The authors would like to thank all members of the Colucci lab for helpful discussions. This work was funded by The Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], The Centre for Trophoblast Research and The British Heart Foundation.

Todos os procedimentos descritos neste manuscrito estão em conformidade com os regulamentos UK Home Office e são aprovados pelo Painel de Revisão Ética Cambridge. 1. Coleta de Amostras <ol><li> Configure acasalamentos programados usando 8-12 semanas de idade do sexo feminino camundongos C57BL / 6 com homens adultos (até 2 fêmeas para cada macho) à tarde. Verificar a presença de tampões vaginais como um sinal de cópula no início da manhã, nos seguintes dias. A presença de um plug no gd0.5 marcas manhã. </li><li> Em gd9.5, sacrificar o animal por deslocamento cervical e a cavidade abdominal aberta. Note-se que a eutanásia por CO 2 pode causar vasodilatação. </li><li> Use fio dental para ligar suavemente as artérias uterinas (figura 1, setas tracejadas). Amarrar o fio em volta das artérias na ponta de cada trompa uterina, proximal para os ovários, bem como em torno do colo do útero. Nota: Não ruptura dos vasos, pois isso pode resultar em artérias desabaram. </li> &lt;li&gt; Dissecar o útero rapidamente usando tesouras de dissecação, extraindo todo o útero distalmente para os três pontos de ligação na ponta dos cornos uterinos e do colo do útero. </li><li> Colocar o útero em um pedaço de poliestireno preparadas de tal modo que ambos os cornos estão alinhadas ao longo do mesmo eixo longo em direcções opostas a partir do colo do útero. Gentilmente esticá-lo e fixá no lugar usando 2-3 25 agulhas G. </li><li> Mergulha-se o poliestireno em um tubo de 50 ml preparadas cónica. Encher a 50 ml com formalina a 10%. Fix para 5-6 horas à temperatura ambiente. </li><li> Descartar a solução de formalina e substituir com 50 ml de solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS) durante 5 min. </li><li> Extirpar os dois cornos uterinos proximal ao ponto de ligação em cada extremidade e proximal do colo do útero no centro, aparar qualquer excesso de gordura ao redor dos locais de implantação e lavar duas vezes em PBS durante 5 minutos para remover traços de formol. </li><li> Armazenar as amostras em etanol a 70% a 4 ° C (até duas semanas) até ao processamento. CUIDADO: Ethanol é altamente inflamável. </li><li> Usar um sistema de processamento automatizado utilizando os parâmetros indicados no Quadro 1. Incorporar os chifres individualmente em parafina, de modo que eles podem ser cortados ao longo do plano perpendicular ao longo eixo do útero. Isto garante que a área máxima de cada local de implantação será exposto para análise no meio do bloco (Figura 2A). OPCIONAL: Este é um ponto de tempo conveniente para a randomização dos blocos se se desejar. </li><li> Usando um micrótomo, corte cortes seriados de 7 de espessura mm a partir dos blocos. Manchar uma seção a cada intervalo de 49 mm com hematoxilina e eosina (H &amp; E, ver secção 2.1). Armazenar os restantes secções à temperatura ambiente para a coloração SMA e outras aplicações a jusante. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:99px;"> Solução </td><td style="width:43px;"> Tempo<html></td><td style="width:97px;"> Temperatura </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 70% Etanol </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Etanol </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Etanol </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Etanol </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Etanol </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Etanol </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Etanol </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21">: 21px; &quot;&gt; O xileno </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Xileno </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Xileno </td><td> 1 hr </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Parafina </td><td> 1 hr </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Parafina </td><td> 1 hr </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Parafina </td><td> 1 hr </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> Parafina </td><td> 1 hr </td><td> 63 ° C </td></tr></tbody></table> Tabela 1:. Definições para processamento de tecidos automatizado Visão geral da configuração usada para o processamento de tecido uterino 2. SterAvaliação eological <ol><li> H &amp; E Coloração <ol><li> Desparafinar secções imergindo as lâminas montadas num suporte de lâminas em um banho de xileno a 100% durante 10 min à temperatura ambiente. CUIDADO: O xileno é inflamável e um cancerígeno que é tóxico através do contato e inalação. Este trabalho deve ser realizado em um exaustor, utilizando equipamento de protecção individual (EPI). </li><li> Imergir as lâminas em banho contendo xileno limpo por mais 10 min. </li><li> Sequencialmente mergulhe as lâminas em banhos contendo etanol a 100%, etanol a 95%, etanol a 70% e água purificada durante 5 minutos cada. </li><li> Imergir as lâminas em 50% Gill n 3 hematoxilina solução, diluiu-se com água purificada, durante 5 min. CUIDADO: Hematoxilina é nocivo por ingestão e contato com os olhos. Utilizar EPI adequado ao manusear. </li><li> Lavar as lâminas em uma calha de coloração em água corrente por 10 min. </li><li> Imergir as lâminas em 1% de solução de ácido / álcool (1% de ácido clorídrico a 10 M em etanol a 70%) durante 10 sege lavar em uma calha de coloração em água corrente. </li><li> Imergir as lâminas em solução de eosina para 30 seg e lavar em uma calha de coloração em água corrente por 10 min. </li><li> Dentro de um exaustor de fumos, sequencialmente mergulhe as lâminas em banhos contendo etanol a 70%, etanol a 95% e etanol a 100% durante 5 min cada. </li><li> Imergir as lâminas em banho contendo xileno durante 10 min. </li><li> Mount lamelas usando um meio de montagem à base de xileno. Seca-se horizontalmente e completamente em um exaustor antes de visualizar as lâminas com um microscópio. </li></ol></li><li> Avaliação