Name: assessment of maternal vascular remodeling during pregnancy in the mouse uterus
Uploaded: 2015-12-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
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The authors would like to thank all members of the Colucci lab for helpful discussions. This work was funded by The Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], The Centre for Trophoblast Research and The British Heart Foundation.

Todos os procedimentos descritos neste manuscrito estão em conformidade com os regulamentos UK Home Office e são aprovados pelo Painel de Revisão Ética Cambridge. 1. Coleta de Amostras <ol><li> Configure acasalamentos programados usando 8-12 semanas de idade do sexo feminino camundongos C57BL / 6 com homens adultos (até 2 fêmeas para cada macho) à tarde. Verificar a presença de tampões vaginais como um sinal de cópula no início da manhã, nos seguintes dias. A presença de um plug no gd0.5 marcas manhã. </li><li> Em gd9.5, sacrificar o animal por deslocamento cervical e a cavidade abdominal aberta. Note-se que a eutanásia por CO 2 pode causar vasodilatação. </li><li> Use fio dental para ligar suavemente as artérias uterinas (figura 1, setas tracejadas). Amarrar o fio em volta das artérias na ponta de cada trompa uterina, proximal para os ovários, bem como em torno do colo do útero. Nota: Não ruptura dos vasos, pois isso pode resultar em artérias desabaram. </li> &lt;li&gt; Dissecar o útero rapidamente usando tesouras de dissecação, extraindo todo o útero distalmente para os três pontos de ligação na ponta dos cornos uterinos e do colo do útero. </li><li> Colocar o útero em um pedaço de poliestireno preparadas de tal modo que ambos os cornos estão alinhadas ao longo do mesmo eixo longo em direcções opostas a partir do colo do útero. Gentilmente esticá-lo e fixá no lugar usando 2-3 25 agulhas G. </li><li> Mergulha-se o poliestireno em um tubo de 50 ml preparadas cónica. Encher a 50 ml com formalina a 10%. Fix para 5-6 horas à temperatura ambiente. </li><li> Descartar a solução de formalina e substituir com 50 ml de solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS) durante 5 min. </li><li> Extirpar os dois cornos uterinos proximal ao ponto de ligação em cada extremidade e proximal do colo do útero no centro, aparar qualquer excesso de gordura ao redor dos locais de implantação e lavar duas vezes em PBS durante 5 minutos para remover traços de formol. </li><li> Armazenar as amostras em etanol a 70% a 4 ° C (até duas semanas) até ao processamento. CUIDADO: Ethanol é altamente inflamável. </li><li> Usar um sistema de processamento automatizado utilizando os parâmetros indicados no Quadro 1. Incorporar os chifres individualmente em parafina, de modo que eles podem ser cortados ao longo do plano perpendicular ao longo eixo do útero. Isto garante que a área máxima de cada local de implantação será exposto para análise no meio do bloco (Figura 2A). OPCIONAL: Este é um ponto de tempo conveniente para a randomização dos blocos se se desejar. </li><li> Usando um micrótomo, corte cortes seriados de 7 de espessura mm a partir dos blocos. Manchar uma seção a cada intervalo de 49 mm com hematoxilina e eosina (H &amp; E, ver secção 2.1). Armazenar os restantes secções à temperatura ambiente para a coloração SMA e outras aplicações a jusante. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:99px;"> Solução </td><td style="width:43px;"> Tempo<html></td><td style="width:97px;"> Temperatura </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 70% Etanol </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Etanol </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Etanol </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Etanol </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Etanol </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Etanol </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Etanol </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21">: 21px; &quot;&gt; O xileno </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Xileno </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Xileno </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Parafina </td><td> 1 hr </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Parafina </td><td> 1 hr </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Parafina </td><td> 1 hr </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> Parafina </td><td> 1 hr </td><td> 63 ° C </td></tr></tbody></table> Tabela 1:. Definições para processamento de tecidos automatizado Visão geral da configuração usada para o processamento de tecido uterino 2. SterAvaliação eological <ol><li> H &amp; E Coloração <ol><li> Desparafinar secções imergindo as lâminas montadas num suporte de lâminas em um banho de xileno a 100% durante 10 min à temperatura ambiente. CUIDADO: O xileno é inflamável e um cancerígeno que é tóxico através do contato e inalação. Este trabalho deve ser realizado em um exaustor, utilizando equipamento de protecção individual (EPI). </li><li> Imergir as lâminas em banho contendo xileno limpo por mais 10 min. </li><li> Sequencialmente mergulhe as lâminas em banhos contendo etanol a 100%, etanol a 95%, etanol a 70% e água purificada durante 5 minutos cada. </li><li> Imergir as lâminas em 50% Gill n 3 hematoxilina solução, diluiu-se com água purificada, durante 5 min. CUIDADO: Hematoxilina é nocivo por ingestão e contato com os olhos. Utilizar EPI adequado ao manusear. </li><li> Lavar as lâminas em uma calha de coloração em água corrente por 10 min. </li><li> Imergir as lâminas em 1% de solução de ácido / álcool (1% de ácido clorídrico a 10 M em etanol a 70%) durante 10 sege lavar em uma calha de coloração em água corrente. </li><li> Imergir as lâminas em solução de eosina para 30 seg e lavar em uma calha de coloração em água corrente por 10 min. </li><li> Dentro de um exaustor de fumos, sequencialmente mergulhe as lâminas em banhos contendo etanol a 70%, etanol a 95% e etanol a 100% durante 5 min cada. </li><li> Imergir as lâminas em banho contendo xileno durante 10 min. </li><li> Mount lamelas usando um meio de montagem à base de xileno. Seca-se horizontalmente e completamente