1. Configuração do Sistema <ol><li> F-7000 Espectrofotômetro de fluorescência equipado com alta fotomultiplicador faixa de sensibilidade ampliada R-928F detector. </li><li> F-7000 Acessórios: rodamina B, a luz do difusor, vermelho de filtro e sub-padrão fonte de luz foram utilizados para gerar os factores de correcção espectrais para o instrumento. </li><li> Quantum acessório Rendimento de medição, que inclui: 60 mm Integração esfera, telhas de óxido de alumínio branco, Spectralon branco padrão, células em pó (2ea), pó de alumínio Óxido de software e Quantum Rendimento. </li><li> Programa de relatório gerador eo modelo apropriado será utilizada para o cálculo das coordenadas de cromaticidade. </li></ol> 2. Configuração do Sistema <ol><li> Ligue o F-7000 Hitachi espectrofotómetro de fluorescência e permitir que a lâmpada de xénon de aquecer durante uma hora. Começar a usar o compartimento da amostra padrão (titular cuvete) instalado no instrumento. </li></ol> 3. Acquisition de Integração de Fatores de Correção Sphere Ao medir os fatores de correção Integração esfera, o software seleciona automaticamente os parâmetros de teste de medição listadas na Tabela 1. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Condições analíticas </td></tr><tr><td> Medição </td><td> Comprimento de onda de digitalização </td></tr><tr><td> O modo de digitalização </td><td> Síncrono </td></tr><tr><td> Modo de dados </td><td> Fluorescência </td></tr><tr><td> EM WL </td><td> 200 nm </td></tr><tr><td> EX Iniciar WL </td><td> 200 nm </td></tr><tr><td> WL End EX </td><td> 900 nm </td></tr><tr><td> Velocidade de digitalização </td><td> 240 nm / min </td></tr><tr><td> Atrasar </td><td> 5,0 s </td></tr><tr><td> Fenda EX </td><td> 5,0 nm </td></tr><tr><td> EM Slit </td><td> 20 nm </td></tr><tr><td> Tensão PMT </td><td> 250 V </td></tr><tr><td> Espectros corrigidos </td><td> ON </td></tr><tr><td> Resposta </td><td> Automático </td></tr></tbody></table> Tabela 1. 3,1. Aquisição de dados do difusor <ol><li> Coloque difusor no compartimento da amostra padrão e fechar o compartimento da amostra. </li><li> Clique sobre o Rendimento janela Quantum de Medição Fator de Correção e, em seguida, na medição do difusor. </li><li> Digite o nome do arquivo: &quot;IS_factor_F70_diffuser&quot; para os dados do difusor e clique em OK (vídeo 1). </li><li> Após a medição, o arquivo será salvo na pasta &quot;correta&quot; de Soluções FL. Figura 1 é um exemplo dos dados de medição do difusor. </li></ol> 3,2. Aquisição de fator de correção para nenhuma amostra (de referência) &lt;ol&gt; <li> Remova o compartimento da amostra padrão do instrumento, loja difusor, em seguida, instalar a esfera de integração. </li><li> Encher a célula em pó com o pó de óxido de alumínio até uma altura de pelo menos 25 mm a certificar-se o pó a cobrir completamente a porta da esfera de integração. Toque na parte inferior da célula cuidadosamente para compactar o pó. </li><li> Coloque o azulejo óxido de alumínio branco no porto de referência (P2) da esfera de integração (a um monocromador de frente para o emissão) e da célula em pó de óxido de alumínio no porto de amostra (P1) da esfera de integração (a um monocromador de frente para o excitação ). </li><li> Clique sobre o Rendimento janela Correção Medição Quantum Factor, em seguida, sobre a Integração Medição Sphere (sem amostra) (Vídeo 2). </li><li> O software irá lembrá-lo para definir as amostras. Digite o nome de &quot;É com nenhuma amostra&quot; e clique em OK. </li><li> Após a medição, o arquivo será salvo na pasta &quot;Correção<html> t &quot;das Soluções FL. A Figura 2 é um exemplo da esfera de integração sem dados de medição da amostra. </li></ol> 3,3. Aquisição de factor de correcção na presença de uma amostra: <ol><li> Remover a célula com pó de óxido de alumínio e substituí-la com o padrão branco Spectralon. (O padrão deve ser Spectralon de frente para o monocromador de excitação (P1)). </li><li> Clique sobre o Rendimento janela Correção Medição Quantum Factor e, em seguida, sobre a Integração Medição Sphere (com amostra). O software irá lembrá-lo para definir o material de Reflectância