estereológica de tamanho do vaso e remodelamento Estado <ol><li> Para cada local de implantação, determinar quais seções estão perto do ponto midsagittal. O anexo corioalantï¿½ca entre o feto ea placenta em desenvolvimento serve como um bom indicador do ponto midsagittal. </li><li> Selecione 3 seções em 49 mm intervalos próximos ao ponto midsagittal para a análise. Digitalizar slides selecionados. A fim de evitar Including veias, que foram mostrados para ser mais perifericamente localizados nos locais de implantação 16, restringir a análise no centro de 2/4 de cada local de implante (Figura 2A). </li><li> Para avaliar o tamanho do lúmen, desenhar em torno do interior dos vasos e gravar a área desta forma. Para o tamanho total do vaso, desenhar em torno da parede exterior do recipiente, incluindo as células endoteliais, pericitos e leucócitos intramurais. Nota: A relação entre o tamanho total do vaso de lúmen é um proxy para o status de remodelação de uma embarcação. Como os navios de bobina através do plano da secção que foi cortado ao longo, pode haver várias secções transversais da mesma artéria numa única lâmina. Evitar a medição da mesma artéria várias vezes. </li><li> Grave as medições dos 5 navios em cada local de implantação com as maiores e mais redondos lumens. Meça cada local de implantação em triplicata (três seções espaçadas 49 mm afastados uns dos outros). A média destes 15 medições represeNTS o diâmetro médio dos vasos maiores. </li><li> Para evitar sobre-representação de navios maiores em algumas amostras, meça o mesmo número de embarcações em cada local de implantação. </li></ol></li></ol> 3. Avaliação Qualitativa Usando imunohistoquímica <ol><li> Desparafinização e reidratação <ol><li> Desparafinar secções imergindo as lâminas montadas num suporte de corrediça resistente ao calor num banho de xileno a 100% durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Imergir as lâminas em banho contendo xileno limpo por mais 10 min. </li><li> Sequencialmente mergulhe as lâminas em banhos contendo etanol a 100%, etanol a 95% e 70% e com água purificada durante 5 minutos cada. </li></ol></li><li> Antigen Recuperação <ol><li> Preparar um tampão de citrato de sódio 10 mM em água purificada e ajustar até pH 6 utilizando ácido clorídrico a 10 M. </li><li> Encha um recipiente resistente ao calor que pode conter 600 ml com 400 ml de tampão citrato de sódio e coloque em uma panela de pressão doméstica contendo wat suficienteer para submergir metade do recipiente. Genericamente anexar a tampa da panela de pressão e de calor até à ebulição. </li><li> Colocar a lâmina cremalheira no tampão de citrato de sódio e fixar firmemente a tampa da panela de pressão. Uma vez pressurizada, deixar ferver durante 3 min. </li><li> Retire a pressão da panela de pressão e retire o recipiente interior. Permitir lâminas arrefecer no tampão de citrato de sódio durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavagem das lâminas num banho contendo água purificada durante 5 min. </li><li> Cercar as seções usando uma caneta barreira hidrofóbica. </li><li> Lavagem das lâminas por imersão em PBS durante 5 min. </li></ol></li><li> O bloqueio da peroxidase endógena e a ligação não específica <ol><li> Incubar secções com 3% de peróxido de hidrogénio diluído em água purificada numa câmara humidificada, durante 30 min à temperatura ambiente. CUIDADO: O peróxido de hidrogênio é altamente irritante para os olhos, a pele e por ingestão. Utilizar EPI adequado. </li><li> Toque o excesso de solução de peróxido de hidrogênio e lave SLIdes duas vezes por imersão em solução salina tamponada com Tris (TBS) durante 2 minutos cada. </li><li> Incubar secções com imunoglobulina de ratinho a partir do reagente de bloqueio do rato no kit de rato preparadas de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Lavagem das lâminas em TBS duas vezes durante 2 minutos cada. </li></ol></li><li> A imunodetecção de actina de músculo liso <ol><li> Preparar a solução diluente de anticorpo (fornecido no kit) e incubar com as secções durante 5 min à temperatura ambiente, ou de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Dilui-se 1: 100 actina de músculo liso de ratinho anti-humano (Dako M0851) em solução diluente de anticorpo. Diluir controlo de isotipo de IgG2a de ratinho em solução diluente de anticorpo, assegurando que a concentração de imunoglobulina final é equivalente em ambas as soluções. </li><li> Toque o excesso de seções de solução diluente de anticorpo e cobrir com tanto soluções de controle de anticorpos isotípicos ou diluído. Incubar numa câmara húmida durante 30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Lave as lâminas duas vezes em TBS para2 min cada. </li><li> Diluir anticorpo anti-ratinho biotinilado secundário e secções incubar durante 10 min à temperatura ambiente, ou de acordo com as instruções dos fabricantes. </li><li> Lavagem das lâminas uma vez cada com TBS e PBS durante 2 min, respectivamente. </li><li> Preparar a solução de 3,3&#39;-diaminobenzidina (DAB) de acordo com as instruções do fabricante. Cubra seções com solução DAB e incubar por até 4 min, garantindo para monitorar seções para evitar o excesso de desenvolvimento da cor. CUIDADO: DAB é inflamável e um cancerígeno que é tóxico através do contato e inalação. Utilizar EPI adequado ao manusear. </li><li> Imergir as lâminas em água purificada uma vez intensidade da coloração desejada seja atingida. </li><li> Contracoloração com 50% Gill No. 3 hematoxilina durante 20 segundos e lavar em uma calha de coloração em água corrente até que a água corre claro. </li></ol></li><li> Desidratação e montagem <ol><li> Dentro de um exaustor, sequencialmente mergulhe as lâminas em banhos contendo 70% ethanol, etanol a 95% e etanol a 100% durante 5 min cada. </li><li> Imergir as lâminas em banho contendo xileno durante 10 min. </li><li> Mount lamelas usando um meio de montagem à base de xileno. Seca-se horizontalmente e completamente em um exaustor antes de visualizar as lâminas com um microscópio </li></ol></li></ol>

