Este trabalho foi apoiado pelo projeto VENOMICS, Europeu N ° 278346 subvenção de projecto através do Sétimo Programa-Quadro (FP7 SAÚDE 2011-2015). O projeto VENOMICS é uma colaboração entre várias instituições de pesquisa e empresas na Europa: AFMB, Aix-Marseille Université (França), CEA Saclay (França), NZYTech (Portugal), SistemasGenomicos (Espanha), Universidade de Liege (Bélgica), VenomeTech (França), Vitamib (França), Zealand Pharma (Dinamarca) Este trabalho foi apoiado pela infra-estrutura francês de Biologia Estrutural Integrado (Frisbi) ANR-10-InSb-05-01. Os autores também gostariam de agradecer ao Sr. Jeremy Turchetto para ajudar com os preparativos para a filmagem do vídeo.

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Não existe um protocolo universal único para a expressão de dobradas, as proteínas solúveis, funcionais. Para ser eficiente em termos de custos e de tempo, a maioria dos laboratórios ou instalações de centrais de proteínas que trabalham com múltiplos alvos, portanto, usar a expressão da proteína de alta throughput screening para encontrar a melhor combinação &quot;genérico&quot; de variáveis ​​para se obter uma proteína solúvel ativo para a maioria dos alvos. Identificámos DsbC como sendo um parceiro de fusão de aplicação geral para a expressão solúvel de péptidos e proteínas 11 rico em dissulfureto. Utilizando fusões DsbC e métodos de elevada capacidade, dentro de uma semana a expressão solúvel de alvos múltiplos pode ser observado 11 e, em seguida, as variáveis ​​adicionais, tais como os discutidos na introdução, pode ser rastreada em ciclos subsequentes sobre os alvos que requerem uma maior optimização. Os protocolos aqui descritos destinam-se a expressão de proteínas e péptidos ricos em disulfureto. No entanto, para os usuários que desejam expas proteínas não-reticuladas ress em uma forma de alto rendimento, os protocolos correspondentes têm sido publicados anteriormente e pode ser encontrado em outros lugares 22,24. A instalação de alto rendimento é ideal para um número de aplicações, incluindo o rastreio de um grande número de proteínas diferentes para a expressão solúvel em água ou o rastreio de um grande número de construções de expressão (incluindo as etiquetas de fusão diferentes) para os vários genes-alvo, ao mesmo tempo ( ou expressão múltipla constrói para um único alvo), a fim de melhorar as taxas de sucesso. A plataforma também pode ser utilizada para avaliação dos desempenhos e validação de novos protocolos de um grande número de alvos. Outras aplicações incluem o rastreio de variantes de um único alvo difícil, por exemplo, todos os ortólogos ou membros da mesma família, ou para testar o sucesso da produção de um painel de mutantes de um único alvo no um experimento. Este protocolo tem também sido utilizado em combinação com a co-expressão de vectores (with uma proteína marcado apenas) para permitir que o empuxo para baixo e caracterização preliminar dos complexos proteína-proteína, seguido de análise biofísica mais minuciosa para confirmar a formação do complexo de estequiometria correcta e 33. A quantidade de proteína purificada é por vezes adequado para micro-ensaios (ensaios funcionais, proteína-ADN 34 ou ensaios de interacção proteína-proteína). Existem várias vantagens para a estratégia de expressão rastreio de alto rendimento: (i) a capacidade para testar um grande número de alvos, ou um grande número de variáveis ​​em uma única experiência, (ii) limitada de variação de lote para lote, (iii) o simplicidade e facilidade de trabalhar em uma escala menor usando poços profundos, (iv) a escalabilidade e reprodutibilidade em maior escala, (v) o potencial de automação, e (vi) a simplicidade de controle e manipulação (sem rotulagem de tubos individuais, menos os erros introduzidos quando se utiliza o formato de placa que com o tratamento de tubos individuais na mistura ou troca dos clones). <pclasse = &quot;jove_content&quot;&gt; Embora não discutidos na secção de protocolo, há várias considerações importantes para a preparação do ensaio, que serão discutidas brevemente abaixo. Para uma discussão mais completa, por favor ver a publicação anterior 24. Para uma eficiência máxima, é vantajoso ter um sistema adequado para a clonagem de alto rendimento, para simplificar a sub-clonagem de um grande número de alvos. Para a fase inicial do projecto VENOMICS, que utilizam o sistema de recombinação versátil gateway 25, que permite a subclonagem em qualquer vector de destino a um ritmo de centenas de clones por semana. Protocolos para gateway recombinação clonagem podem ser encontradas