Os Institutos Nacionais de Saúde (NIH R15 NS067536-01A1 para DC), a Associação Nacional Vulvodynia (prêmio para DC), e Macalester College apoiaram este trabalho. CB recebeu uma bolsa do Macalester College Beckman Scholars Programa, financiado pela Fundação Arnold e Mabel Beckman. BTF e TM são suportados por JDRF 2-2011-662. Agradecemos ao Dr. Jason Schenkel e Juliana Dr. Lewis para o conselho técnico, e todos os membros atuais e antigos do laboratório Chatterjea pela sua ajuda e apoio.

Nota: os ratos 8-12 semanas de idade do sexo feminino ND4 Swiss Webster, convencionalmente alojados com livre acesso a comida e água, foram utilizados para estes estudos O protocolo experimental utilizado (B13S1) foi aprovado pelo IACUC do Macalester College.. 1. Sensibilização e Desafio com Oxazolona <ol><li> Dia 0 <ol><li> Prepare a câmara de anestesia por adição de 3 ml de isoflurano para toalhas absorventes colocados por baixo da malha na parte inferior de um frasco de 4 L com tampa de vidro. Para os ratinhos fêmea ND4 usado aqui, o tempo na câmara é de 30-60 segundos até que o sujeito está adequadamente anestesiados; otimizar a administração do anestésico para a cepa do mouse está sendo usado. </li><li> Raspar as costas de cada rato anestesiado e flanquear usando um aparador de pêlos do animal. </li></ol></li><li> Dia 1 <ol><li> Adicione uma solução a 2% de 4-etoximetileno-2-fenil-2-oxazolin-5-ona (Ox) em etanol absoluto, e incuba-se a 50 ° C durante 15 min numa placa numa incubadora rotativa. </li><li> Resumidamente anestesiarcamundongos, usando anestesia isoflurano, conforme descrito no ponto 1.1.1 e aplique 100 l de 2% Ox ao raspou de volta em várias aplicações em série de cerca de 20 mL cada. Espera 5-10 seg entre aplicações em série para que a solução seque. </li><li> Tome cuidado para não derramar a solução 2% boi em outras regiões do que a parte de trás, e esperar que a solução para secar entre as aplicações. </li></ol></li><li> Dias 5-7 <ol><li> Adicione uma solução de 1% (OX) em etanol absoluto, e incuba-se a 50 ° C durante 15 min numa placa numa incubadora rotativa. </li><li> Gentil mas firmemente imobilizar o mouse na nuca do pescoço e base do rabo com abdômen virado para cima e pescoço ligeiramente inclinada para baixo (semelhante a uma espera por uma injecção intraperitoneal) e aplicam-se 100 ul de 1% do boi para o flanco raspada em várias aplicações em série e tendo o tempo necessário para secar a pele depois como descrito acima. </li><li> Para ratinhos de controlo, aplicar 100 ml de etanol absoluto veículo para o flan raspadak. </li></ol></li></ol> 2. Flanco Pele Colheita <ol><li> Eutanásia ratinhos utilizando dióxido de carbono inalação, e excisar cuidadosamente a área desejada da pele do flanco (~ 25 mm x 25 mm de pele) com 10 cm tesouras cirúrgicas. </li><li> Usando uma lâmina cirúrgica limpo, afiado, raspar o excesso de gordura e tecido conjuntivo da pele do flanco. </li><li> Colocar 3 pedaços de pele do flanco de 3 ratinhos em um tubo de 50 ml contendo 10 ml de HBSS RT [com vermelho de fenol, sem cálcio ou magnésio, 5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 10 mM ácido 4- (2-hidroxietil) -1- ácido piperazinoetanossulfónico (HEPES), e 10% de soro fetal de bovino (FBS)]. </li></ol> 3. Pré-lavagem