em um exaustor antes de visualizar as lâminas com um microscópio. </li></ol></li><li> Avaliação estereológica de tamanho do vaso e remodelamento Estado <ol><li> Para cada local de implantação, determinar quais seções estão perto do ponto midsagittal. O anexo corioalantï¿½ca entre o feto ea placenta em desenvolvimento serve como um bom indicador do ponto midsagittal. </li><li> Selecione 3 seções em 49 mm intervalos próximos ao ponto midsagittal para a análise. Digitalizar slides selecionados. A fim de evitar Including veias, que foram mostrados para ser mais perifericamente localizados nos locais de implantação 16, restringir a análise no centro de 2/4 de cada local de implante (Figura 2A). </li><li> Para avaliar o tamanho do lúmen, desenhar em torno do interior dos vasos e gravar a área desta forma. Para o tamanho total do vaso, desenhar em torno da parede exterior do recipiente, incluindo as células endoteliais, pericitos e leucócitos intramurais. Nota: A relação entre o tamanho total do vaso de lúmen é um proxy para o status de remodelação de uma embarcação. Como os navios de bobina através do plano da secção que foi cortado ao longo, pode haver várias secções transversais da mesma artéria numa única lâmina. Evitar a medição da mesma artéria várias vezes. </li><li> Grave as medições dos 5 navios em cada local de implantação com as maiores e mais redondos lumens. Meça cada local de implantação em triplicata (três seções espaçadas 49 mm afastados uns dos outros). A média destes 15 medições represeNTS o diâmetro médio dos vasos maiores. </li><li> Para evitar sobre-representação de navios maiores em algumas amostras, meça o mesmo número de embarcações em cada local de implantação. </li></ol></li></ol> 3. Avaliação Qualitativa Usando imunohistoquímica <ol><li> Desparafinização e reidratação <ol><li> Desparafinar secções imergindo as lâminas montadas num suporte de corrediça resistente ao calor num banho de xileno a 100% durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Imergir as lâminas em banho contendo xileno limpo por mais 10 min. </li><li> Sequencialmente mergulhe as lâminas em banhos contendo etanol a 100%, etanol a 95% e 70% e com água purificada durante 5 minutos cada. </li></ol></li><li> Antigen Recuperação <ol><li> Preparar um tampão de citrato de sódio 10 mM em água purificada e ajustar até pH 6 utilizando ácido clorídrico a 10 M. </li><li> Encha um recipiente resistente ao calor que pode conter 600 ml com 400 ml de tampão citrato de sódio e coloque em uma panela de pressão doméstica contendo wat suficienteer para submergir metade do recipiente. Genericamente anexar a tampa da panela de pressão e de calor até à ebulição. </li><li> Colocar a lâmina cremalheira no tampão de citrato de sódio e fixar firmemente a tampa da panela de pressão. Uma vez pressurizada, deixar ferver durante 3 min. </li><li> Retire a pressão da panela de pressão e retire o recipiente interior. Permitir lâminas arrefecer no tampão de citrato de sódio durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavagem das lâminas num banho contendo água purificada durante 5 min. </li><li> Cercar as seções usando uma caneta barreira hidrofóbica. </li><li> Lavagem das lâminas por imersão em PBS durante 5 min. </li></ol></li><li> O bloqueio da peroxidase endógena e a ligação não específica <ol><li> Incubar secções com 3% de peróxido de hidrogénio diluído em água purificada numa câmara humidificada, durante 30 min à temperatura ambiente. CUIDADO: O peróxido de hidrogênio é altamente irritante para os olhos, a pele e por ingestão. Utilizar EPI adequado. </li><li> Toque o excesso de solução de peróxido de hidrogênio e lave SLIdes duas vezes por imersão em solução salina tamponada com Tris (TBS) durante 2 minutos cada. </li><li> Incubar secções com imunoglobulina de ratinho a partir do reagente de bloqueio do rato no kit de rato preparadas de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Lavagem das lâminas em TBS duas vezes durante 2 minutos cada. </li></ol></li><li> A imunodetecção de actina de músculo liso <ol><li> Preparar a solução diluente de anticorpo (fornecido no kit) e incubar com as secções durante 5 min à temperatura ambiente, ou de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Dilui-se 1: 100 actina de músculo liso de ratinho anti-humano (Dako M0851) em solução diluente de anticorpo. Diluir controlo de isotipo de IgG2a de ratinho em solução diluente de anticorpo, assegurando que a concentração de imunoglobulina final é equivalente em ambas as soluções. </li><li> Toque o excesso de seções de solução diluente de anticorpo e cobrir com tanto soluções de controle de anticorpos isotípicos ou diluído. Incubar numa câmara húmida durante 30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Lave as lâminas duas vezes em TBS para2 min cada. </li><li> Diluir anticorpo anti-ratinho biotinilado secundário e secções incubar durante 10 min à temperatura ambiente, ou de acordo com as instruções dos fabricantes. </li><li> Lavagem das lâminas uma vez cada com TBS e PBS durante 2 min, respectivamente. </li><li> Preparar a solução de 3,3&#39;-diaminobenzidina (DAB) de acordo com as instruções do fabricante. Cubra seções com solução DAB e incubar por até 4 min, garantindo para monitorar seções para evitar o excesso de desenvolvimento da cor. CUIDADO: DAB é inflamável e um cancerígeno que é tóxico através do contato e inalação. Utilizar EPI adequado ao manusear. </li><li> Imergir as lâminas em água purificada uma vez intensidade da coloração desejada seja atingida. </li><li> Contracoloração com 50% Gill No. 3 hematoxilina durante 20 segundos e lavar em uma calha de coloração em água corrente até que a água corre claro. </li></ol></li><li> Desidratação e montagem <ol><li> Dentro de um exaustor, sequencialmente mergulhe as lâminas em banhos contendo 70% ethanol, etanol a 95% e etanol a 100% durante 5 min cada. </li><li> Imergir as lâminas em banho contendo xileno durante 10 min. </li><li> Mount lamelas usando um meio de montagem à base de xileno. Seca-se horizontalmente e completamente em um exaustor antes de visualizar as lâminas com um microscópio </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