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A., Zhang, J., Tayade, C., Colucci, F., Yadi, H., Yamada, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+uterine+natural+killer+cells+in+mice.">Analysis of uterine natural killer cells in mice.</a> Methods Mol Biol. 612, 465-503 (2010).</li><li>Kieckbusch, J., Gaynor, L. M., Moffett, A., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC-dependent+inhibition+of+uterine+NK+cells+impedes+fetal+growth+and+decidual+vascular+remodelling.">MHC-dependent inhibition of uterine NK cells impedes fetal growth and decidual vascular remodelling.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li><li>Zhang, J., Chen, Z., Smith, G. N., Croy, B. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+NK+cell+development+using+a+novel+alymphoid+mouse+model:+Investigating+the+role+of+the+c-abl+proto-oncogene+in+murine+NK+cell+differentiation.">Dissecting NK cell development using a novel alymphoid mouse model: Investigating the role of the c-abl proto-oncogene in murine NK cell differentiation.</a> J Immunol. 162 (5), 2761-2765 (1999).</li><li>Hu, D., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+Tpbpa-positive+trophoblast+precursors+leads+to+defects+in+maternal+spiral+artery+remodeling+in+the+mouse+placenta.">Ablation of Tpbpa-positive trophoblast precursors leads to defects in maternal spiral artery remodeling in the mouse placenta.</a> Dev Biol. 358 (1), 231-239 (2011).</li><li>Zhang, J. H., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Ultrasonography+to+Define+Fetal-Maternal+Relationships:+Moving+from+Humans+to+Mice.">Using Ultrasonography to Define Fetal-Maternal Relationships: Moving from Humans to Mice.</a> Comparative Med. 59 (6), 527-533 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