de tecidos digestão <ol><li> Colocar o tubo contendo os fragmentos de pele sobre uma placa rotativa durante 30 min numa incubadora não gaseificada seco mantida a 37 ° C. </li><li> Vortex vigorosamente durante 10 seg, no final do período de incubação. </li><li> Coe o conteúdo do tubo por meio de um 70 uMfiltro para descartar o tampão de lavagem e recolher o tecido. Um único filtro pode ser reutilizada durante todo o procedimento dentro de um grupo de tratamento biológico. </li><li> Utilizando um par de pinças, transferir a pele do flanco do filtro para um novo tubo de 50 ml contendo 10 ml de fresco, meios RT (HBSS contendo EDTA, HEPES, e FBS como descrito acima). </li><li> Com um par de 12,5 cm de tesouras de dissecção cirúrgica imersos no interior do tubo, mediu cada pedaço de pele do flanco de modo a que o pedaço de tecido média é de aproximadamente 2,2 mm x 2,2 mm na área. </li><li> Colocar o tubo contendo os fragmentos de pele sobre uma placa rotativa durante 30 min numa incubadora não gaseificada seco mantida a 37 ° C. </li><li> Vortex vigorosamente durante 10 seg, no final da incubação </li></ol> 4. A digestão de colagenase da pele <ol><li> Coe o conteúdo do tubo através de um filtro de 70 | iM, recolher e transferir os pedaços de pele do flanco para um novo tubo de 50 ml contendo 10 ml de freSH, meios RT HBSS suplementado com 0,7 mg / ml de colagenase D. </li><li> Colocar o tubo contendo o meio de digestão e fragmentos de pele sobre uma placa rotativa durante 30 min numa incubadora não gaseificada seco mantida a 37 ° C. </li><li> Conteúdo vórtice de tubo vigorosamente durante 10 seg, no final da incubação. </li><li> Filtrar o conteúdo de tubo através de um filtro de 70 um para um novo tubo de 50 ml; manter o fluxo através contendo o tecido digerido e descartar o filtro e flanquear os restos da pele. </li><li> Lavar o fluxo de passagem em 50 ml de meio HBSS, centrifuga-se durante 5 min a 350 g, e decanta-se o sobrenadante. </li></ol> 5. centrifugação em gradiente de densidade <ol><li> Usando uma pipeta serológica, adicionar 3 ml de RT 67% de gradiente de densidade de meios de centrifugação em 1X tampão fosfato salino (PBS) para um novo tubo de 15 ml para cada amostra. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 5 ml de RT 44% de densidade de meios de centrifugação em gradiente em HBSS com vermelho de fenol. </li><li> CavalheiroLY camada de 5 ml da centrifugação em gradiente de densidade media de 44%, contendo as células na parte superior da centrifugação em gradiente de densidade de amostra media de 67%, utilizando uma pipeta serológica. Certifique-se de definir a pipeta para a velocidade mais lenta, e coloque a pipeta ao longo da parede do tubo cônico. Tenha cuidado para não agitar, perturbar, ou inverter o gradiente. </li><li> Definir aceleração para a configuração mais baixa, desengatar o travão de, e centrifugar o gradiente a 931 xg durante 20 min à temperatura ambiente para garantir que a centrífuga é equilibrada. </li><li> Após a centrifugação, retirar cuidadosamente o gradiente da centrífuga, e transportar gentilmente para a bancada do laboratório segurando o tubo na posição vertical. Usando uma pipeta de 5 ml de transferência de plástico, remover a camada de células na interface dos 44% e 67% de