padrão para a medição. </li><li> Digite o nome: &quot;É com a amostra&quot; para a esfera de integração com arquivo de dados de exemplo e clique OK (Vídeo 3). </li><li> Após a medição, o arquivo será salvo na pasta &quot;correta&quot; de Soluções FL. Figura 3 é um exemplo da esfera de integração com dados de medição da amostra. </li></ol>&quot;&gt; NOTA: Em caso de necessidade de usar filtros de corte para bloquear a luz de dispersão de segunda ordem no lado de emissão que interferem com o pico de fluorescência, você terá que medir uma linha de base usando apenas o difusor e também o difusor eo filtro apropriado Estes. arquivos de dados serão utilizados pelo software para o cálculo de rendimento quântico. Na prática, nós recomendamos medir todos os filtros de corte, como parte da configuração inicial do sistema. 4. Medição da amostra (Pó O salicilato de sódio) Quantum a medição do rendimento envolve a aquisição de um espectro de emissão para ambos nenhuma amostra-(de referência) e na presença de uma amostra. Selecione os parâmetros analíticos de medida, como segue: <ol><li> Clique sobre o &quot;Método&quot; botão e, em geral varredura de comprimento de onda guia de seleção como o modo de medição e digite as informações apropriadas sobre o operador e acessórios(Vídeo 4). </li><li> Clique no botão &quot;Instrumento&quot; tab e digite os parâmetros de medição para o instrumento como mostrado na Tabela 2 (vídeo 5). </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Condições analíticas </td></tr><tr><td> Medição </td><td> Comprimento de onda de digitalização </td></tr><tr><td> O modo de digitalização </td><td> Emissão </td></tr><tr><td> Modo de dados </td><td> Fluorescência </td></tr><tr><td> EX WL </td><td> 350 nm </td></tr><tr><td> EM Iniciar WL </td><td> 330 nm </td></tr><tr><td> EM Fim WL </td><td> 600 nm </td></tr><tr><td> Velocidade de digitalização </td><td> 1200 nm / min </td></tr><tr><td> Atrasar </td><td> 0 s </td></tr><tr><td> Fenda EX </td><td> 5,0 nm </td></tr><tr><td> EM Slit </td><td> 5,0 nm </td></tr><tr><td> Tensão PMT </td><td> 350 V </td></tr><tr><td> Espectros corrigidos </td><td> ON </td></tr><tr><td> Resposta </td><td> Automático </td></tr><tr><td> Espectros corrigidos </td><td> ON </td></tr></tbody></table> Tabela 2. <ol start="3"><li> Não há configurações adicionais são necessárias neste momento já que as configurações da guia do Monitor de Processamento e Relatório pode ser feita após os dados terem sido medidos. Estamos indo só para revê-las e, em seguida, clique no botão OK, a fim de definir os parâmetros de medição selecionados no instrumento (Vídeo 6). </li><li> Como opção, as configurações selecionadas poderiam ser salvos para uso futuro. Vamos proceder agora medir o padrão de referência de alumínio Óxido usando excitação direta. </li><li> Coloque a célula em pó com Al2O3 pó no porto de medição da amostra (P1) (em frente do feixe de excitação). </li><li> Clique no botão &quot;Amostra&quot; botãoe digite o nome da amostra: &quot;P1_Baseline_Al2O3&quot;, em seguida, clique na caixa ao lado de &quot;arquivo Auto&quot;. Selecione a pasta eo nome do arquivo para os dados: &quot;P1_Baseline_Al2O3&quot;, em seguida, clique em &quot;Salvar&quot; e &quot;OK&quot; (vídeo 7). </li><li> Clique em &quot;Measure&quot; botão para medir a amostra Al2O3. (Video 8), depois que a janela de processamento de dados se abre, clique no &quot;Auto escala do eixo&quot; botão de ajuste da escala, para visualizar o pico de espalhamento com excitação direta (Figura 4). </li><li> Agora vamos proceder a medição da amostra de salicilato de sódio usando excitação direta. Clique no botão &quot;Amostra&quot; ícone e digite &quot;Salicilato P1_Sodium&quot; para o nome da amostra e arquivo, clique no botão OK (Video 9). </li><li> Coloque a amostra salicilato de sódio na célula em pó e na porta P1 da esfera de integração (a porta de frente para o feixe de luz de excitação) e clique em &quot;Measure&quot; botão. (Video 10) Quando o processo de dadosing janela se abre, clique no &quot;Auto escala do eixo&quot; para ajustar a escala e visualizar a dispersão e picos de