O protocolo aqui apresentado destina-se a proporcionar um método através do qual reprodutível para avaliar as alterações vasculares que são necessárias para a gravidez bem sucedida. Fundamental para o sucesso desta avaliação é a qualidade das secções de tecido. Ambos determinar com precisão a idade gestacional dos locais de implantação, bem como ligando de forma confiável as artérias uterinas são passos fundamentais. Alterações nos parâmetros como tempo de fixação, protocolo de processamento de tecidos, etc. também podem afetar o resultado. Para uma avaliação estereologia imparcial, é importante medir o mesmo número de recipientes em cada local de implante. Recomenda-se a medir 5 navios por local de implantação e cada local de implantação em triplicado. A média destas medições 15 representa o tamanho médio dos 5 maiores navios. Para além dos dados de RAG2 alymphoid - / - IL2RG - / - ratos mostrado aqui, encontramos este protOCOL úteis para um número de modelos de função imune materno inadequada, incluindo uma das células NK inibidos 14. Defeitos na remodelação arterial também têm sido mostrados em modelos de prejudicada invasão trofoblástica 18 e as técnicas descritas aqui podem ser úteis para avaliar a vasculatura nestes casos. Nós otimizado e validado este protocolo para investigação de remodelação vascular decidual no meio da gestação em camundongos, mas também é concebível para adaptar este protocolo para trabalhar em outros sistemas de modelos (por exemplo, ratos) ou mesmo em outros órgãos. Enquanto nós achamos que a remodelação NK-dependente pode ser robustamente avaliado em gd9.5, ele pode ser alterado para outros pontos de tempo, tais como gd12.5, quando a vasculatura materna está completamente remodelado. Neste ponto de tempo, a invasão do trofoblasto endovascular é mais profunda 16 e este ponto de tempo pode ser mais adequado para investigações de o papel de trofoblasto para alterações vasculares. Se as leituras quantitativas adicionais são desejados,investigadores também pode aumentar o número de secções coradas para SMA e avaliar a percentagem de vasos remodelados parcialmente dentro de cada local de implante. Uma limitação deste protocolo é a natureza descritiva dos exames histológicos. Os ensaios funcionais, no entanto, são apenas lentamente a tornar-se disponíveis (tal como ultra-som Doppler 19). Estas técnicas exigem perícia técnica e custos muito mais elevados para aquisição e manutenção de equipamento, mas tem a vantagem de proporcionar uma leitura longitudinal in vivo para o efeito das alterações que podem ser observadas histologicamente. Uma possível desvantagem de todos os exames estereológicos é a subjetividade dos investigadores. Para o efeito, utilizando dois examinadores independentes que analisam todas as amostras de forma independente pode ajudar a evitar esse problema. Enquanto o protocolo descrito aqui dá uma visão sobre a quantidade de sangue pode chegar a interface feto-materna, pode ser vantajoso para combiná-lo com o complabordagem ementary de avaliar a quantidade total de sangue a qualquer momento na vasculatura através de plástico lança 16. A força deste protocolo é que ele combina duas abordagens independentes. Alteração vascular é primeiro avaliada quantitativamente por estereologia eo resultado é então validado qualitativamente usando imuno-histoquímica. A confiabilidade dos resultados pode ser reforçada por randomizing as amostras. As amostras preparadas para este protocolo pode ser facilmente utilizado para investigar também outros parâmetros, tais como a gravidez de decidualização, o desenvolvimento do agregado linfóide mesometrial de gravidez (PAE) ou imunodetecção de células de interesse, para avaliar com rigor um fenótipo gravidez em midgestation. Remodelamento arterial é um passo crítico para gestações sem complicações em mulheres e fracasso dessas mudanças está na base das grandes síndromes obstétricas (GOS), ou seja, pré-eclampsia, restrição de crescimento fetal enatimorto. Nós apresentamos aqui as técnicas para avaliar cuidadosamente um fenótipo gravidez no mouse modelos que imitam algumas características da fisiopatologia da GOS.