gradiente de densidade de meios de centrifugação e transferência para um novo tubo de 15 ml. Se a interface não é visível, basta remover cerca de 2 ml de líquido a 67% a -44% do limite. </li><li> Encha o tubo cônico contendo células do interface com FBS a 2% em 1X PBS gelado, as células de centrifugação durante 5 minutos a 350 xg, e decanta-se o sobrenadante. Nota: Esta é a primeira vez que as células podem ser arrefecido / mantido frio desde passos de digestão são a 37 ° C e os passos de centrifugação de gradiente de densidade media são à TA. As células podem ser ressuspendidas numa solução 1: 1 de tripano azul e contagens de diluição e informação viabilidade pode ser obtido neste ponto. </li></ol> 6. Bloqueio e coloração para análise de citometria de fluxo <ol><li> Bloco FcyRII / receptores em células III para evitar coloração não específica de anticorpos. Para as experiências aqui descritas, tornar misturas principais de anticorpo em PBS com 2% de FBS contendo 1: 100 de diluição do anticorpo não conjugado contra CD16 / 32 (2.4G2) para se ligar e bloquear os receptores FcyRII / III. </li><li> Incubar as células bloqueadas com misturas principais adequados de anticorpos contra CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8u (53-6,7), CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 ( 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14), e Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5), bem como violeta brilhante 510 ao vivo / morto mancha para identificar as células mortas. Use todos os anticorpos, quer a diluição recomendada pelos fabricantes ou previamente otimizado por pesquisadores. Para as experiências aqui descritas, utilizar todos os anticorpos de 1: 100 de diluição. </li><li> Lave as células e ressuspender em 50 ul de tampão de coloração 1X PBS com 2% de FBS. Manter em gelo até que os dados de fluorescência pode ser adquirido num citómetro de fluxo. Nota: É importante ter parâmetros de compensação pré-optimizada com o tecido linfóide e um antigénio da superfície celular comum (como CD4 ou CD8) antes da aquisição de dados de fluorescência. </li><li> Para aumentar o número de células por citometria de fluxo a jusante análise, a aquisição de dados a partir de amostras inteiras de células coradas. </li></ol> 7. Analisar Citometria de Fluxo de dados usando métodos padrão para realizar a passos descritos abaixo <ol><li> Primeiro, portão na região de linfócitos da dispersão para a frente(área) por dispersão lateral (área) enredo. </li><li> Em seguida, selecione as células individuais usando a dispersão para a frente (largura) por dispersão lateral (largura), para evitar analisando parelhas. Isto também pode ser conseguido com uma altura de dispersão para a frente pela altura dispersão lateral trama. </li><li> Então, portão na linhagem (CD11b, CD11c, e CD45R / B220) -negative e CD3-positivo eventos, para excluir macrófagos, células células dendríticas, e B, respectivamente, e confine análises para compartimento de células T, se o objetivo é, como é aqui, para avaliar as células T infiltrantes. </li><li> Em seguida, portão em células vivas que excluem a vivo / morto mancha. </li><li> Finalmente, portão à população de células de interesse (ver secção resultados representante). </li></ol>