no site da Invitrogen. Outras alternativas para alto rendimento clonagem incluem independente de ligadura de clonagem (LIC) 35,36 e sem restrição (RF) clonagem 37. Existem várias maneiras de obter os genes-alvo para a expressão, inclusive por PCR a partir de DNA modelo, a partir de coleções de clones de entrada ou comogenes sintéticos, o que é a estratégia escolhida para o projeto VENOMICS. Os genes sintéticos podem ser ordenados com locais de recombinação em cada extremidade da síntese do gene e gene permite a optimização de codões fácil da sequência do gene alvo (a excluir codões raros E. coli). Isto é recomendado, mas não essencial. Para objectivos de optimização sem codão que contêm um elevado número de codões raros, 2 Rosetta (DE3) pLysS (o qual transporta para tRNAs raros codões que não são altamente expressas em E. coli) pode ser mais adequada do que se BL21 (DE3) pLysS. Embora existam disponíveis estirpes que limitar a redução de pontes dissulfeto no ambiente redutor normalmente do citoplasma, nas nossas mãos, não foram tão bem sucedidos como E. regulares coli 11. A purificação por afinidade escala analítica é realizada a partir das culturas de expressão de teste, a fim de recuperar as proteínas de fusão solúveis e quantificar os rendimentos. Os dados quantitativos podem ser obtidas no the rendimentos solúveis de proteínas de fusão expressas dentro de uma gama de 0,1 - 100 mg / L de cultura. Se um alvo não é solúvel, expressão e indução temperaturas, estirpes ou mídia alternativa podem ser testados antes de diferentes parceiros de fusão são perseguidos. Para a expressão solúvel de proteínas ricas em dissulfeto, que anteriormente classificou o efeito de parceiros de fusão como DsbC&gt; DsbA&gt; GST&gt; MBP&gt; TRX&gt; HIS-tag para a expressão citoplasmática 11. Expressão periplasmática é uma outra possibilidade que pode ajudar a dobragem de sucesso de alvos ricos em disulfureto. O periplasma é um ambiente menos do que a redução do citoplasma e contém chaperonas redox úteis para auxiliar a ligação dissulfureto. DsbC, DsbA, e MBP proteínas estão normalmente localizados para o periplasma por suas sequências de sinal periplásmicas. Isto proporciona a oportunidade para tirar partido destas marcas para dirigir os alvos ricos em disulfureto para o espaço periplasmático, a fim de auxiliar dobrável. Para alvos difíceis, o próximo passo seria a de purify o insolúvel alvo HIS-marcado a partir de corpos de inclusão, solubilizar e redobre (isso está fora do âmbito deste protocolo e não será discutido aqui 3 9). Isso pode ser bastante simples para alvos com apenas uma ou duas pontes dissulfeto, mas se torna cada vez mais difícil, pois o número de pontes dissulfeto aumenta. Em alternativa, e em especial para as proteínas e péptidos com quatro ou mais ligações dissulfureto, pode ser benéfico para tentar sistemas de produção mais complexos, tais como leveduras, de insectos ou de expressão de mamífero. Com os avanços na miniaturização e automação, HTP eletrofisiologia lab-on-a-chip tecnologias 28 será sem dúvida o caminho do futuro para análises funcionais. Prevemos que, para a maioria dos fins (talvez com a exceção de estudos estruturais) isso vai negar a necessidade de culturas em grande escala. Culturas em pequena escala, não só será útil para o rastreio de condições de expressão, mas também de ser capaz de fornecer sufciente quantidades de amostra para estes ensaios funcionais miniaturizados. A capacidade de produzir vários alvos em paralelo, em quantidades suficientes para a caracterização funcional irá reduzir os custos de cultura e utilizar este tipo de plataformas, expressão e caracterização de proteínas recombinantes irão tornar-se mais o custo e tempo eficaz. Os protocolos aqui foram aplicadas para a expressão de péptidos e proteínas ricas em dissulfureto na fase inicial do projecto europeu FP7 VENOMICS. Venenos são uma excelente fonte de peptídeos bioativos que muitas vezes têm potencial farmacológico interessante. No entanto, a sua produção é um desafio devido a seus padrões de dissulfeto por entrelaçamento complexos e tamanho pequeno. Usando plataformas de alto rendimento, como o aqui descrito, o projecto VENOMICS pretende gerar uma biblioteca de 10.000 novos peptídeos do veneno de reproduzir a diversidade observada na natureza. Esta biblioteca vai ser explorada para a caracterização de dissulfureto-rpeptídeos ich com potencial farmacológico ou aplicações terapêuticas com o objetivo de desenvolver novos medicamentos. A plataforma está sendo usada para aferir e validar novos protocolos para uso no projeto VENOMICS.