O protocolo aqui apresentado destina-se a proporcionar um método através do qual reprodutível para avaliar as alterações vasculares que são necessárias para a gravidez bem sucedida. Fundamental para o sucesso desta avaliação é a qualidade das secções de tecido. Ambos determinar com precisão a idade gestacional dos locais de implantação, bem como ligando de forma confiável as artérias uterinas são passos fundamentais. Alterações nos parâmetros como tempo de fixação, protocolo de processamento de tecidos, etc. também podem afetar o resultado. Para uma avaliação estereologia imparcial, é importante medir o mesmo número de recipientes em cada local de implante. Recomenda-se a medir 5 navios por local de implantação e cada local de implantação em triplicado. A média destas medições 15 representa o tamanho médio dos 5 maiores navios. Para além dos dados de RAG2 alymphoid - / - IL2RG - / - ratos mostrado aqui, encontramos este protOCOL úteis para um número de modelos de função imune materno inadequada, incluindo uma das células NK inibidos 14. Defeitos na remodelação arterial também têm sido mostrados em modelos de prejudicada invasão trofoblástica 18 e as técnicas descritas aqui podem ser úteis para avaliar a vasculatura nestes casos. Nós otimizado e validado este protocolo para investigação de remodelação vascular decidual no meio da gestação em camundongos, mas também é concebível para adaptar este protocolo para trabalhar em outros sistemas de modelos (por exemplo, ratos) ou mesmo em outros órgãos. Enquanto nós achamos que a remodelação NK-dependente pode ser robustamente avaliado em gd9.5, ele pode ser alterado para outros pontos de tempo, tais como gd12.5, quando a vasculatura materna está completamente remodelado. Neste ponto de tempo, a invasão do trofoblasto endovascular é mais profunda 16 e este ponto de tempo pode ser mais adequado para investigações de o papel de trofoblasto para alterações vasculares. Se as leituras quantitativas adicionais são desejados,investigadores também pode aumentar o número de secções coradas para SMA e avaliar a percentagem de vasos remodelados parcialmente dentro de cada local de implante. Uma limitação deste protocolo é a natureza descritiva dos exames histológicos. Os ensaios funcionais, no entanto, são apenas lentamente a tornar-se disponíveis (tal como ultra-som Doppler 19). Estas técnicas exigem perícia técnica e custos muito mais elevados para aquisição e manutenção de equipamento, mas tem a vantagem de proporcionar uma leitura longitudinal in vivo para o efeito das alterações que podem ser observadas histologicamente. Uma possível desvantagem de todos os exames estereológicos é a subjetividade dos investigadores. Para o efeito, utilizando dois examinadores independentes que analisam todas as amostras de forma independente pode ajudar a evitar esse problema. Enquanto o protocolo descrito aqui dá uma visão sobre a quantidade de sangue pode chegar a interface feto-materna, pode ser vantajoso para combiná-lo com o complabordagem ementary de avaliar a quantidade total de sangue a qualquer momento na vasculatura através de plástico lança 16. A força deste protocolo é que ele combina duas abordagens independentes. Alteração vascular é primeiro avaliada quantitativamente por estereologia eo resultado é então validado qualitativamente usando imuno-histoquímica. A confiabilidade dos resultados pode ser reforçada por randomizing as amostras. As amostras preparadas para este protocolo pode ser facilmente utilizado para investigar também outros parâmetros, tais como a gravidez de decidualização, o desenvolvimento do agregado linfóide mesometrial de gravidez (PAE) ou imunodetecção de células de interesse, para avaliar com rigor um fenótipo gravidez em midgestation. Remodelamento arterial é um passo crítico para gestações sem complicações em mulheres e fracasso dessas mudanças está na base das grandes síndromes obstétricas (GOS), ou seja, pré-eclampsia, restrição de crescimento fetal enatimorto. Nós apresentamos aqui as técnicas para avaliar cuidadosamente um fenótipo gravidez no mouse modelos que imitam algumas características da fisiopatologia da GOS.