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Os autores não têm interesses financeiros ou outros para divulgar.

Caracterização alterações em leucócitos-pele residente em modelos de roedores de doenças da pele tais como dermatite atópica ou psoríase é importante para a compreensão de ligações mecânicas entre o influxo de células inflamatórias e a patologia da doença. Aqui nós descrevemos uma técnica econômica para isolar leucócitos de tecido da pele com equipamento básico encontrado na maioria dos laboratórios de pesquisa biomédica. Esta técnica relativamente rápida evita a utilização de máquinas de dis...

Doenças da pele que variam de dermatite de contato, eczema, psoríase, celulite, infecções fúngicas e abcessos para cânceres de pele não-melanoma foram encontrados para estar entre as 50 doenças mais prevalentes em todo o mundo, ea quarta causa líder global de doenças não fatais em 2010 1. Por conseguinte, a investigação dos mecanismos moleculares e celulares subjacentes diversas patologias da pele é uma área de investigação activa e necessário. Modelos de roedores têm sido notavelmente útil na compreensão de condições inflamatórias da pele tais como dermatite atópica 2, 3 psoríase, ou infecção por Staphylococcus aureus 4. Protocolos de baixo custo, eficiente, simples e de digestão enzimática dos tecidos da pele do rato podem proporcionar preparações de células que podem ser utilizadas para uma variedade de aplicações a jusante para melhor compreender a fisiopatologia de doenças de pele. Aqui, um método simples e econômica é descrito por digestão enzimática da pele do ratode tecido e isolamento de leucócitos que se infiltram na pele que pode ser utilizado para cultura de células, in vivo, a transferência adoptiva, análise de citometria de fluxo e classificação ou estudos de expressão de genes. O objetivo geral deste procedimento é para preparar uma suspensão única célula de leucócitos infiltrantes da pele com a viabilidade celular elevada, minimizando os custos tipicamente associados a custom kits de reagentes e dissociadores mecânicos. Métodos existentes de dissociação do tecido da pele 5-7 pode resultar em baixa viabilidade celular e da superfície integridade marcador, ou requerem kits de enzimas personalizadas e caras máquinas de dissociação tecido 8-11. Enquanto a digestão do tecido da pele da orelha rato é razoavelmente prevalente 12-13, digerindo o tecido da pele altamente queratinizadas (por exemplo, a partir do flanco) pode resultar em preparações de células contaminadas com grandes quantidades de detritos não celular. Em um estudo recente, Zaid e colegas digerido rato pele flanco, durante 90 minutos em 2,5 mg / ml dispase, folloconduzida por 45 min em 3 mg / ml de colagenase 7. Em outro estudo, estes investigadores usaram várias incubações com uma digestão combinada de 2,5 horas, incluindo a utilização de tripsina / EDTA, colagenase III, e dispase 5. A utilização de tripsina não é recomendado para a digestão enzimática da pele, como o tratamento com tripsina a partir de diferentes fabricantes, tem sido demonstrado que afecta de forma mensurável a integridade de proteínas da superfície celular em células de mamífero 14-15. Além disso, dispase pode ter efeitos significativos sobre a capacidade proliferativa das células CD4 e CD8u T e afetar a abundância de superfície de pelo menos 20 moléculas, incluindo T comum marcadores de ativação celular, como CD62L 16. Outros protocolos usar RPMI 1640 no meio de digestão 6. No entanto, a presença de Mg 2+ e Ca 2+ em RPMI pode causar agregação extensiva de células 17. Um protocolo ideal para a dissociação do tecido deve apontar para a viabilidade celular elevada, baixoníveis de agregação das células, e o mínimo de danos para a célula proteínas de superfície. Alta qualidade preparações de células do linfonodo estromal ter sido realizado com protocolos que utilizam incubações enzimáticas mais curtos, Ca 2+ e Mg 2+ meios de comunicação livres e evitar tripsina e dispase 18. No entanto, não foram estabelecidas protocolos deste tipo para a dissociação da pele inteira do rato. Aqui, é descrito um protocolo para dissociar, isolar e enriquecer leucócitos infiltrantes de pele desafiados com alergénio pele de ratinho flanco. Resumidamente, pele excisada é pré-incubada em Solução de Sal Equilibrada de Hank (HBSS) com 10% de soro fetal bovino durante 1 h para amaciar o tecido para a digestão e remover qualquer excesso de pele ou tecido gordo morto. Isto é seguido por um passo de 30 min de digestão enzimática com 0,7 mg / mL de colagenase D. colagenase D tem efeitos mínimos sobre a densidade de marcadores da superfície celular, e nenhum efeito sobre a proliferação de células T in vitro, 16,18, tornando-altamente adequados para aplicações que envolvem a caracterização de proteínas de superfície. A seguir à digestão enzimática, centrifugação descontínua de gradiente de densidade foi utilizada para remover as células epiteliais e os detritos a partir da suspensão de célula única e para enriquecer células hematopoiéticas. Importante, este procedimento evita os reagentes caros de separação baseados em colunas de células magnético e máquinas de dissociação de tecido 8-11, e pode ser realizada com equipamento e materiais encontrada num laboratório de investigação biomédica de base. Aqui este protocolo foi utilizado para isolar leucócitos de pele flanco desafiados três vezes com o hapteno de oxazolona (OX) em ratos previamente sensibilizados ND4 suíços (adaptado a partir de 19). As células foram analisadas utilizando citometria de fluxo multi-paramétrico. Esta técnica proporcionou uma suspensão de células com detritos mínima e&gt; 95% de viabilidade de linfócitos isolados que foram analisadas por fluxo multiparamétrica de citometria de medir a infiltração de linfócitos T e de neutrófilos para o SK afectadadentro.