A troca de nutrientes, gases e produtos residuais durante a gestação eutherian é mediada pela placenta. No trato reprodutivo feminino, as artérias uterinas são as principais condutas de sangue para o útero. Após a implantação, estes ramo em navios especializados chamados artérias em espiral que bobina através dos decídua basal para a unidade fetoplacentária. Diâmetro e elasticidade dessas artérias em espiral, que estão rodeados por leucócitos, em particular de células natural killer uterinas (desconhecido), ditar volume e velocidade do sangue disponível para a placenta 1,2. Alterações hemodinâmicas corretos, como resultado da remodelação das artérias em espiral são críticos para o sucesso da gravidez. Embora os mecanismos subjacentes diferem em detalhe entre o ser humano e murino a gravidez, o resultado final do processo de remodelação em ambas as espécies é dilatada, de alta condutância vasculatura que perde a sua camada de músculo liso. Em ratinhos, o interferão uNK derivada de células (SEN-) γ é necessário para induzir essas mudanças em torno de meados de gestação 3-5. Os ratos que não têm a utilização de células NK ou componentes da via de sinalização de IFN-γ não conseguem passar por essas mudanças e isso está associado à redução de 6,7 crescimento fetal, salientando a importância de um fornecimento de sangue adequado para a unidade fetoplacentária. Durante a gravidez humano início, a invasão intersticial e endovascular de trophoblast extravilosas e sua interação com células uNK são importantes para induzir alterações vasculares e promover o crescimento fetal 8-10. células uNK pode orquestrar a invasão do trofoblasto humano através quimiocinas 11 e citocinas, tais como granulócitos macrófagos - fator estimulante de colônia (GM-CSF) 12. Invasão do trofoblasto raso está associado à redução de remodelação arterial e complicações na gravidez, tais como pré-eclampsia 9. Este protocolo é baseado no trabalho pioneiro de Anne Croy que descreveu o importantepapel do sistema imunológico e, particularmente NK-derivado de IFN-γ para a remodelação vascular bem sucedida através de imuno-histoquímica e de transferência elegante experiências 5,13. Aqui nós descrevemos uma maneira rápida e econômica para avaliar o estado de remodelação das artérias em espiral. Embora nosso laboratório avalia rotineiramente isso em meados de gestação (dias de gestação (gd) 9.5) 14, o processo de remodelação ocorre entre gd8.5 e 12,5 15. O advento de scanners de slides automatizadas facilitou enormemente a avaliação da área do vaso e do lúmen das seções e encontramos esta ser uma abordagem mais reprodutível do que medir os diâmetros dos vasos. A adição de detecção imuno-histoquímica da SMA permite uma validação e simples dos resultados obtidos a partir da avaliação estereologia. Tal como acontece com todas as técnicas estereológicas, recomenda-se para efectuar a avaliação como uma experiência cega por pelo menos dois examinadores. Para este fim, um passo de aleatorização pode ser introduzido quando cortado em sérieting as amostras para que os investigadores avaliem os slides não sabem de qual grupo experimental as amostras vêm. O objetivo geral deste protocolo é o de proporcionar uma ferramenta confiável para avaliar cuidadosamente a remodelação das artérias em espiral em ratos com genótipos maternos e paternos definidos, no contexto de modelos de mouse para complicações relacionadas com a gravidez. Os resultados sublinham a dependência de células uNK do presente processo, que é essencial para o crescimento normal do feto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="704">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">C57BL/6 mice (8-12 weeks old)</td>
			<td style="width:99px;">Charles River</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Dental floss</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Polystyrene</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Used for holding tissue in place</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Straight dissection scissors</td>
			<td style="width:99px;">EMS</td>
			<td style="width:111px;">72940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">25G needles</td>
			<td style="width:99px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:111px;">300600</td>
			<td>Used for holding tissue in place</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:99px;">Falcon</td>
			<td style="width:111px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P3813-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Ethanol</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">32221-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Paraffin</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">327204-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Xylene</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">X/0250/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Automated tissue processor</td>
			<td style="width:99px;">Sakura</td>
			<td style="width:111px;">6032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Microtome</td>
			<td style="width:99px;">Leica</td>
			<td style="width:111px;">RM2245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Slide rack</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">Z710989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Coplin jar</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">S5891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Purified water</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Hematoxylin solution, Gill No. 3</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">GHS332-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Eosin Y solution</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">HT110116-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Fume hood</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Xylene-based mounting media</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;">361254D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Slide scanner</td>
			<td style="width:99px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:111px;">NanoZoomer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Slide scanner software</td>
			<td style="width:99px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:111px;">NDP viewer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">32320</td>
			<td>Make 10 mM solution and adjust pH to 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Pressure cooker</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Used for antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Heating plate</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Used for antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Hydrophobic barrier pen</td>
			<td style="width:99px;">Vector</td>
			<td style="width:111px;">H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">H/1800/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Tris buffered saline</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">T6664-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Mouse on mouse kit</td>
			<td style="width:99px;">Vector</td>
			<td style="width:111px;">BMK-2202</td>
			<td>Significantly reduces background</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Mouse anti-human smooth muscle actin</td>
			<td style="width:99px;">DAKO</td>
			<td style="width:111px;">M0851</td>
			<td>Cross-reacts with mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">IgG2a isotype control</td>
			<td style="width:99px;">DAKO</td>
			<td style="width:111px;">X0943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Humidified chamber</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">H6644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">3,3&#8217;-Diaminobenzidine solution</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">D4293-5SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">H/1050/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of maternal vascular remodeling during pregnancy in the mouse uterus