fluorescência. </li><li> Neste momento, vamos repetir as medições para o óxido de alumínio e salicilato de sódio com as amostras colocadas no porto P2 da esfera de integração, a fim de ler os usando excitação indirecta. </li><li> Primeiro clique no &quot;Amostra&quot; botão e digite o nome da amostra e arquivo: &quot;P2_Baseline_Al2O3&quot; para ambos (Video 11). </li><li> Mova o azulejo óxido de alumínio branco a partir de P2 para P1 da esfera de integração e coloque um celular cheio de pó de óxido de alumínio no P2. </li><li> Clique em &quot;Measure&quot; botão para ler a amostra (Video 12). </li><li> Para completar a medição da amostra é preciso medir a amostra de salicilato de sódio utilizando irradiação indireta. Primeiro, digite o exemplo e nomes de arquivo como nas etapas anteriores. O nome será P2_Sodium salicilato (Vídeo 13). </li><li> Coloque a amostra de salicilato de sódio no porto P2 da esfera de integração e clique no botão Measure (Video 14). </li></ol> 5. Quantum Cálculo Rendimento Primeiro vamos continuar carregando os fatores de correção que integram esfera. <ol><li> Clique no botão Cálculo rendimento quântico para abrir o programa de cálculo de rendimento quântico (Video 15). </li><li> Clique no botão Correção Rendimento Ambiente Quantum Factor (vídeo 16). </li><li> Clique na guia Integração Sphere Correção e clique na caixa na frente de &quot;correção esfera Integração&quot;, em seguida, clique na guia filtros de correção e certifique-se o &quot;filtro de correção de&quot; caixa não estiver selecionada, clique novamente na guia Integração Sphere Correção (Video 17 ). </li><li> Clique no botão Load do Diffuse seção Dados de Medição, em seguida, selecione o arquivo &quot;IS_factor_F70 amostra não&quot; ( <strong&gt; Vídeo 18). </li><li> Selecione a opção &quot;IS_factor_F70_diffuser&quot; arquivo e clique no botão de carga (Video 19). </li><li> Clique no botão Load dos dados da medição Integração esfera (sem amostra) seção (Video 20). </li><li> Selecione a opção &quot;IS_factor_F70 nenhuma amostra&quot; do arquivo e clique no botão de carga (Video 21). </li><li> Clique no botão Load dos dados da medição Integração esfera (com amostra) seção (Video 22). </li><li> Selecione a opção &quot;IS_factor_F70 com a amostra de arquivo&quot; e em seguida, no botão de carga (Video 23). </li><li> Comprimento de onda normalizado pode ser deixada a 600 nm ou ajustada para o valor de comprimento de onda em que a correcção esfera de integração é igual a 1. Para fazer isso, verifique se a caixa na frente de &quot;Display janela cálculo rendimento quântico&quot; está selecionado e clique no botão OK do &quot;ajuste do fator de rendimento quântico&quot; window, que vai fechar esta janela (Video 24). </li><li> Agora clique em &quot;Integrar Sphere Correção de&quot; guia do &quot;rendimento quântico de Cálculo&quot; janela e ajustar o cursor até que a leitura correção Integração esfera é &quot;1&quot;, fazendo notar o comprimento de onda (Video 25). </li><li> Clique no &quot;rendimento quântico ajuste do fator de correção&quot; e, se necessária mudança no comprimento de onda normalizada para a leitura obtida na etapa anterior e clique no botão OK (Video 26). </li></ol> O próximo passo é carregar a linha de base e arquivos de dados de exemplo <ol start="13"><li> Clique no &quot;rendimento quântico de Cálculo&quot; guia (Video 27). </li><li> Carregar &quot;dados sem amostra&quot; (arquivo P1_Baseline_ Al2O3) para irradiação direta, clicando no botão de carga e de carga &quot;de dados com a amostra&quot; (salicilato de arquivo P1_Sodium) para irradiação direta (Video 28). </li><li&gt; Em seguida, vamos proceder para selecionar o &quot;espalhamento&quot; e &quot;fluorescência&quot; regiões (Vídeo 29). </li><li> Agora vamos calcular o rendimento quântico de irradiação direta da amostra. Clique no botão &quot;Cálculo&quot; botão e ler os resultados (Vídeo 30). Vamos precisar destes dados para o cálculo final do rendimento quântico para a amostra, tendo em consideração a excitação indireta. </li><li> Clique no arquivo de texto e salvar os dados sob o nome de arquivo &quot;Irradiação QY