Motivados pelo avanço da genômica e ritmo acelerado de descoberta de novas proteínas, dutos de alto rendimento têm sido desenvolvidas para paralelizar as abordagens tradicionais para a triagem e identificação de estratégias de produção de proteína ideal. Variáveis ​​potenciais que ser optimizados incluem, mas não estão limitadas a, estirpes de expressão que varia de 1,2, 3,4 temperatura, meios de 2,3, 5-alvo variantes, 6-13, parceiros de fusão de co-expressão com o acompanhante 14,15, citoplasmática ou periplasmáticas expressão 16-18, e tampão de purificação de componentes 3. Com a implementação de abordagens de alto rendimento, muitas variáveis ​​ou muitos alvos podem ser testadas em paralelo com um alto nível de eficiência, enquanto limita a variação de lote para lote. Em nossa experiência, a estratégia também dá uma boa reprodutibilidade após scale-up usando a mesma cultura (temperatura, meios de comunicação, aeração, etc) e as condições de purificação (mesmo resin, tampões, etc). Várias plataformas de alto rendimento tem sido utilizado na última década para identificar as condições para a expressão de proteínas solúveis, isto é, através de parâmetros variáveis, tais como parceiros de fusão, as estirpes de expressão ou a temperatura 19-23. Recentemente utilizado nossa abordagem de triagem de alto rendimento para a expressão de proteínas ricas em dissulfureto solúveis 11. As proteínas foram selecionados não só a partir de fontes venenosas, mas também incluiu inibidores da enzima rica em dissulfeto de uma grande variedade de espécies, incluindo plantas, porcos, vacas e seres humanos. O ensaio comparou os efeitos de 12 parceiros de fusão diferentes e três estirpes diferentes de expressão em que a solubilidade e dobragem de 28 proteínas reticuladas por dissulfureto. Nós demonstramos que o uso DsbC como um parceiro de fusão para a produção no BL21 (DE3) pLysS vastamente outproduced (tanto em rendimento e número de proteínas solúveis obtidos) qualquer outra combinação de tensão e fusão testadas 11. Oresultados desta experiência formou a base para a adaptação a tubagem originais geral de alto rendimento (que foi utilizado para o rastreio de uma grande variedade de proteínas de expressão) 22,24 para um mais adequado para a expressão de alvos ricos em disulfureto. Proteínas ricas em dissulfureto de venenos de animais, são de particular interesse. Venenos são uma mistura complexa de peptídeos e proteínas bioativas, com valor potencial farmacologicamente e terapeuticamente. No entanto, a expressão de proteínas dissulfureto contendo ligação não é trivial. Estas proteínas contêm geralmente entre 1-7 ligações dissulfureto, e deve ser oxidado com os padrões de ligação dissulfureto-correcção, a fim de ser activo. Atualmente, a plataforma está sendo usado para o rastreio a expressão de um grande número de proteínas do veneno de animais ricos em dissulfeto, como parte do Projeto VENOMICS europeu FP7 (www.venomics.eu) e aferição de novos protocolos para a expressão de alta taxa de transferência de milhares de alvos . Aqui, um método automatizadoé fornecido para a produção elevada de pequena escala de triagem expressão e purificação (ver Figura 1) aplicado a proteínas do veneno de animais dissulfureto-rico. A estratégia para o dissulfureto péptidos e proteínas ricas utiliza uma cauda de His para purificação e o parceiro de fusão redox-activo, DsbC, criando cliváveis ​​fusões HIS-DSBC para as proteínas-alvo (ver Figura 2). Embora o foco dos protocolos aqui é automatização usando um manuseamento electroforese robô e HTP líquido, estes métodos são também adequados para uma abordagem manual de alto rendimento, o que significa que mesmo os laboratórios com uma configuração básica podem tirar vantagem dos protocolos sem qualquer pré-requisito para o equipamento caro . Protocolos manuais para a transformação para a purificação e análise (não específica a proteínas ricas em dissulfeto) ter sido publicado anteriormente 24 e não será repetida aqui. A taxa de transferência do procedimento manual (do clone de expressão, produzidos por recombinaçãoclonagem nacional 25, para análise de níveis de proteína solúvel) é de 96 (utilizando a detecção de SDS-PAGE) ou de 384 (4 x 96, utilizando dot blot e SDS-PAGE 26) culturas por semana (ver Figura 1). Este pode ser aumentado se for realizado de forma semi-automatizada (utilizando um robot de manuseamento de líquidos e dot blot 26 ou electroforese HTP, tal como com um sistema Caliper GXII LabChip 22 para análise de resultados) a até 1152 (12 x 96) culturas em paralelo mais de uma semana, tal como aqui descritos. A cultura é realizada em poço profundo 24 format (DW24) para que as incubadoras agitação regulares pode ser usado em contraste com as culturas cultivadas no poço profundo 96 format (DW96), que exigem o uso de incubadoras orbitais curtos agitação de alta velocidade para arejamento suficiente (agitação a 800 rpm). O uso de meios de auto-indução 27 também simplifica a expressão, eliminando a etapa de indução manual. Mesmo onde os laboratórios já usam expressão e puri pré-definidoficação condições, estes podem ser transferidos directamente para o sistema HTP simplesmente para melhorar a eficiência. Um esquema detalhado da alta gasoduto throughput screening para proteínas ricas em dissulfeto é fornecido na Figura 3. Os parâmetros no pipeline foram selecionados com base em extensas experiências de rastreio 11, 22, o que nos permitiu escolher as condições mais úteis para a produção de proteínas. Caracterização pode ser realizada sobre as proteínas marcadas são purificadas directamente a partir de expressões de pequena escala em estudos-piloto onde dezenas de microgramas de amostra é suficiente, ou para ensaios funcionais sensíveis e ensaios de ligação (por exemplo, sistemas de baixo volume do patch HTP braçadeira 28). O mesmo pode ainda ser realizada sobre os alvos não marcados depois da clivagem, desde que a etiqueta e a protease são removidos (por exemplo, por HPLC de fase inversa). O controle de qualidade pode também ser realizada por espectrometria de massa (para confirmar o tamanho esperado e oxidação rcomi) ou métodos cromatográficos (para confirmar a pureza ou a heterogeneidade) 29. Às vezes, marcar a clivagem é desnecessário ou até mesmo indesejável (particularmente para as proteínas pouco solúveis 30,31), por isso, esta clivagem protocolo é opcional. Independentemente disso, em todas as construções existe um sítio de clivagem de protease de TEV (ENLYFQ / [L] 32) precedendo directamente o gene alvo para a produção de proteína nativa após clivagem (ver Figura 2 e Discussão). Se a clivagem da marca de fusão é desejada, a clivagem pode ser testado (na fracção de eluição ou &#39;na coluna&#39;) em pequena escala para analisar a eficiência, a optimização das condições exigidas e, se obter estimativas fiáveis ​​de rendimentos para experiências subsequentes de aumento de escala. Há duas opções para o volume de esferas utilizadas durante a purificação por afinidade, de acordo com os objectivos e as expectativas do experimento. Para ser capaz de captar tanta proteína quanto possível (para purificar por ensaios-piloto ou MS, ou para extrapolComemos por rendimentos de aumento de escala) num volume final de 200 ul de resina deve ser utilizado, permitindo a detecção de proteína solúvel no intervalo de 1-100 mg / L de cultura antes da saturação do sistema (ver protocolo (A) no ponto 8.1) . No entanto, se o objectivo da experiência é a detecção de pequenas quantidades de proteínas solúveis, em seguida, num volume final de 50 ul de resina é adequada, permitindo a detecção de proteína solúvel no intervalo de 0,1-25 mg / l de cultura (ver protocolo (B ) na Seção 8.2). A produção pode ser aumentado, se necessário, para obter quantidades de miligrama de alvos purificadas para estudos estruturais e funcionais, utilizando as condições estabelecidas para a expressão solúvel. Os detalhes de protocolos de scale-up usados ​​no AFMB foram discutidas em outros lugares 22,24. Mais detalhes relevantes para a configuração experimental, etapas críticas no âmbito do protocolo, modificações e resolução de problemas e limitações da técnica são fornecidos no discoussion. Por favor, leia a discussão antes de iniciar os experimentos. Durante os protocolos que esperar uma taxa de sucesso de 90% em cada passo (por exemplo, pelo menos 90% das culturas devem crescer em qualquer etapa). Se a taxa de sucesso de qualquer passo na experiência cai abaixo de 90%, as amostras são descartados e a experiência é repetida para a recolha completa de construções. No entanto, esta taxa de sucesso não é aplicável ao número de construções que expressam proteínas solúveis ou como a percentagem de construções que clivam com uma eficiência de 100%, como este será altamente dependente das proteínas ensaiadas. Os detalhes específicos para o set-up da mesa de trabalho do robô são fornecidas para cada protocolo (ver também Figura 4), ​​porém eles podem ser adaptados conforme necessário para mesa de trabalho alternativa set-ups. O hardware do robô (Tecan) consiste de um braço de 96 multicanal (MCA96), manipulador robótico (Roma) e do chefe de manipulação de líquidos de 8 canais (Liha). Todos os passos que utilizam a MCA96 também pode ser realizada utilizando o LIHA se uma MCA96 não está disponível, no entanto demoram mais tempo porque a LIHA terão de ser lavadas entre as etapas. Enquanto o robô não é tecnicamente um ambiente estéril, a inclusão de antibióticos geralmente assegura que não existem problemas com a contaminação ou a esterilidade.