A troca de nutrientes, gases e produtos residuais durante a gestação eutherian é mediada pela placenta. No trato reprodutivo feminino, as artérias uterinas são as principais condutas de sangue para o útero. Após a implantação, estes ramo em navios especializados chamados artérias em espiral que bobina através dos decídua basal para a unidade fetoplacentária. Diâmetro e elasticidade dessas artérias em espiral, que estão rodeados por leucócitos, em particular de células natural killer uterinas (desconhecido), ditar volume e velocidade do sangue disponível para a placenta 1,2. Alterações hemodinâmicas corretos, como resultado da remodelação das artérias em espiral são críticos para o sucesso da gravidez. Embora os mecanismos subjacentes diferem em detalhe entre o ser humano e murino a gravidez, o resultado final do processo de remodelação em ambas as espécies é dilatada, de alta condutância vasculatura que perde a sua camada de músculo liso. Em ratinhos, o interferão uNK derivada de células (SEN-) γ é necessário para induzir essas mudanças em torno de meados de gestação 3-5. Os ratos que não têm a utilização de células NK ou componentes da via de sinalização de IFN-γ não conseguem passar por essas mudanças e isso está associado à redução de 6,7 crescimento fetal, salientando a importância de um fornecimento de sangue adequado para a unidade fetoplacentária. Durante a gravidez humano início, a invasão intersticial e endovascular de trophoblast extravilosas e sua interação com células uNK são importantes para induzir alterações vasculares e promover o crescimento fetal 8-10. células uNK pode orquestrar a invasão do trofoblasto humano através quimiocinas 11 e citocinas, tais como granulócitos macrófagos - fator estimulante de colônia (GM-CSF) 12. Invasão do trofoblasto raso está associado à redução de remodelação arterial e complicações na gravidez, tais como pré-eclampsia 9. Este protocolo é baseado no trabalho pioneiro de Anne Croy que descreveu o importantepapel do sistema imunológico e, particularmente NK-derivado de IFN-γ para a remodelação vascular bem sucedida através de imuno-histoquímica e de transferência elegante experiências 5,13. Aqui nós descrevemos uma maneira rápida e econômica para avaliar o estado de remodelação das artérias em espiral. Embora nosso laboratório avalia rotineiramente isso em meados de gestação (dias de gestação (gd) 9.5) 14, o processo de remodelação ocorre entre gd8.5 e 12,5 15. O advento de scanners de slides automatizadas facilitou enormemente a avaliação da área do vaso e do lúmen das seções e encontramos esta ser uma abordagem mais reprodutível do que medir os diâmetros dos vasos. A adição de detecção imuno-histoquímica da SMA permite uma validação e simples dos resultados obtidos a partir da avaliação estereologia. Tal como acontece com todas as técnicas estereológicas, recomenda-se para efectuar a avaliação como uma experiência cega por pelo menos dois examinadores. Para este fim, um passo de aleatorização pode ser introduzido quando cortado em sérieting as amostras para que os investigadores avaliem os slides não sabem de qual grupo experimental as amostras vêm. O objetivo geral deste protocolo é o de proporcionar uma ferramenta confiável para avaliar cuidadosamente a remodelação das artérias em espiral em ratos com genótipos maternos e paternos definidos, no contexto de modelos de mouse para complicações relacionadas com a gravidez. Os resultados sublinham a dependência de células uNK do presente processo, que é essencial para o crescimento normal do feto.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 mice (8-12 weeks old)</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dental floss</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene</td><td></td><td></td><td>Used for holding tissue in place</td></tr><tr><td>Straight dissection scissors</td><td>EMS</td><td>72940</td><td></td></tr><tr><td>25 G needles</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>300600</td><td>Used for holding tissue in place</td></tr><tr><td>50 ml conical tubes</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Sigma</td><td>327204-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>X/0250/17</td><td></td></tr><tr><td>Automated tissue processor</td><td>Sakura</td><td>6032</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2245</td><td></td></tr><tr><td>Slide rack</td><td>Sigma</td><td>Z710989</td><td></td></tr><tr><td>Coplin jar</td><td>Sigma</td><td>S5891</td><td></td></tr><tr><td>Purified water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin solution, Gill No. 3</td><td>Sigma</td><td>GHS332-1L</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y solution</td><td>Sigma</td><td>HT110116-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fume hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene-based mounting media</td><td>VWR</td><td>361254D</td><td></td></tr><tr><td>Slide scanner</td><td>Hamamatsu</td><td>NanoZoomer</td><td></td></tr><tr><td>Slide scanner software</td><td>Hamamatsu</td><td>NDP viewer</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate tribasic dihydrate</td><td>Sigma</td><td>32320</td><td>Make 10 mM solution and adjust pH to 6</td></tr><tr><td>Pressure cooker</td><td></td><td></td><td>Used for antigen retrieval</td></tr><tr><td>Heating plate</td><td></td><td></td><td>Used for antigen retrieval</td></tr><tr><td>Hydrophobic barrier pen</td><td>Vector</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>H/1800/15</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffered saline</td><td>Sigma</td><td>T6664-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Mouse on mouse kit</td><td>Vector</td><td>BMK-2202</td><td>Significantly reduces background</td></tr><tr><td>Mouse anti-human smooth muscle actin</td><td>DAKO</td><td>M0851</td><td>Cross-reacts with mouse</td></tr><tr><td>IgG2a isotype control</td><td>DAKO</td><td>X0943</td><td></td></tr><tr><td>Humidified chamber</td><td>Sigma</td><td>H6644</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;-Diaminobenzidine solution</td><td>Sigma</td><td>D4293-5SET</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>H/1050/PB17</td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of maternal vascular remodeling during pregnancy in the mouse uterus