Direct&quot; (Vídeo 31). </li><li> Usando arquivos de dados P2_Baseline_Al2O3 e salicilato P2_Sodium, vamos calcular o rendimento quântico para excitação indireta (Video 32) Agora vamos salvar esses dados para o cálculo final rendimento quântico. </li><li> Clique no arquivo texto e salve o arquivo de texto de dados com o nome de &quot;irradiação QY indireta&quot; (Vídeo 33) Agora vamos abrir os dois arquivos de texto em Excel com os dados de rendimento quântico para a direçãot e excitação indireta. Finalmente, vai calcular o rendimento quântico para a amostra, incluindo o efeito de Excitação indirecta, utilizando a seguinte fórmula: </li></ol> Φ = Φd-(1-Ad) ΦI Onde: Φ é o rendimento quântico corrigida levando em consideração a excitação indireta Φd é o rendimento quântico Interna usando excitação direta. (Internal rendimento quântico = Quantidade de Fluorescência / Quantidade de luz de excitação absorvida.) Anúncio é a absortância para excitação direta. (Esta é a razão entre a quantidade de feixe de excitação absorvida pela amostra). (Absorvância = (Arex - CsEx) / Arex, onde Arex é a quantidade de luz de excitação e CsEx é a quantidade de luz reflectida) ΦI é o rendimento quântico Interna usando IndiExcitação rect Φ = 0,536 - (1 - 0,848) 0,420 Calculado Φ = 0,47216 6. Cálculo da cromaticidade <ol><li> Nós usaremos o gerador de relatório opcional software, juntamente com um modelo de preparado para o cálculo da cromaticidade. </li><li> Abra o arquivo de dados salicilato P1_Sodium (Video 34). </li><li> Clique no botão &quot;Propriedades&quot;, então o &quot;guia&quot; Relatório. Em &quot;Output&quot; &quot;folha de usar gerador de impressão&quot;, selecione no menu suspenso. Em &quot;itens de impressão&quot; template select &quot;FL70Std01_Color-chart.xls&quot; e clique no botão &quot;Abrir&quot;. Não há necessidade de selecionar a faixa de comprimento de onda e intervalo, uma vez que este é feito automaticamente pelo Report Generator (Video 35). </li><li> O passo seguinte é o de criar o relatório. Clique no botão &quot;Report&quot; guia ea macro para criar o relatório será executado e salvo em &quot;Relatórios&quot; pasta em formato Excel com o nome de amostra (Video 36). &lt;<html> / Li&gt; <li> Neste momento, podemos abrir o relatório para ver os dados de cor (Vídeo 37). </li></ol> 7. Segredos para o Sucesso <ol><li> Use amostras frescas. </li><li> Esteja ciente de que o material de diferentes fabricantes podem dar resultados diferentes. </li><li> Toque na parte inferior da célula em pó para compactar a amostra e apresentar uma superfície uniforme para a medição. </li><li> Proteger as amostras da luz. Eles se deterioram com a exposição à luz. </li><li> Tente usar uma velocidade mais rápida varredura para minimizar a exposição da amostra à luz. </li></ol> 8. Os resultados representativos 8,1. O salicilato de sódio é conhecido por ter um rendimento quântico de 0,4 a 0,5 <img src="/files/ftp_upload/3066/3066fig1.jpg" alt="A Figura 1" /> Figura 1. <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/3066/3066fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . iles/ftp_upload/3066/3066fig2.jpg &quot;alt =&quot; Figura 1 &quot;/&gt; Figura 2. <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/3066/3066fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/3066/3066fig3.jpg" alt="A Figura 1" /> Figura 3. <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/3066/3066fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quantum Yield Measurement of Sodium Salicylate. FL080002, 1 (2008).</li><li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy.">Principles of Fluorescence Spectroscopy.</a> Science and Business Media, LLC. 60, (2006).</li><li>Horigome, J., Wakui, T., Shirasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Correction+Method+for+Determination+of+Absolute+Fluorescence+Quantum+Yields+of+Solid+Samples+with+a+conventional+Fluorescence+Spectrophotometer.">A Simple Correction Method for Determination of Absolute Fluorescence Quantum Yields of Solid Samples with a conventional Fluorescence Spectrophotometer.</a> Bunseki Kagako. 58 (6), 553-559 (2009).</li></ol>