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tecan Freedom EVO 200 liquid handling robot</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Protocols can be adapted to any liquid handling robot with a vacuum manifold for plates. 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&#38;ID=5270&#38;Menu=1&#38;Item=21.1.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR (PCR96) plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>652270</td>
			<td> 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved for sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kanamycin (50 mg/ml), Ampicillin (100 mg/ml), Chloramphenicol (34 mg/ml in ethanol), store stocks at -20 &#176;C. Use a 1 in 1000 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep-well 96 (DW96) plate with 2.42 ml volume capacity</td>
			<td>Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td>780270</td>
			<td>Autoclaved for sterility. 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expression vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the expression of target constructs. Store at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) pLysS competent cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Or alternative E. coli expression strain of the user&#39;s choice. Store at &#8722;80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathseal breathable adhesive film</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>676050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine with 96-well plate block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the transformation heat shock and boiling of SDS-PAGE/Caliper samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well sterile tissue culture plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662165</td>
			<td> 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved for sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l sterile disposable tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 038 617</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Shaking Incubator, with 3 mm throw</td>
			<td>Infors</td>
			<td>AJ103</td>
			<td>Not essential, a regular shaking incubator can also be used. 
			http://www.infors-ht.com/index.php/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate incubator&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For glycerol stocks and elution using purification protocol B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the preparation of glycerol stocks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l disposable tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 038 616</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape pads&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19570</td>
			<td> 
			http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactinyl</td>
			<td>Orapi Group</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent microbial disinfectant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZYP-5052 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See Table 1 for recipes of components.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep well 24 (DW24) plates,10 ml capacity&#160;</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7701-5102</td>
			<td>Autoclaved for sterility. 
			http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed, clear microtiter plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655101</td>
			<td>For absorbance readings. 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reading spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional. For measuring OD600nm of cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with rotor for deep well plates&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Suitable for 3800 x g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mg/ml in water. Store at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole ACS grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IX0005-1</td>
			<td>A high quality grade of imidazole must be used so that it will not interfere with A280 readings for calculating protein yield.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 containing 0.25 mg/ml lysozyme (or your preferred buffer). Add lyzozyme from stocks each time and do not store for extended periods.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sonicator (Ultrasonic processor XL, adapted for deep well plates)</td>
			<td>Misonix Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Not essential. Lysozyme alone is normally sufficient for nearly complete lysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 mg/ml stock in water, filter sterilized. Store aliquots at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulphate (MgSO4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2M stock in water, autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE or Caliper sample buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Receiver/Filter Plate 20 &#181;m, 1.8 ml capacity</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740686.4</td>
			<td> 
			http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l disposable wide bore tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 050 348</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni Sepharose 6 Fast Flow resin</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5318-02</td>
			<td>For purification of target fusion proteins. Store at 4 &#176;C. Wash and equilibrate before use. 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobacco Etch Virus (TEV) protease</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional, for cleavage. 2 mg/ml, without reducing agents in storage buffer. Store at &#8722;80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well 0.22 &#181;m filter plate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MSGV N22 10</td>
			<td>Optional. To filter the soluble fraction after cleavage. 
			http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE/dot blot equipment or Caliper Labchip GXII equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Electrophoresis apparatus and choice of gel type is at the user&#8217;s discretion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer and cuvettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For measuring absorbance at 280 nm (A280) to calculate yield of soluble proteins. Not required if the analysis is done on the Caliper.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip pipette tips</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Optional. The type of ZipTip is at the user&#39;s discretion. C4 resin should be used for larger proteins, while for peptides C18 may be better. Alternative methods for desalting of samples may also be used to clean up samples before further quality control. 
			http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials are listed in the order in which they are required in the Protocol section. Reagents can be stored at room temperature unless noted otherwise. Reference numbers for the author&#8217;s preferred choice of materials are provided, however equivalent products may also be suitable. For reagents where the brand will not influence the outcome of the experiment, the company details have been omitted.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput quantitative expression screening and purification applied to recombinant disulfide-rich venom proteins produced in e. coli