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.

RAG2 - / - IL2RG - / - ratinhos faltam todos os linfócitos maduros, incluindo células NK 17, e suas artérias uterinas deixar de sofrer as alterações vasculares vistas na wildtype congénica C57BL / 6 (WT) ratos em meados de gestação 5,14. Como resultado desta reduzida RAG2 remodelação - / - IL2RG - / - ratos mostram significativamente menores áreas luminais superfície, indicativos de navios em geral mais pequenas que podem ser visualizadas em secções H &amp; E-coradas e quantificados por estereologia (Figura 2). Além disso, a espessura da parede relativa (embarcação a proporção lúmen) é maior nas artérias espiraladas em destes ratinhos, sugerindo reduzido fornecimento de sangue arterial e a velocidade mais elevada. Esta avaliação quantitativa foi confirmada usando a detecção imunohistoquímica da SMA. É característico para ratinhos WT a perder a maior parte da SMA dentro da média vasculardas artérias em espiral até meados de gestação. Se este processo impulsionado por células NK não ocorrer, SMA permanece na mídia dos vasos e pode ser facilmente detectada immunohistochemically como anéis ao redor dos vasos sangüíneos (Figura 3). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig1.jpg" /> Figura 1: Rato útero em gd9.5, visão esquemática desenho mostrando a posição relativa dos cornos uterinos, colo do útero (azul) e principais artérias uterinas (vermelho).. Indicado são o eixo longo dos cornos uterinos (setas) e os pontos de ligação (setas tracejadas). As secções para imuno-histoquímica são cortadas ao longo do plano de vista. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig2.jpg" /> Figura 2:. Estereológica avaliação do remodelamento arterial em meados de gestação (A) Exemplo assessment de luminal e área total do vaso em secções H &amp; E manchadas de fêmeas WT no centro de 2/4 dos decídua basal (demarcada pelo preta vertical linhas tracejadas) no gd9.5. Nos navios em maior ampliação, correu a linha vermelha demarca área total de navio, amarelo linha tracejada demarca as áreas da luz. Barra = 500 um (esquerda), 50 uM (à direita). O longo eixo do útero é uma linha horizontal nesta orientação. (B) Quantificação de áreas luminais (painel esquerdo) e proporção de área para área total luminal do vaso (painel da direita) de WT (C57BL / 6) e RAG2 - / - IL2RG - / - ratinhos (em C57BL / 6 de fundo). Cada ponto de dados representa a média de 15 medições de 5 medições (por secção, 3 secções por local de implantação). Barras representam a média de n = 11-13 locais de implantação a partir de 4 gravidezes por grupo; p-valor a partir de uma de duas caudas, não emparelhado teste de Mann-Whitney. WT: tipo selvagem. <img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53534 / 53534fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3:. A detecção imuno-histoquímica de actina do músculo liso nas decídua basal coloração representativas SMA em WT (topo) e RAG2 - / - - / - IL2RG ratinhos (em C57BL / 6 fundo, na parte inferior) gd9.5. Barra = 100 um. WT: tipo selvagem.

