Este protocolo fornece um modelo robusto e reprodutível de acúmulo de sinucleína alfa em neurônios de dopamina primária para estudar os mecanismos e tratamentos que podem regular esse acúmulo. Fibrilas de alfa-sinucleína pré-formadas induzem o acúmulo progressivo e altamente reprodutível de proteínas combinados com imagens automatizadas e análise de imagem imparcial, este protocolo facilita uma triagem relativamente rápida, média a alta de rendimento de caminhões inibidores de acúmulo de alfa-sinucleína. O acúmulo progressivo de alfa-sinucleína pode ser um dos fatores que comprometem a função neuronal na doença de Parkinson e em certos corpos nucleares.
Novas moléculas que bloqueiam esse acúmulo podem se tornar novas terapias para a neuro degeneração. Acreditamos que este protocolo é um passo importante para estabelecer uma ferramenta padrão e confiável para estudar mecanismos moleculares que regulam o acúmulo de alfa-sinucleína em neurônios dopamina. Demonstrando o procedimento será Julia Konovalova, uma estudante de doutorado do meu laboratório.
Antes de configurar a cultura celular midbrain embrionária primária, adicione 50 microliters de dopamina, o meio neurônio, a cada poço da placa de 96 poços revestida de Poly-L-Ornithine e use uma ponta de pipeta de 100 microliteres para aspirar o meio enquanto simultaneamente arranha o fundo de cada poço em uma direção circular para remover o revestimento no perímetro de cada poço. Uma ilha revestida de Poly-L-Ornithine permanecerá no meio de cada poço. Adicione 10 microliters de médio ao meio de cada ilha revestida para criar micro ilhas.
Para configurar culturas primárias embrionárias do cérebro médio a partir de embriões embrionários de camundongos 13,5. Acumule todos os pisos de cérebro médio colhidos no mesmo tubo de 1,5 mililitro e lave as amostras três vezes com 500 microliters de cálcio e hbss livres de magnésio por lavagem. Após a última lavagem substitua o HBSS por 0,5% de trippsina para uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius.
No final da incubação adicione 500 microliters de um DNase I recém-preparado na solução FBS para o tecido parcialmente digerido e use uma pipeta de vidro siliconada com uma ponta polida de fogo para triturar o tecido. Quando apenas partículas minúsculas e pouco visíveis podem ser observadas permitem que esses fragmentos de tecido se acomodem na parte inferior do tubo de micro centrífuga e transfiram este supernatante para um tubo de polipropileno cônico vazio de 15 mililitros. Adicione um mililitro de HBSS ao tubo contendo DNase I em FBS e misture várias vezes por pipetação.
Transfira um mililitro desta solução para as partículas de tecido restantes e triturar as amostras novamente. Em seguida, puxe a suspensão celular digerida com o tubo de supernadante sem transferir quaisquer fragmentos de tecido restantes depois de triturar a amostra de tecido mais uma vez com o restante DNase I e FBS em HBSS sedimentar as células coletadas por centrifugação e aspirar o supernante sem perturbar a pelota. Lave as células duas vezes em dois mililitros de neurônio de dopamina aquecida por lavagem.
E resuspenque as células em um três vezes 10 para as células de força por seis microliters de fresco quente, concentração média em um tubo de micro centrífugas. Em seguida, remova o meio de cada micro-ilha previamente preparada e misture as células com tubos suaves antes de usar uma pipeta de 10 microliteres para adicionar seis microliters de células a cada micro-ilha. Quando todas as células tiverem sido adicionadas, encha os poços vazios nas bordas da placa com 150 microliters de água ou PBS e coloque a placa na incubadora de cultura celular por uma hora.
No final da incubação adicione 100 microliters de médio neurônio de dopamina fresco para cada poço e devolva a placa à incubadora. No oitavo dia de cultura celular em uma capa de fluxo laminar adicionar 3,75 microliters de 100 microgramas por mililitro de fibrilas pré-formadas a cada poço experimental, e 3,75 microliters de PBS para cada bem controle. Ao trabalhar com PFS seja cauteloso quanto à contaminação por proteínas indesejadas e depois limpe o capô e todos os instrumentos associados à PF com 1%SDS e 70% de etanol.