Escherichia coli (E. coli) é o sistema de expressão mais amplamente utilizado para a produção de proteínas recombinantes para estudos estruturais e funcionais. No entanto, a purificação de proteínas é muitas vezes difícil uma vez que as proteínas são expressas numa forma insolúvel. Quando se trabalha com metas difíceis ou múltiplas é, portanto, recomenda-se usar alto rendimento (HTP) a expressão da proteína de triagem em pequena escala (1-4 ml culturas) para identificar rapidamente as condições para expressão solúvel. Para lidar com os vários programas de genoma estrutural do laboratório, uma quantitativa (em um intervalo de 0,1-100 mg / L cultura de proteína recombinante) e proteína HTP protocolo expressão rastreio foi implementado e validado em milhares de proteínas. Os protocolos foram automatizadas com o uso de um tratamento de robô líquido, mas também pode ser executada manualmente, sem equipamento especializado. Proteínas do veneno rico em dissulfeto estão ganhandocrescente reconhecimento por seu potencial como líderes de drogas terapêuticas. Eles podem ser altamente potente e seletivo, mas suas redes de ligação dissulfeto complexos torná-los difíceis de produzir. Como um membro do projeto FP7 Europeia Venomics ( <a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a> ), o nosso desafio é desenvolver estratégias de produção de sucesso com o objectivo de produzir milhares de proteínas do veneno novas para a caracterização funcional. Ajudado pelas propriedades redox de ligação dissulfeto isomerase DsbC, adaptamos nossa linha de produção HTP para a expressão de oxidados, peptídeos do veneno funcionais no E. citoplasma coli. Os protocolos são também aplicáveis ​​para a produção de diversas proteínas ricas em dissulfureto. Aqui demonstramos nosso pipeline aplicada para a produção de proteínas do veneno de animais. Com os protocolos aqui descritos, é provável que as proteínas ricas em dissulfureto solúveis serão obtidos em tão pouco como uma semana. Mesmo a partir de uma pequena escala, há o potencial para usar the proteínas purificadas para validar o estado de oxidação por espectrometria de massa, para a caracterização em estudos-piloto, ou por micro-ensaios sensíveis.