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Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.

Avaliação do Maternal Vascular Reformas durante a gravidez no mouse Útero

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

assessment-maternal-vascular-remodeling-during-pregnancy-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.0K visualizações.  University of Cambridge. This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry. 

Vídeo: Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-&#946;-Hydroxysteroid dehydrogenase /&#916;5-4 isomerase (3&#946;-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3&#946;-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3&#946;-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

The interrenal gland in zebrafish is the teleostean counterpart of the mammalian adrenal gland. This protocol introduces how to perform the 3-&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase (&#916;5-4 isomerase; 3&#946;-Hsd) enzymatic activity assay, which detects differentiated steroidogenic cells in the developing zebrafish.

Visualizando o Tissue interrenais Steroidogenic e sua Vascular Microenvironment em Zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

Biologia do Desenvolvimento

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into the developing oocyte. Because these events rely on maternal products which typically act very soon after fertilization-that preexist inside the egg, standard approaches for expression and functional reduction involving the injection of reagents into the fertilized egg are typically ineffective. Instead, such manipulations must be performed during oogenesis, prior to or during the accumulation of maternal products. This article describes in detail a protocol for the in vitro maturation of immature zebrafish oocytes and their subsequent in vitro fertilization, yielding viable embryos that survive to adulthood. This method allows the functional manipulation of maternal products during oogenesis, such as the expression of products for phenotypic rescue and tagged construct visualization, as well as the reduction of gene function through reverse-genetics agents.

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

An optimized protocol for the in vitro maturation of zebrafish oocytes used for the manipulation of maternal gene products is presented here.

Manipulação funcional do gene materno produtos Usando<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturação do oócito em Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

Análise do induzida por ácido retinóico Neural diferenciação de células estaminais embrionárias rato em corpos embrióides Dois e tridimensionais

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

Uma nova técnica de transplante de almofada de gordura mamária para visualizar a geração de vasos de células vasculares endoteliais vasculares

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imagem ao vivo do mouse Fusão do palato secundário