Luis A. Moreno é empregado por Hitachi High Technologies America, que produz o instrumento utilizado neste artigo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> O salicilato de sódio em pó </td><td> Wako </td><td> 191-03142 </td><td> Mol. peso 160,10 </td></tr></tbody></table>

absolute quantum yield measurement of powder samples

Medição do rendimento quântico de fluorescência se tornou uma ferramenta importante na busca de novas soluções no controle de desenvolvimento, qualidade, avaliação e pesquisa da iluminação, AV equipamentos, material orgânico EL, filmes, filtros e sondas fluorescentes para a indústria de bio-. Rendimento quântico é calculado como a razão entre o número de fotões absorvidos, para o número de fotões emitidos por um material. O rendimento mais elevado do quantum, melhor a eficiência do material fluorescente. Para que as medidas apresentadas neste vídeo, iremos usar o Hitachi F-7000 espectrofotômetro de fluorescência equipado com o rendimento quântico de medição acessório e Relatório programa gerador. Toda a informação fornecida aplica-se a este sistema. Medição do rendimento quântico em amostras de pó é realizada seguindo estes passos: <ol><li> Geração de fatores de correção de instrumentos para a excitação e emissmonocromadores de íons. Este é um requisito importante para a medição correta do rendimento quântico. Tem sido realizado em avanço para o intervalo de medição total do instrumento e não será mostrado neste vídeo devido a limitações de tempo. </li><li> Medição de integrar fatores de correção esfera. O propósito deste passo é de levar em consideração características de reflectividade da esfera de integração utilizado para as medições. </li><li> Referência e medição da amostra usando excitação direta e indireta de excitação. </li><li> Quantum cálculo de rendimento utilizando excitação direta e indireta. Excitação directa é quando a amostra é de frente para directamente feixe de excitação, o que seria a configuração normal de medição. No entanto, porque usamos uma esfera de integração, uma parte dos fótons emitidos resultantes da fluorescência da amostra são refletidos pela esfera de integração e re-excitar a amostra, por isso precisamos levar em consideração a excitação indireta. Esta é a acomodaçãomplished através da medição da amostra colocada no porto de frente para o monocromador de emissão, calculando rendimento quântico indirecta e corrigindo o cálculo directo rendimento quântico. </li><li> Corrigido cálculo de rendimento quântico. </li><li> Cromaticidade coordena o cálculo usando o programa Gerador de Relatórios. </li></ol> Os Hitachi F-7000 rendimento quântico de medição oferecem vantagens do sistema para esta aplicação, como segue: <ul><li> Alta sensibilidade (S / N 800 ou RMS melhores). Sinal é a banda de Raman de água medido nas condições seguintes: comprimento de onda Ex 350 nm, Ex passa-banda e EM 5 nm, resposta 2 seg), o ruído é medido no máximo do pico Raman. Alta sensibilidade permite a medição de amostras, mesmo com baixo rendimento quântico. Usando este sistema, medimos rendimentos quânticos tão baixas como 0,1 para uma amostra de ácido salicílico e tão elevada como 0,8 para uma amostra de tungstato de magnésio. </li><li> Medição de alta precisão com uma gama dinâmica de 6 ordens demagnitude permite medições de ambos os picos de espalhamento afiadas de intensidade elevada, bem como grandes picos de fluorescência de baixa intensidade, nas mesmas condições. </li><li> Rendimento de medição de alta e exposição à luz reduzida para a amostra, devido a uma alta velocidade de digitalização de até 60.000 nm / minuto e função de obturador automático. </li><li> Medição do rendimento quântico em uma faixa de comprimento de onda larga de 240 para 800 nm. </li><li> Medições precisas de rendimento quântico são o resultado de recolha de resposta do instrumento espectral e integrando factores de correcção esfera antes da medição da amostra. </li><li> Grande selecção de parâmetros calculados fornecidos pelo software dedicado e fácil de usar. </li></ul> Durante este vídeo mediremos salicilato de sódio na forma de pó, que é conhecido por ter um valor de rendimento quântico de 0,4 a 0,5.