Os resultados representativos são mostrados na Figura 6, para o rastreio de 96 proteínas ricas em dissulfureto do oleoduto VENOMICS expressão. As proteínas são dispostas pelo aumento do número de ligações de dissulfureto, em seguida, o aumento do número de resíduos. Os péptidos foram expressas no citoplasma com uma cauda de His e DsbC parceiro de fusão. Ao utilizar as condições de cultura recomendados, um OD 600 de 12 é normalmente conseguida. Os peptídeos foram purificados usando o protocolo 8.2-B, com um volume final de 50 ul de resina de afinidade com níquel, de modo que um máximo de ~ proteína de 25 mg / L de fusão podia ser detectado nesta experiência. A Figura 6A mostra o resultado da electroforese de o sistema Caliper LabChip (mostrando a fusão antes de clivagem) e o sistema de classificação baseado na extrapolação para se obter, em mg / L de cultura da proteína de fusão (em níveis de 0,1 a 2 mg / L de cultura, de 2 a 10 mg / L de cultura, 10 a 25 mg / L de cultura e nenhuma<html> t detectado.) Note-se que a etiqueta de DsbC clivados normalmente trabalha a cerca de 32 kDa, em vez de 27 kDa, conforme o esperado. Similarmente, as fusões DSBC também executar cerca de 5 kDa, mais elevados do que o esperado. Para muitas das metas não só ver a fusão intacta (banda superior), mas também o parceiro de fusão sozinho (banda inferior). Para alguns desses alvos optimizar as condições de cultura podem melhorar o rácio de fusão intacta (banda superior) em comparação com DsbC sozinho permitindo um aumento do rendimento final. A pontuação é baseada apenas no nível de fusão intacta. Apenas 16 dos 96 proteínas não pode ser detectada ao nível de fusão. Isto corresponde a um nível de sucesso total de 83%. Dos 80 proteínas que poderiam ser detectados, que 45 destes foram detectados em níveis superiores a 2 mg / l de cultura (56%). Dependendo do alvo e de fusão, rendimentos proteicos são geralmente na gama de 2-100 mg / L de cultura (embora, neste exemplo, usando o protocolo B, no máximo 8,2 de ~ proteína de 25 mg / L de fusão pode ser detectado). t &quot;&gt; Uma análise de sucesso por número de ligações dissulfureto presentes (como mostrado na Figura 6B) mostra sucesso razoável para todos os números de ligações dissulfureto testadas (entre 1 e 7), com o menor nível de sucesso de 66% para ser alvos contendo 6 dissulfureto títulos. uma análise da distribuição de expressão sucesso com base no ponto isoelétrico e número de resíduos (mostrado na Figura 6) mostra nenhum viés particular para a técnica, com ambos os objetivos e metas que não foram detectados espalhados por todo o enredo expressas com sucesso. A Figura 6D mostra um exemplo dos resultados obtidos por espectrometria de massa espectrometria de massa de ionização por electrospray (ESI-MS) para um único alvo, antes e depois da redução da amostra com DTT. Normalmente, este tipo de análise de espectrometria de massa exaustiva não precisa ser realizada (uma amostra reduzida não necessita de ser analisada), no entanto, para os fins de demonstratio completan temos mostrado ambos resultados. A meta apresentada é uma proteína do veneno rico em dissulfeto de 5,7 kDa, com 4 pontes dissulfeto. O espectro da esquerda mostra os resultados para a proteína antes da redução com DTT, como foi depois de clivagem e dessalinização, sem outra intervenção. O espectro do lado direito mostra a proteína depois da redução com DTT, seguido por dessalinização para remover qualquer excesso de DTT. Os íons correspondentes às massas experimentais são marcadas com setas no espectro ea designação para cada íon é mostrado em verde. As massas mãe experimentais calculados para estes iões (para a proteína antes da redução (-DTT) e após redução (+ DTT)) são mostrados na tabela. As massas (5709,6 Da para a amostra antes da redução e 5717,6 Da para a amostra reduzida) exibem uma diferença de massa de 8 Da. A diferença de massa de 2 Da corresponde à presença de uma ligação de dissulfureto oxidado, por conseguinte, uma diferença de massa de 8 Da indica a presença de 4 ligações dissulfureto (como esperado) ema amostra não reduzida. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig1highres.jpg" width="500" /> Representação Figura 1. Esquemática do protocolo de pesquisa de expressão de alto rendimento. Usando este protocolo, 96-384 condições podem ser testadas por uma única pessoa dentro de uma semana, utilizando métodos manuais, ou até 1152, com as condições do equipamento semi-automatizado descrito. Os plasmídeos de expressão são construídos utilizando uma tecnologia de clonagem de modo a que a recombinação numerosos alvos podem ser sub-clonados de uma só vez. Uma vez que as condições de expressão solúveis têm sido identificados e clivagem realizada, se desejado, a proteína pode proceder a um controlo de qualidade para verificar a pureza e a oxidação, microassays e / ou a produção em grande escala. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig2highres.jpg" width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 2. Esquema de clonagem recombinacional universal e construir design. Dos clones entrada alvo, vários vetores de expressão pode ser sub-clonado em um único experimento de uma forma de alto rendimento (até 6 x 96 clones de entrada em uma semana). A proteína expressa codifica uma cauda de His para purificação de afinidade de níquel. O DsbC (sem a sua sequência de sinal para a expressão periplasmática citoplasmático) parceiro de fusão é utilizado para aumentar a solubilidade e / ou auxílio de dobragem e oxidação correctas da proteína alvo. Note-se que a sequência de codificação do alvo deve conter um sítio de protease TEV N-terminal (ENLYFQ) se tag clivagem é desejada. A inserção na parte superior esquerda mostra a produção de clones de entrada utilizando um vector dador e as sequências alvo, que pode ser obtido por PCR ou síntese de genes. Clones de entrada também podem ser obtidas a partir de colecções de clones de entrada comerciais. Vários sistemas de clonagem recombinacional estão disponíveis, no entanto, utilizar o syste gatewaym, tal como mostrado no esquema. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig3highres.jpg" width="500" /> Alta transferência oleoduto rastreio Figura 3. De alvos múltiplos rico em dissulfureto. Alvos são inicialmente expressos como fusões HIS-DSBC no citoplasma das células BL21 (DE3) pLysS de E. coli em 37/17 ° C utilizando um meio de auto-indução (ZYP-5052). A purificação é realizada em resina de níquel, seguido por detecção de construções solúveis por electroforese HTP (ou com dot blot / SDS-PAGE). Se a primeira rodada de expressão rastreio não for bem sucedida, as condições de cultura alternativos são julgados. Se construções produzem proteínas solúveis em altas o suficiente rendimentos, microassays e controle de qualidade pode ser realizada e, se necessário, a produção em larga escala pode ser perseguido. Para alvos onde os rendimentos solúveis não são altos o suficiente, a expressão de triagem pode continuar com stra alternativains e as temperaturas, em seguida, outros parceiros de fusão e de expressão periplasmic. Os passos opcionais são indicados por caixas tracejadas. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig4highres.jpg" width="500" /> Configuração Figura 4. Robô da mesa de trabalho para a plataforma HTP. A disposição do nosso líquido manuseamento robô mesa de trabalho é apresentado, apesar de mesas de trabalho alternativas também podem ser utilizadas desde há locais equivalentes disponíveis. A instalação consiste em uma estação de lavagem (WS) para o (8 canais cabeça manipulação de líquidos (liha)), dois portadores de microplacas com 4 posições cada (MP4, posições 1-4 e 5-8), uma estação de vácuo com 2 posições (Te-VAC, posições 9 e 10), um portador de microplacas com 3 posições (MP3, posições 11-13), dois shakers placa com 2 posições de cada um (Te-Shakers, posições 14-15 e 16-17) e um transportador para pontas descartáveis ​​com 3 posições (Diti, posições 18-20). Além disso, ore são dois porta do hotel para placas de poços profundos e um para microplacas (não mostrado). O hardware instalado no robô de manipulação de líquidos é um braço de 96 multicanal (MCA96) para uso com pontas descartáveis, uma cabeça de 8 canais de manipulação de líquidos (liha) com pontas fixas e um manipulador robótico (Roma) que se move placas / equipamentos em torno de a mesa de trabalho. A numeração das posições é referida em todo o protocolo. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. Esquemático por transferência a partir de uma única placa de 96 poços em quatro placas de 24 poços. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. Resultados representativos são mostrados para a tela de 96 rico em dissulfeto de veneno pro expressãoproteínas. As proteínas foram expressas como fusões HIS-DSBC no citoplasma e purificados utilizando 50 mL de resina de níquel (Protocolo 8.2-b). A) Expressão triagem resultados, mostrando gel virtual e marcando para o rendimento expressão. O contraste no gel virtual foi ajustado pista-a-pista para compensar bandas muito fracos ou intensos. Note-se que para alguns alvos duas bandas pode ser visto, a banda superior corresponde à proteína de fusão intacta e a banda inferior correspondente à marca de fusão por si só. B) A proporção de proteínas expressas em cada nível de expressão em comparação com o número de ligações de dissulfureto em a proteína. O número real de proteínas em cada grupo é sobreposto no gráfico. C) A distribuição dos níveis de expressão com base no ponto isoeléctrico (pi) e do número de resíduos. D) Um exemplo dos resultados de espectrometria de massa para um veneno rico em dissulfureto de 5,7 kDa proteína com 4 pontes dissulfeto. O espectro emo lado esquerdo mostra a proteína antes da redução com DTT e o espectro do lado direito mostra a proteína reduzida com DTT e depois dessalinizada. Os íons correspondentes às massas experimentais são marcadas com setas e suas atribuições são mostrados em verde. As massas experimentais para a proteína antes e após a redução da redução são mostrados na tabela e apresentam uma diferença de massa de 8 Da, correspondente à presença de proteína oxidada antes da adição do agente redutor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura .</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Receita </td><td> Comentário </td></tr><tr><td> ZY </td><td> ~ 928 ml 10 g de triptona 5 g de extracto de levedura 925 ml de água </td><td> Misture e autoclave para esterilizar. </td></tr&gt; <tr><td> 2 M MgSO4 </td><td> 100 ml 49,3 g de MgSO 4 7H 2 O · ~ 60 ml de água </td><td> Mexa até dissolver, em seguida, autoclave para esterilizar. </td></tr><tr><td> 50x 5052 </td><td> 1 L 250 g de glicerol 730 ml de água 25 g de glucose 100 g α-lactose </td><td> Adicionar em seqüência, mexa em fogo até que todos dissolvido depois autoclave para esterilizar. </td></tr><tr><td> 20x NPS </td><td> 1 L 900 ml de água 66 g de (NH 4) 2 SO 4 136 g de KH 2 PO 4 142 g de Na 2 HPO 4 </td><td> Adicionar em seqüência e mexa até ficar tudo dissolvido depois autoclave para esterilizar. </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Receita para componentes do meio ZYP-5052.