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.

RAG2 - / - IL2RG - / - ratinhos faltam todos os linfócitos maduros, incluindo células NK 17, e suas artérias uterinas deixar de sofrer as alterações vasculares vistas na wildtype congénica C57BL / 6 (WT) ratos em meados de gestação 5,14. Como resultado desta reduzida RAG2 remodelação - / - IL2RG - / - ratos mostram significativamente menores áreas luminais superfície, indicativos de navios em geral mais pequenas que podem ser visualizadas em secções H &amp; E-coradas e quantificados por estereologia (Figura 2). Além disso, a espessura da parede relativa (embarcação a proporção lúmen) é maior nas artérias espiraladas em destes ratinhos, sugerindo reduzido fornecimento de sangue arterial e a velocidade mais elevada. Esta avaliação quantitativa foi confirmada usando a detecção imunohistoquímica da SMA. É característico para ratinhos WT a perder a maior parte da SMA dentro da média vasculardas artérias em espiral até meados de gestação. Se este processo impulsionado por células NK não ocorrer, SMA permanece na mídia dos vasos e pode ser facilmente detectada immunohistochemically como anéis ao redor dos vasos sangüíneos (Figura 3). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig1.jpg" /> Figura 1: Rato útero em gd9.5, visão esquemática desenho mostrando a posição relativa dos cornos uterinos, colo do útero (azul) e principais artérias uterinas (vermelho).. Indicado são o eixo longo dos cornos uterinos (setas) e os pontos de ligação (setas tracejadas). As secções para imuno-histoquímica são cortadas ao longo do plano de vista. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig2.jpg" /> Figura 2:. Estereológica avaliação do remodelamento arterial em meados de gestação (A) Exemplo assessment de luminal e área total do vaso em secções H &amp; E manchadas de fêmeas WT no centro de 2/4 dos decídua basal (demarcada pelo preta vertical linhas tracejadas) no gd9.5. Nos navios em maior ampliação, correu a linha vermelha demarca área total de navio, amarelo linha tracejada demarca as áreas da luz. Barra = 500 um (esquerda), 50 uM (à direita). O longo eixo do útero é uma linha horizontal nesta orientação. (B) Quantificação de áreas luminais (painel esquerdo) e proporção de área para área total luminal do vaso (painel da direita) de WT (C57BL / 6) e RAG2 - / - IL2RG - / - ratinhos (em C57BL / 6 de fundo). Cada ponto de dados representa a média de 15 medições de 5 medições (por secção, 3 secções por local de implantação). Barras representam a média de n = 11-13 locais de implantação a partir de 4 gravidezes por grupo; p-valor a partir de uma de duas caudas, não emparelhado teste de Mann-Whitney. WT: tipo selvagem. <img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53534 / 53534fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3:. A detecção imuno-histoquímica de actina do músculo liso nas decídua basal coloração representativas SMA em WT (topo) e RAG2 - / - - / - IL2RG ratinhos (em C57BL / 6 fundo, na parte inferior) gd9.5. Barra = 100 um. WT: tipo selvagem.

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Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.

Avaliação do Maternal Vascular Reformas durante a gravidez no mouse Útero

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

assessment-maternal-vascular-remodeling-during-pregnancy-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.2K visualizações.  University of Cambridge. This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry. 

Vídeo: Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling

The murine spinotrapezius is a thin, superficial skeletal support muscle that extends from T3 to L4, and is easily accessible via dorsal skin incision. Its unique anatomy makes the spinotrapezius useful for investigation of ischemic injury and subsequent microvascular remodeling. Here, we demonstrate an arteriolar ligation model in the murine spinotrapezius muscle that was developed by our research team and previously published1-3. For certain vulnerable mouse strains, such as the Balb/c mouse, this ligation surgery reliably creates skeletal muscle ischemia and serves as a platform for investigating therapies that stimulate revascularization. Methods of assessment are also demonstrated, including the use of intravital and confocal microscopy. The spinotrapezius is well suited to such imaging studies due to its accessibility (superficial dorsal anatomy) and relative thinness (60-200 &mu;m). The spinotrapezius muscle can be mounted en face, facilitating imaging of whole-muscle microvascular networks without histological sectioning. We describe the use of intravital microscopy to acquire metrics following a functional vasodilation procedure; specifically, the increase in arterilar diameter as a result of muscle contraction. We also demonstrate the procedures for harvesting and fixing the tissues, a necessary precursor to immunostaining studies and the use of confocal microscopy.