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Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Neste vídeo vamos demonstrar medir e calcular o rendimento quântico absoluto e cromaticidade coordenadas diretamente em amostras de pó que utilizam o Hitachi F-7000 Quantum Sistema de Medição de Rendimento.

Medição Rendimento Absoluto Quantum of amostras de pó

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

absolute-quantum-yield-measurement-of-powder-samples

Research

JoVE Journal

Biology

27.8K visualizações.  Hitachi High Technologies America. Neste vídeo vamos demonstrar medir e calcular o rendimento quântico absoluto e cromaticidade coordenadas diretamente em amostras de pó que utilizam o Hitachi F-7000 Quantum Sistema de Medição de Rendimento.

Vídeo: Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Large Volume (20L+) Filtration of Coastal Seawater Samples

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For this method, samples were collected from the deck of the HMS John Strickland operating in Saanich Inlet. This video documents large volume (&ge;20 L) filtration of microbial biomass, ranging between 0.22&mu;m and 2.7&mu;m in diameter, from the water column. Two 20L samples can be filtered simultaneously using a single pump unit equipped with four rotating heads. Filtration is done in the field on extended trips, or immediately upon return for day trips. It is important to record the amount of water passing through each sterivex filter unit. To prevent biofilm formation between sampling trips, all filtration equipment must be rinsed with dilute HCl and deionized water and autoclaved immediately after use. This procedure will take approximately 5 hours plus an additional hour for clean up.

Large Volume 20L+ Filtration of Coastal Seawater Samples

This video documents large volume (&ge;20 L) filtration of microbial biomass, ranging between 0.22&mu;m and 2.7&mu;m in diameter, from the water column.

Volume grande (20L +) Filtração das amostras Seawater Coastal

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For this method, ...

