation. Unfortunately, when it comes to cells in cultures, administration of raw brain extracts has not proven as successful as in mice and the source of choice of exogenous aggregates is still in vitro preformed &#945;S fibrils.
We have developed a method to induce the formation of intracellular &#945;S inclusions in primary neurons through the exogenous administration of native microsomes-associated &#945;S aggregates, a highly toxic &#945;S species isolated from diseased areas of transgenic mice. This fraction of &#945;S aggregates that is associated with the microsomes vesicles, is efficiently internalized and induces the formation of intracellular inclusions positive for aggregated and phosphorylated &#945;S. Compared to in vitro-preformed fibrils which are made from recombinant &#945;S, our method is faster and guarantees that the pathogenic seeding is made with authentic &#945;S aggregates extracted from diseased animal models of PD, mimicking more closely the type of inclusions obtained in vivo. As a result, availability of tissues rich in &#945;S inclusions is mandatory.
We believe that this method will provide a versatile cell-based model to study the microscopic aspects of &#945;S aggregation and the related cellular pathophysiology in vivo and will be a starting point for the creation of more accurate and sophisticated cell paradigm of PD.

The goal of this protocol is to provide a cell-based system that replicates the formation of alpha-synuclein aggregates in vivo. Intracellular alpha-synuclein inclusions are seeded in primary neurons by the internalization and propagation of exogenous administered native microsomes-associated alpha-synuclein aggregates isolated from diseased alpha-synuclein transgenic mice.

Administração exógena de agregados de microssomas associados alfa-synuclein para os neurônios primários como um modelo de célula poderosos de formação de fibrilas

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Análise metabólica do melanogaster da drosófila Larval e adulto cérebros

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In neuroscience, as well as a plethora of other scientific fields, these techniques are used. Immunohistochemistry can be done on slide mounted tissue or free-floating sections. Preparing slide-mounted samples is a time intensive process. The following protocol for a technique, called the Megabrain, reduced the time taken to cryosection and mount brain tissue by up to 90% by combining multiple brains into a single frozen block. Furthermore, this technique reduced variability seen between staining rounds, in a large histochemical study. The current technique has been optimized for using rodent brain tissue in downstream immunohistochemical analyses; however, it can be applied to different scientific fields that use cryosectioning.

Here, we present a protocol to freeze and section brain tissue from multiple animals as a timesaving alternative to processing single brains. This reduces staining variability during immunohistochemistry and reduces time cryosectioning and imaging.

Cryosectioning simultânea de vários cérebros de roedores

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the diagnosis still relies only on clinical signs of motor involvement that appear later on in the disease course, when most of the dopaminergic neurons are already lost. Hence, there is a strong need for a biomarker that can identify patients at the beginning of disease or at the risk of developing it. Over the last few years, skin biopsy has proved to be an excellent research and diagnostic tool for peripheral nerve diseases such as small fiber neuropathy. Interestingly, a small fiber neuropathy and alpha synuclein (&#945;Syn) neural deposits have been shown by skin biopsy in PD patients. Indeed, skin biopsy has the great advantage of being an easily accessible, minimally invasive and painless procedure that allows the analysis of peripheral nervous tissue prone to the pathology. Moreover, the possibility of repeating the skin biopsy in the course of the follow-up of the same patient allows studying the longitudinal correlation with the disease progression. We set up a standardized reliable protocol to investigate the presence of &#945;Syn aggregates in skin nerve fibers of the PD patient. This protocol involves few short fixation steps, a cryotome sectioning and then a free-floating immunofluorescence double-staining with two specific antibodies: anti Protein Gene Product 9.5 (PGP9.5) to mark the cutaneous nerve fibers and anti 5G4 for detecting &#945;Syn aggregates. It is a versatile, sensitive and easy to perform protocol that can also be applied for targeting other proteins of interest in skin nerves. The ability to mark &#945;Syn aggregates is another step forward to the use of skin biopsy as a tool for establishing a pre-mortem histopathological diagnosis of PD.

Here, we present a protocol for a free-floating indirect immunofluorescence assay on skin biopsy sections that allows for the identification of disease specific conformation variants of alpha synuclein involved in Parkinson disease and multiple proteins of the peripheral nervous system.

Segmentação de agregados Alpha synuclein em fibras nervosas periféricas cutâneas por ensaio de imunofluorescência livre-flutuante

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...