We demonstrate a novel arterial ligation model in murine spinotrapezius muscle, including a step-by-step procedure and description of required instrumentation. We describe the surgery and relevant outcome measurements relating to vascular network remodeling and functional vasodilation using intravital and confocal microscopy.

Modelo Spinotrapezius murino para avaliar o impacto da ligadura arteriolar em função microvascular e Remodelação

The murine spinotrapezius is a thin, superficial skeletal support muscle that extends from T3 to L4, and is easily accessible via dorsal skin incision. ...

Medicina

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is routinely used as an in vivo model to study embryo implantation and pregnancy progression. Unfortunately, such murine studies require pregnancy interruption to enable follow-up phenotypic analysis. To address this issue, we used three-dimensional (3-D) reconstruction of HFUS imaging data for early detection and characterization of murine embryo implantation sites and their individual developmental progression in utero. Combining HFUS imaging with 3-D reconstruction and modeling, we were able to accurately quantify embryo implantation site number as well as monitor developmental progression in pregnant C57BL6J/129S mice from 5.5 days post coitus (d.p.c.) through to 9.5 d.p.c. with the use of a transducer. Measurements included: number, location, and volume of implantation sites as well as inter-implantation site spacing; embryo viability was assessed by cardiac activity monitoring. In the immediate post-implantation period (5.5 to 8.5 d.p.c.), 3-D reconstruction of the gravid uterus in both mesh and solid overlay format enabled visual representation of the developing pregnancies within each uterine horn. As genetically engineered mice continue to be used to characterize female reproductive phenotypes derived from uterine dysfunction, this method offers a new approach to detect, quantify, and characterize early implantation events in vivo. This novel use of 3-D HFUS imaging demonstrates the ability to successfully detect, visualize, and characterize embryo-implantation sites during early murine pregnancy in a non-invasive manner. The technology offers a significant improvement over current methods, which rely on the interruption of pregnancies for gross tissue and histopathologic characterization. Here we use a video and text format to describe how to successfully perform ultrasounds of early murine pregnancy to generate reliable and reproducible data with reconstruction of the uterine form in mesh and solid 3-D images.

Mice are widely used to study gestational biology. However, pregnancy termination is required for such studies which precludes longitudinal investigations and necessitates the use of large numbers of animals. Therefore, we describe a non-invasive technique of high-frequency ultrasonography for early detection and monitoring of post-implantation events in the pregnant mouse.

Um novo uso da ultra-sonografia tridimensional de alta frequência para caracterização de gravidez precoce no Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Biologia do Desenvolvimento

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular mechanisms of CHDs is&#160;crucial for inventing new preventive and therapeutic strategies. Mutant mouse models are powerful tools to discover new&#160;mechanisms&#160;and environmental stress modifiers that drive cardiac development and their potential&#160;alteration in CHDs. However, efforts to establish the causality of these putative contributors have been limited to histological&#160;and molecular studies&#160;in non-survival animal experiments, in which&#160;monitoring the key physiological and hemodynamic parameters is&#160;often absent. Live imaging technology has become an essential tool to establish the&#160;etiology of CHDs. In particular,&#160;ultrasound imaging can be used prenatally without surgically exposing the fetuses,&#160;allowing maintaining&#160;their baseline physiology while monitoring the impact of environmental stress&#160;on the hemodynamic and structural aspects of cardiac chamber development. Herein, we use the High-Frequency Ultrasound (30/45)&#160;system to examine the cardiovascular system in fetal mice at E18.5 in utero at the baseline and in response to prenatal hypoxia exposure. We demonstrate the feasibility of the system to measure cardiac chamber size, morphology, ventricular function, fetal heart rate, and umbilical artery flow indices, and their alterations in fetal mice exposed to systemic chronic hypoxia in utero in real time.

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

High-frequency ultrasound imaging of the fetal mouse has improved imaging resolution and can provide precise non-invasive characterization of cardiac development and structural defects. The protocol outlined herein is designed to perform real-time fetal mice echocardiography in vivo.

Imagem cardiovascular fetal de camundongo usando um sistema de ultrassom de alta frequência (30/45MHZ)

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and painless, and the application is easy, fast, and can be done anywhere, even with mobile devices. During pregnancy, ultrasound imaging is standardly used to closely monitor fetal development. The technique is important to assess intrauterine growth restriction (IUGR), a pregnancy complication with short- and long-term health consequences for both the mother and fetus. Understanding the process of IUGR is indispensable for developing effective therapeutic strategies. 
The ultrasound system used in this manuscript is an ultrasound device produced for the analysis of small animals and can be used in various research fields, including pregnancy research. Here we describe the usage of the system for in vivo analysis of fetuses from natural killer (NK) cell/mast cell (MC)-deficient mothers that give birth to growth-restricted pups. The protocol includes preparation of the system, handling of the mice before and during measurements, and the usage of the B-mode, color doppler mode, and pulse-wave doppler mode. Fetal size, placental size, and blood supply to the fetus were analyzed. We found reduced implantation sizes and smaller placentas in NK/MC-deficient mice from mid-gestation onwards. In addition, MC/NK-deficiency was associated with absent and reversed end diastolic flow in the fetal Arteria umbilicalis(UmA) and an elevated resistance index. The methods described in the protocol can easily be used for related and non-related research topics.