<table><tbody><tr><td>HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>55021C</td><td>Keep sterile until day of usage.</td></tr><tr><td>HEPES, &amp;ge;99.5% (titration)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodium salt solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7889</td><td>Keep sterile until day of usage.</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select</td><td>MidSci</td><td>S01520HI</td><td>Keep sterile until day of usage.</td></tr><tr><td>Percoll, pH 8.5-9.5 (25&amp;deg;C)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1644</td><td>Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use.</td></tr><tr><td>Trimmer Combo Kit</td><td>Kent Scientific</td><td>CL9990-1201&amp;nbsp;</td><td>Use the larger trimmer for shaving the flank and back.</td></tr><tr><td>4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E0753-10G</td><td>Dissolve in 100% EtOH at 50&amp;deg;C for 15 minutes on a rotating plate.</td></tr><tr><td>Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161</td><td>Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD3&amp;epsilon;-BV650 (145-2C11)</td><td>Becton Dickinson</td><td>564378</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)</td><td>eBioscience</td><td>47-0042-80</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD8&amp;alpha;-BV785 (53-6.7)</td><td>BioLegend</td><td>100749</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>48-0112-80</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD11c-eFluor450 (N418)</td><td>eBioscience</td><td>48-0114-80</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD44-BV711 (IM7)</td><td>Becton Dickinson</td><td>563971</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD45-FITC (30-F11)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0451-U025</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)</td><td>eBioscience</td><td>48-0452-80</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)</td><td>BioLegend</td><td>104431</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)</td><td>BioLegend</td><td>108407</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>Ghost Dye-BV510</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>13-0870-T100</td><td>Viability dye for flow cytometry</td></tr><tr><td>LSR Fortessa</td><td>Becton Dickinson</td><td>N/A</td><td>Cell analyzer (18 parameters)</td></tr><tr><td>Collagenase D from &lt;I&gt;Clostridium histolyticum&lt;/I&gt;</td><td>Roche Applied Science</td><td>11088858001</td><td>Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/ml in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots.&amp;nbsp; Store immediately at -20&amp;deg;C for up to six months.</td></tr><tr><td>ND4 Swiss female mice</td><td>Harlan</td><td>0-32</td><td>8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College&#039;s IACUC guidelines.&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

isolation of infiltrating leukocytes from mouse skin using enzymatic digest and gradient separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

A colagenase D tratada esplenócitos mostram níveis semelhantes de CD4 e CD8 α em células T, quando comparado com controlos tratados com media Em primeiro lugar, quaisquer efeitos potenciais de colagenase D sobre a frequência e abundância de superfície de linhagem e de ativação marcadores em subpopulações de células T foram avaliados utilizando tecido linfóide secundário como um controle. Uma suspensão de esplenócit...

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Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolamento de leucócitos de infiltração de rato pele utilizando digestão enzimática e separação por gradiente

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

isolation-infiltrating-leukocytes-from-mouse-skin-using-enzymatic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.3K visualizações.  Macalester College. This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols. 

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Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

Isolamento de Brain-infiltrando Leucócitos

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

O isolamento de linfócitos de rato Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the epidermis of mouse skin. There are seven important steps: separation of the epidermis from the dermis, digestion of the epidermis, staining of the epidermal cell populations with cisplatin, sample barcoding, staining with metal tagged antibodies for cell cycle markers and proteins of interest, detection of metal-tagged antibodies by mass cytometry, and the analysis of expression in the various cell cycle phases. The advantage of this approach over histological methods is the potential to assay the expression pattern of &#62;40 different markers in a single cell at different phases of the cell cycle. This approach also allows for the multivariate correlation analysis of protein expression that is more quantifiable than histological/imaging methods. The disadvantage of this protocol is that a suspension of single cells is needed, which results in the loss of location information provided by the staining of tissue sections. This approach may also require the inclusion of additional markers to identify different cell types in crude cell suspensions. The application of this protocol is evident in the analysis of hyperplastic skin disease models. Moreover, this protocol can be adapted for the analysis of specific sub-type of cells (e.g., stem cells) by the addition of lineage-specific antibodies. This protocol can also be adapted for the analysis of skin cells in other experimental species.

This protocol describes how to isolate skin keratinocytes from mouse models, to stain with metal-tagged antibodies, and to analyze stained cells by mass cytometry in order to profile the expression pattern of proteins of interest in the different cell cycle phases.