Biologia

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &amp;#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

Quantificação de γH2AX Focos em amostras de tecido

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1. Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since they do not react with colorimetric reagents2,3. Enzymatic hydrolysis (EH) is an emerging method for accurately characterizing organic P forms in environmental samples4,5. This method is only trumped in accuracy by Phosphorus-31 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (31P-NMR) -a method that is expensive and requires specialized technical training6. We have adapted an enzymatic hydrolysis method capable of measuring three classes of phosphorus (monoester P, diester P and inorganic P) to a microplate reader system7. This method provides researchers with a fast, accurate, affordable and user-friendly means to measure P species in soils, sediments, manures and, if concentrated, aquatic samples. This is the only high-throughput method for measuring the forms and enzyme-lability of organic P that can be performed in a standard laboratory. The resulting data provides insight to scientists studying system nutrient content and eutrophication potential.

This protocol describes a high-throughput method of enzymatic hydrolysis that utilizes a microplate reader to measure and classify soil phosphorus as P monoesters, P diesters and inorganic P. Up to 96 samples can be measured at one time in a standard laboratory.

High-Throughput medição e classificação de P orgânico em amostras ambientais

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to infection. A common method to measure chemotaxis is the Boyden chamber assay, in which cells and chemoattractant are separated by a porous membrane. As cells migrate through the membrane toward the chemoattractant, they adhere to the underside of the membrane, or fall into the underlying media, and are subsequently stained and visually counted 1. In this method, cells are exposed to a steep and transient chemoattractant gradient, which is thought to be a poor representation of gradients found in tissues 2.
Another assay system, the under-agarose chemotaxis assay, 3, 4 measures cell movement across a solid substrate in a thin aqueous film that forms under the agarose layer. The gradient that develops in the agarose is shallow and is thought to be an appropriate representation of naturally occurring gradients. Chemotaxis can be evaluated by microscopic imaging of the distance traveled. Both the Boyden chamber assay and the under-agarose assay are usually configured as endpoint assays.
The automated ECIS/Taxis system combines the under-agarose approach with Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) 5, 6. In this assay, target electrodes are located in each of 8 chambers. A large counter-electrode runs through each of the 8 chambers (Figure 2). Each chamber is filled with agarose and two small wells are the cut in the agarose on either side of the target electrode. One well is filled with the test cell population, while the other holds the sources of diffusing chemoattractant (Figure 3). Current passed through the system can be used to determine the change in resistance that occurs as cells pass over the target electrode. Cells on the target electrode increase the resistance of the system 6. In addition, rapid fluctuations in the resistance represent changes in the interactions of cells with the electrode surface and are indicative of ongoing cellular shape changes. The ECIS/Taxis system can measure movement of the cell population in real-time over extended periods of time, but is also sensitive enough to detect the arrival of a single cell at the target electrode. 
Dictyostelium discoidium is known to migrate in the presence of a folate gradient 7, 8 and its chemotactic response can be accurately measured by ECIS/Taxis 9. Leukocyte chemotaxis, in response to SDF1&alpha; and to chemotaxis antagonists has also been measured with ECIS/Taxis 10, 11. An example of the leukocyte response to SDF1&alpha; is shown in Figure 1.

The ECIS/Taxis system is an automated, real-time assay that measures cellular chemotaxis. In this assay, cells move beneath a layer of agarose to arrive at a target electrode. Cellular movement is measured by the onset of resistance to AC current 0.

Medição de Quimiotaxia celulares com ECIS / Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Medição do Tempo de vida em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

A High Yield and Cost-efficient Expression System of Human Granzymes in Mammalian Cells

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their cytotoxic granule content to eliminate the target cells and the intracellular pathogen. Death of the host cells and intracellular pathogens is triggered by the granule serine proteases, granzymes (Gzms), delivered into the host cell cytosol by the pore forming protein perforin (PFN) and into bacterial pathogens by the prokaryotic membrane disrupting protein granulysin (GNLY). To investigate the molecular mechanisms of target cell death mediated by the Gzms in experimental in-vitro settings, protein expression and purification systems that produce high amounts of active enzymes are necessary. Mammalian secreted protein expression systems imply the potential to produce correctly folded, fully functional protein that bears posttranslational modification, such as glycosylation. Therefore, we used a cost-efficient calcium precipitation method for transient transfection of HEK293T cells with human Gzms cloned into the expression plasmid pHLsec. Gzm purification from the culture supernatant was achieved by immobilized nickel affinity chromatography using the C-terminal polyhistidine tag provided by the vector. The insertion of an enterokinase site at the N-terminus of the protein allowed the generation of active protease that was finally purified by cation exchange chromatography. The system was tested by producing high levels of cytotoxic human Gzm A, B and M and should be capable to produce virtually every enzyme in the human body in high yields.