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Here we describe the technique of high frequency ultrasound for in vivo analysis of fetuses in mice. This method allows the follow-up of fetuses and the analysis of placental parameters as well as maternal and fetal blood flow throughout pregnancy.

Ultra-som de alta frequência para a análise do desenvolvimento Fetal e placentário na Vivo

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and ...

Is My Mouse Pregnant? High-Frequency Ultrasound Assessment

The mouse is the mammalian animal model of choice for many human diseases and biological processes. Developmental biology often requires staged-pregnant mice to determine evolving processes at various timepoints. Moreover, optimal and efficient breeding of model mice requires an assessment of timed pregnancies. Most commonly, mice are mated overnight, and the presence of a vaginal plug is determined; however, the positive predictive value of this technique is suboptimal, and one needs to wait to know if the mouse is truly pregnant. High-resolution ultrasound biomicroscopy is an effective and efficient tool for imaging: 1) Whether a mouse is pregnant; 2) What gestational stage the mouse has reached; and 3) Whether there are intrauterine losses. In addition to the embryos and fetuses, the investigator must also recognize common artifacts in the abdominal cavity so as not to mistake these for a gravid uterus. This article provides a protocol for imaging along with illustrative examples.

High-resolution ultrasound can help streamline experiments requiring timed-pregnant mice by determining the state of pregnancy, gestational age, and pregnancy losses. Presented here is a protocol to illustrate methods to assess mouse pregnancies as well as potential pitfalls (image artifacts) that may mimic pregnancy.

Meu rato está grávida? Avaliação de ultrassom de alta frequência

The mouse is the mammalian animal model of choice for many human diseases and biological processes. Developmental biology often requires staged-pregnant ...

Methods for Studying Uterine Contributions to Pregnancy Establishment in an Ovariectomized Mouse Model

For pregnancy to be established, a viable blastocyst must successfully interact with a receptive uterine lining (endometrium) to facilitate implantation and placenta formation and enable ongoing pregnancy. The limitations to pregnancy success caused by embryonic defects are well known and have been largely overcome in recent decades with the rise of in vitro fertilization (IVF) and assisted reproductive technologies. As yet, however, the field has not overcome the limitations caused by an inadequately receptive endometrium, thus resulting in stagnating IVF success rates. Ovarian and endometrial functions are closely intertwined, as hormones produced by the ovary are responsible for the endometrium's menstrual cyclicity. As such, when using rodent models of pregnancy, it can be difficult to ascertain whether an observed result is due to an ovarian or uterine deficit. To overcome this, an ovariectomized mouse model was developed with embryo transfer or artificial decidualization to allow the study of uterine-specific contributions to pregnancy. This article will provide instructions on how to perform ovariectomy and offer insights into various techniques for supplying exogenous hormones to support successful artificial decidualization or pregnancy following embryo transfer from healthy donors. These techniques include subcutaneous injection, slow-release pellets, and osmotic mini pumps. The key advantages and disadvantages of each method will be discussed, enabling researchers to choose the best study design for their specific research question.

Pregnancy establishment is a dynamic process involving complex embryo and uterine crosstalk. The precise contributions of the maternal uterine environment to these processes remain an active area of investigation. Here, detailed protocols are provided to aid in designing in vivo animal models to address these research questions.

Métodos para o Estudo das Contribuições Uterinas para o Estabelecimento da Gestação em Modelo de Camundongo Ovariectomizado

For pregnancy to be established, a viable blastocyst must successfully interact with a receptive uterine lining (endometrium) to facilitate implantation ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies of this phenomenon have been performed in either models with severe intrauterine ischemia or models with gradient degree of intrauterine hypoperfusion. No study has been performed in a model on uniform mild intrauterine hypoperfusion (MIUH). Two models have been used for studies of MIUH: a model based on suture ligation of either side of the arterial arcade formed with the uterine and ovarian arteries, and a transient model based on clipping the bilateral ovarian arteries and aorta having patency. Those two rodent models of MIUH have some limitations, e.g., not all fetuses are subjected to MIUH, depending on their position in the uterine horn. In our MIUH model, all fetuses are subjected to a comparable level of intrauterine hypoperfusion. MIUH was achieved by mild stenosis of all four arteries feeding the uterus, i.e., the bilateral uterine and ovarian arteries.
Arterial stenosis was induced by metal microcoils wrapped around the feeding arteries. Producing arterial stenosis with microcoils allowed us to control, optimize, and reproduce decreased blood flow with very little inter-animal variability and a low mortality rate, thus enabling accurate evaluation. When microcoils with an inner diameter of 0.24 mm were used, the blood flow in both the placenta and fetus was mildly decreased (approximately 30% from the pre-stenosis level in the placenta). The offspring of our MIUH model clearly demonstrates long-lasting alterations in neurological, neuroanatomical and behavioral test results.