Isolação e mancha de keratinocytes da pele do rato para a análise específica do ciclo de pilha da expressão celular da proteína pela citometria maciça

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Biologia do Desenvolvimento

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Isolamento de linfócitos da pele humana para análise fenotípica e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Células

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and epidermis home a variety of immune cells in both homeostatic and inflammatory conditions. Tools to obtain skin cell release for cytofluorimetric analyses are, therefore, very useful in order to study the complex network of immune cells residing in the skin and their response to microbial stimuli. Here, we describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin to rapidly and efficiently obtain single-cell suspensions. This protocol allows maintenance of maximum cell viability without compromising surface antigen expression. We also describe how to take and digest skin samples from different anatomical locations, such as the ear, trunk, tail, and footpad. The obtained suspensions are then stained and analyzed by flow cytometry to discriminate between different leukocyte populations.

The skin is home to a complex immune cell network. We describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin, from different parts of the animal's body, in order to obtain a single-cell suspension and analyze the different leukocyte populations resident in the skin by flow cytometry.

Preparação de uma única célula suspensões para Análise de citometria de fluxo de diferentes regiões da pele do rato

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

Isolamento de células mielóides de rato Pele e Drenagem Linfonodo Seguindo intradérmica imunização com vivos atenuados<em&gt; Plasmodium</em&gt; Esporozoítos

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Isolando os linfócitos de rato pequeno Intestinal sistema imunológico

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous antigens and modulate responses to potent microbially derived immune stimuli. For this reason, the intestine is a major target site of immune dysregulation and inflammation in many diseases including but, not limited to inflammatory bowel diseases such as Crohn&#8217;s disease and ulcerative colitis, graft-versus-host disease (GVHD) after bone marrow transplantation (BMT), and many allergic and infectious conditions. Murine models of gastrointestinal inflammation and colitis are heavily used to study GI complications and to pre-clinically optimize strategies for prevention and treatment. Data gleaned from these models via isolation and phenotypic analysis of immune cells from the intestine is critical to further immune understanding that can be applied to ameliorate gastrointestinal and systemic inflammatory disorders. This report describes a highly effective protocol for the isolation of mononuclear cells (MNC) from the colon using a mixed silica-based density gradient interface. This method reproducibly isolates a significant number of viable leukocytes while minimizing contaminating debris, allowing subsequent immune phenotyping by flow cytometry or other methods.

The goal of this protocol is to isolate mononuclear cells that reside in the lamina propria of the colon by enzymatic digestion of the tissue using collagenase. This protocol allows for the efficient isolation of mononuclear cells resulting in a single cell suspension which in turn can be used for robust immunophenotyping.

Isolamento de células mononucleares de lamina propria de cólon murino usando Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

Isolando células endoteliais de capilares linfáticos dérmicos murinos

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic endothelial cells is an important process for lymphatic research, as it allows the performance of in vitro and biochemical experiments on the isolated cells. Moreover, the development of Cre-lox technology has enabled the tissue-specific deficiency of genes that cannot be globally targeted, leading to the precise determination of their role in the studied tissues. The dissection of the role of certain genes in lymphatic physiology and pathophysiology requires the use of lymphatic-specific promoters, and thus, the experimental verification of the expression levels of the targeted genes.
Methods for efficient isolation of lymphatic endothelial cells from wild-type or transgenic mice enable the use of ex vivo and in vitro assays to study the mechanisms regulating the lymphatic functions and the identification of the expression levels of the studied proteins. We have developed, standardized and present a protocol for the efficient isolation of murine dermal lymphatic endothelial cells (DLECs) via magnetic bead purification based on LYVE-1 expression. The protocol outlined aims to equip researchers with a tool to further understand and elucidate important players of lymphatic endothelial cell functions, especially in facilities where fluorescence-activated cell sorting equipment is not available.

Autor em destaque: Isolamento baseado em esferas magnéticas de células endoteliais linfáticas dérmicas murinas

This paper describes a method for magnetic bead-based isolation of murine endothelial cells from dermal lymphatic capillaries. The isolated lymphatic endothelial cells can be used for downstream in vitro experiments and protein expression analysis.

Isolamento de células endoteliais linfáticas dérmicas murinas

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic ...

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