No ponto final experimental apropriado após a coloração para os marcadores de interesse, carregue a placa de cultura do poço 96 em um scanner de placa de alto conteúdo equipado com um objetivo de 10 X. Ajuste as configurações de acordo com as especificações da placa 96, como o tipo de jogo, fabricante, tamanho, distância entre os poços e o tipo e volume de meio. Selecione a área de imagem dos poços para cobrir todas as células de cada micro-ilha e use um poço para ajustar o foco automático na expressão DAPI.
Calibrar o tempo de aquisição de cada canal fluorescente com base na intensidade da coloração nos poços de controle e ajustar os parâmetros para que as células de dopamina nos poços de controle tratados com fibril pré-formados abrigando fosfoserina 129 agregados de sinucleína alfa dentro da célula soma claramente sejam distinguidos permitindo uma quantificação inequívoca da fosfoserina 129 alfa synuclein agregados positivos e negativos. Em seguida, imagem todos os poços selecionados simultaneamente em todos os canais usando exatamente os mesmos parâmetros para cada poço. Para a análise das imagens, abra o analista CellProfiler e selecione o V2_THpos.
arquivo propriedades. Para classificar células segmentadas em fosfoserina 129 células alfa sinucleína positivas e negativas primeiro definir o número de células de busca para 50 células aleatórias e clicar em buscar para carregar imagens das células segmentadas. Arraste pelo menos 30 células para dentro da caixa correspondente na parte inferior da janela.
selecione usar um rápido e suave reforço com 50 regras máximas ou classificadores de floresta aleatórios e clique em trem. Defina buscar 50 células positivas e clique buscar para adquirir exemplo células de fosfoserina 129 alfa sinucleína pontuadas de acordo com o classificador de trem ou definir buscar para 50 células negativas e clicar buscar para adquirir exemplo células de fosfoserina 129 alfa sinucleína de acordo com o classificador do trem. Quando os resultados forem satisfatórios, clique em pontuação para gerar uma tabela de resultados resumindo o número de neurônios de doínucleína alfa 129 alfa positivos e negativos em cada poço.
Poucos dias depois de emplaar uma cultura de propagação homogênea pode ser observada por microscopia leve dentro da micro-ilha criada antes do revestimento. Os neurônios primários se acomodam no fundo da placa revestida de forma homogênea e estabelecem projeções neuronais. Nesta imagem, pode-se observar uma pequena aglomeração de células com menos de 150 mímetros de diâmetro.
A coloração imuno-tratada do controle de culturas primárias do camundongo com marcadores de células neuronais 15 dias após o revestimento revela um apego restrito das células dentro das micro ilhas no meio dos poços de placa. Neurônios de dopamina imuno rotulados com marcador de hidroxilase de tyrosina espalhados pela micro ilha em uma monocamada separada uma da outra sem qualquer clumping. Nas culturas tratadas com fibrila pré-formadas por alfa-sinucleína, também podem ser observadas inclusões positivas de sinucleína alfa-sinucleína.
O tratamento com fibrilas pré-formadas in vitro por sete dias não causa uma diminuição significativa no número de neurônios positivos de hidroxilase de tyrosina em comparação com outros grupos experimentais. O tratamento com linha celular gliana derivada do fator neurotrófico, no entanto, reduz a porcentagem de inclusão positiva pS129 alfa-sinucleína, abrigando neurônios de dopamina positiva da tyrosina hidroxilase. Antes de criar micro ilhas, certifique-se de que os poços revestidos de ornitina Poly-L sejam lavados solidamente.
Também certifique-se de usar mídia fresca ao emplacar novas culturas cerebrais. O método pode ser combinado com edição de genes e inibidores farmacológicos para estudar os efeitos de genes específicos e ondas de pensamento na agregação de núcleos. Nós rotineiramente usamos este método para rastrear novas moléculas que inibem o acúmulo de sinucleína alfa.
Demonstraram os efeitos protegidos de acumulação da TDN e atualmente analisando várias pequenas moléculas candidatas.