Mild intrauterine hypoperfusion was produced by artery stenosis with metal microcoils wrapped around the uterine and ovarian arteries in rats at embryonic day 17. This procedure produced prenatal hypoperfusion and intrauterine growth restriction.

Um modelo do rato de leve hipoperfusão intra-uterino com estenose Microcoil

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...

Neurociência

Ultrasonography in Experimental Reproductive Investigations on Rats

With the development of assisted reproductive technology and the ethical limitations of research on humans, rat animal models have been widely used in reproductive medicine. In the past, the study of reproductive system development in rodents has been based on one-time histological examination of excised tissues. Recently, with the development of high-resolution transabdominal ultrasound, high-quality sonography can now be performed to evaluate the reproductive organs of rats, allowing a new method for studying the reproductive system. Images were obtained using a high-resolution ultrasonographic system. Gynecological ultrasonography was performed on 28 eight-week-old non-pregnant rats and 5 pregnant Sprague-Dawley rats. We describe how to recognize organs of the reproductive system and associated structures in typical views during different phases of the estrus cycle. Color flow Doppler was used to measure uterine artery blood flow and evaluate uterine blood flow pattern changes during different stages of pregnancy. We have demonstrated that ultrasound exploration is a useful method for evaluating changes in internal reproductive organs. Its use raises the possibility of conducting additional experiments, including medical or surgical procedures, and provides the ability to monitor sonographic changes to internal organs without sacrificing animals.

This manuscript describes the utility of ultrasound performed on female rats to design experimental models for reproductive and gynecological investigation. A step-by-step explanation of how to perform ultrasonographic evaluation is shown.

Ultrasonografia em investigações de reprodução Experimental em ratos

With the development of assisted reproductive technology and the ethical limitations of research on humans, rat animal models have been widely used in ...

Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, gliosis&#160;and a progressive change in vascular function and structure. Although the onset of the retinopathies is characterized by subtle disturbances in visual perception, the modifications in the vascular plexus are the first signs detected by clinicians. The absence or presence of neovascularization determines whether the retinopathy is classified as either non-proliferative (NPDR) or proliferative (PDR). In this sense, several animal models tried to mimic specific vascular features of each stage to determine the underlying mechanisms involved in endothelium alterations, neuronal death and other events taking place in the retina. In this article, we will provide a complete description of the procedures required for the measurement of retinal vascular parameters in adults and early birth mice at postnatal day (P)17. We will detail the protocols to carry out retinal vascular staining with Isolectin GSA-IB4 in whole mounts for later microscopic visualization. Key steps for image processing with Image J Fiji software are also provided, therefore, the readers will be able to measure vessel density, diameter and tortuosity, vascular branching, as well as avascular and neovascular areas. These tools are highly helpful to evaluate and quantify vascular alterations in both non-proliferative and proliferative retinopathies.

This article describes a well-established and reproducible lectin stain assay for the whole mount retinal preparations and the protocols required for the quantitative measurement of vascular parameters frequently altered in proliferative and non-proliferative retinopathies.

Quantificação de Parâmetros Vasculares em Retinas inteiras de Camundongos com Retinopatias Não Proliferativas e Proliferativas

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, ...

Development of a Murine Model for Femoral Artery Anastomotic Stenosis

In vascular surgery, vascular anastomosis is a common reconstructive technique used to restore blood flow. However, anastomotic restenosis is a frequent postoperative complication, primarily caused by surgery-induced vascular injury, intimal hyperplasia, and inflammatory responses. The mouse femoral artery anastomosis model is widely used to investigate the mechanisms of anastomotic restenosis and vascular repair. Microscopically guided end-to-end femoral artery anastomosis allows precise simulation of vascular injury and repair processes following surgery, providing a reliable experimental tool for studying the pathological mechanisms related to restenosis. This study focuses on refining the surgical technique for femoral artery anastomosis in mice. Through refinements in surgical techniques and optimization of technical details, we have achieved a marked increase in the success rate and reproducibility of the model. Specific improvements include refined vascular handling techniques during surgery, the selection of suture materials, and the optimization of suturing methods to minimize anastomotic leakage and postoperative occlusion. The study also emphasizes the observation of intimal hyperplasia, vascular remodeling at the anastomotic site, and long-term vessel patency. Through this research, we provide a concise and efficient operational guide for performing mouse femoral artery anastomosis, offering reliable technical support for experimental studies in vascular surgery. This work lays a solid foundation for subsequent investigations into related mechanisms and evaluations of therapeutic intervention.

Here we present a murine model for femoral artery anastomosis, offering researchers a valuable animal model to study and simulate vascular anastomotic stenosis. This development is crucial for advancing our understanding of the pathophysiology underlying this condition and facilitating more accurate and effective research into vascular diseases.

Desenvolvimento de um modelo murino para estenose anastomótica da artéria femoral

In vascular surgery, vascular anastomosis is a common reconstructive technique used to restore blood flow. However, anastomotic restenosis is a frequent ...