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is routinely used as an in vivo model to study embryo implantation and pregnancy progression. Unfortunately, such murine studies require pregnancy interruption to enable follow-up phenotypic analysis. To address this issue, we used three-dimensional (3-D) reconstruction of HFUS imaging data for early detection and characterization of murine embryo implantation sites and their individual developmental progression in utero. Combining HFUS imaging with 3-D reconstruction and modeling, we were able to accurately quantify embryo implantation site number as well as monitor developmental progression in pregnant C57BL6J/129S mice from 5.5 days post coitus (d.p.c.) through to 9.5 d.p.c. with the use of a transducer. Measurements included: number, location, and volume of implantation sites as well as inter-implantation site spacing; embryo viability was assessed by cardiac activity monitoring. In the immediate post-implantation period (5.5 to 8.5 d.p.c.), 3-D reconstruction of the gravid uterus in both mesh and solid overlay format enabled visual representation of the developing pregnancies within each uterine horn. As genetically engineered mice continue to be used to characterize female reproductive phenotypes derived from uterine dysfunction, this method offers a new approach to detect, quantify, and characterize early implantation events in vivo. This novel use of 3-D HFUS imaging demonstrates the ability to successfully detect, visualize, and characterize embryo-implantation sites during early murine pregnancy in a non-invasive manner. The technology offers a significant improvement over current methods, which rely on the interruption of pregnancies for gross tissue and histopathologic characterization. Here we use a video and text format to describe how to successfully perform ultrasounds of early murine pregnancy to generate reliable and reproducible data with reconstruction of the uterine form in mesh and solid 3-D images.

Mice are widely used to study gestational biology. However, pregnancy termination is required for such studies which precludes longitudinal investigations and necessitates the use of large numbers of animals. Therefore, we describe a non-invasive technique of high-frequency ultrasonography for early detection and monitoring of post-implantation events in the pregnant mouse.

Um novo uso da ultra-sonografia tridimensional de alta frequência para caracterização de gravidez precoce no Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

Cultura do tecido ovariano Visualizar fenômenos no ovário de Mouse

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ultrastructural parameters in unambiguously identified topographical structures, affected by a protein of interest that is introduced into the organism via viral transfer. This combined approach allows for a smooth transition from macrostructural to ultrastructural identification by following topographical navigation maps in a tissue atlas. High-resolution electron microscopy of the in-utero-transduced tissue reveals the fine ultrastructure of the neuropil and its plasticity parameters, such as cross-sectioned synaptic bouton areas, the number of synaptic vesicles and mitochondria within a bouton profile, the length of synaptic contacts, cross-sectioned axonal areas, the thickness of myelin sheaths, the number of myelin lamellae, and cross-sectioned areas of mitochondria profiles. The analysis of these parameters reveals essential insights into changes of ultrastructural plasticity in the areas of the nervous system that are affected by the viral transfer of the genetic construct. This combined method can not only be used for studying the direct effect of genetically engineered biomolecules and/or drugs on neuronal plasticity but also opens the possibility to study the in utero rescue of neuronal plasticity (e.g., in the context of neurodegenerative diseases).

The combination of transmission electron microscopy and in utero transduction is a powerful approach for studying morphological changes in the fine ultrastructure of the nervous system during development. This combined method allows deep insights into changes in structural details underlying neuroplasticity with respect to their topographical representation.

Avaliação dos parâmetros de neuroplasticidade ultraestrutural depois no Utero transdução da medula espinhal e cérebro de rato em desenvolvimento

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

Fundição Vascular de Pulmões de Camundongos Adultos e Precoces para Imagem Micro-CT

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that take place in the cytoplasm in preparation for fertilization and acquisition of totipotency. During oocyte maturation, changes in gene expression depend exclusively on the translation and degradation of maternal messenger RNAs (mRNAs) rather than on transcription. Execution of the translational program, therefore, plays a key role in establishing oocyte developmental competence to sustain embryo development. This paper is part of a focus on defining the program of maternal mRNA translation that takes place during meiotic maturation and at the oocyte-to-zygote transition. In this method paper, a strategy is presented to study the regulation of translation of target mRNAs during in vitro oocyte maturation. Here, a Ypet reporter is fused to the 3&#39; untranslated region (UTR) of the gene of interest and then micro-injected into oocytes together with polyadenylated mRNA encoding for mCherry to control for injected volume. By using time-lapse microscopy to measure reporter accumulation, translation rates are calculated at different transitions during oocyte meiotic maturation. Here, the protocols for oocyte isolation and injection, time-lapse recording, and data analysis have been described, using the Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3&#39; UTR reporter as an example.

This protocol describes a reporter assay to study the regulation of mRNA translation in single oocytes during in vitro maturation.

Definindo o Programa de Tradução materna mRNA durante a maturação in vitro usando um ensaio de repórter oócito único

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...