We describe here a cost-efficient granzyme expression system using HEK293T cells that produces high yields of pure, fully glycosylated and enzymatically active protease.

A High Yield e custo-eficiente sistema de expressão de Granzimas Humanos em células de mamíferos

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Reação selecionada Monitoramento Espectrometria de Massa para Absolute Quantificação de Proteína

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

High Yield Expressão de proteínas recombinantes humanas com o Transient transfecção de células HEK293 em suspensão

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This approach is appropriate for examining physiological changes in target gene expression levels. However, absolute quantification using better statistical analysis is preferable for a comprehensive assessment of gene expression levels. Absolute quantification is still not in common use. This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using RT-qPCR with or without pre-amplification.
A fixed volume (200 &#181;L) of EDTA-plasma was prepared from the blood collected from the femoral vein of conscious cynomolgus monkeys (n = 50). Total RNA was extracted using commercially available system. Plasma miRNAs were quantified by probe-based RT-qPCR assays which contains miRNA-specific forward/reverse PCR primer and probe. Standard curves for absolute quantification were generated using commercially available synthetic RNA oligonucleotides. A synthetic cel-miR-238 was used as an external control for normalization and quality assessment. The miRNAs that showed quantification cycle (Cq) values above 35 were pre-amplified prior to the qPCR step.
Among the 8 miRNAs examined, miR-122, miR-133a, and miR-192 were detectable without pre-amplification, whereas miR-1, miR-206, and miR-499a required pre-amplification because of their low expression levels. MiR-208a and miR-208b were not detectable even after pre-amplification. Sample processing efficiency was evaluated by the Cq values of the spiked cel-miR-238. In this assay method, technical variation was estimated to be less than 3-fold and the lower limit of quantification (LLOQ) was 102 copy/&#181;L, for most of the examined miRNAs.
This protocol provides a better estimate of the quantity of plasma miRNAs, and allows quality assessment of corresponding data from different studies. Considering the low number of miRNAs in body fluids, pre-amplification is useful to enhance detection of poorly expressed miRNAs.

This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using quantitative real-time reverse transcription PCR with or without pre-amplification. This protocol affords better understanding of the quantity of plasma miRNAs and allows qualitative assessment of corresponding data from different studies or laboratories.

Quantificação absoluta dos níveis plasmáticos de MicroRNA em macacos Cynomolgus, usando o quantitativo em tempo real a transcrição reversa PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, implantation of transgenic cells and tiny optical sensors. However, intravenous microinjections into small animals, which are mostly used in biological and veterinary laboratories, are very difficult and require trained personnel. Herein, we demonstrate a robust and efficient method for the introduction of microparticles into the circulatory system of adult zebrafish (Danio rerio) by injection into the fish kidney. To visualize the introduced microparticles in the vasculature, we propose a simple intravital imaging technique in fish gills. In vivo monitoring of the zebrafish blood pH was accomplished using an injected microencapsulated fluorescent probe, SNARF-1, to demonstrate one of the possible applications of the described technique. This article provides a detailed description of the encapsulation of pH-sensitive dye and demonstrates the principles of the quick injection and visualization of the obtained microcapsules for in vivo recording of the fluorescent signal. The proposed method of injection is characterized by a low mortality rate (0-20%) and high efficiency (70-90% success), and it is easy to institute using commonly available equipment. All described procedures can be performed on other small fish species, such as guppies and medaka.

This article demonstrates the principles of a quick, minimally invasive injection of fluorescent microparticles into the circulatory system of small fishes and the in vivo visualization of the microparticles in fish blood.

Administração simples e eficaz e visualização de micropartículas no sistema circulatório de peixes pequenos usando injeção de rim

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...