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High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Um protocolo para o, a expressão elevada rendimento quantitativo de rastreio e purificação de análise de proteínas de fusão em pequena escala a partir de culturas de Escherichia coli é descrita e aplicada para a expressão de proteínas alvo veneno animais ricos em disulfureto.

High Throughput Screening expressão quantitativa e Purificação Aplicada à recombinante Dissulfeto ricos em proteínas veneno produzido em<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

high-throughput-quantitative-expression-screening-purification

Research

JoVE Journal

Biology

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

23.9K visualizações.  Aix-Marseille Université.  Um protocolo para o, a expressão elevada rendimento quantitativo de rastreio e purificação de análise de proteínas de fusão em pequena escala a partir de culturas de Escherichia coli é descrita e aplicada para a expressão de proteínas alvo veneno animais ricos em disulfureto. 

Vídeo: High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biologia

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Mutagênese e Funcional Protocolos de Seleção para a Evolução Dirigida de proteínas em E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

High Throughput Screening da atividade endoglucanase de fungos em Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

De alto rendimento de purificação de afinidade com tag Proteínas Recombinantes

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration eficiente de plantas para alto nível de expressão transiente de proteínas recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

A purificação cromatográfica do não-polipéptidos recombinantes Elastina semelhantes e suas fusões com Peptídeos e Proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

De alta capacidade de Titulação de luciferase expressando recombinantes Vírus

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein belonging to the prion family. A chromatographic method for the purification of (His)6-tagged recombinant Shadoo expressed as inclusion bodies is described. The inclusion bodies are solubilized in 8 M urea and bound to a Ni2+-charged column to perform ion affinity chromatography. Bound proteins are eluted by a gradient of imidazole. Fractions containing Shadoo protein are subjected to size exclusion chromatography to obtain a highly purified protein. In the final step purified Shadoo is desalted to remove salts, urea and imidazole. Recombinant Shadoo protein is an important reagent for biophysical and biochemical studies of protein conformation disorders occurring in prion diseases. Many reports demonstrated that prion neurodegenerative diseases originate from the deposition of stable, ordered amyloid fibrils. Sample protocols describing how to fibrillate Shadoo into amyloid fibrils at acidic and neutral/basic pHs are presented. The methods on how to produce and fibrillate Shadoo can facilitate research in laboratories working on prion diseases, since it allows for production of large amounts of protein in a rapid and low cost manner.

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

A two-step chromatographic method is described for the purification of recombinant Shadoo protein expressed as inclusion bodies in Escherichia coli, as well as a protocol to fibrillate purified Shadoo into amyloid structures.

Purificação e redobramento de amilóide fibrilas de (seu)<sub&gt; 6</sub&gt; tagged proteína recombinante Shadoo Expresso como Corpos de Inclusão em<em&gt; E. coli</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...