Name: administering and detecting protein marks on arthropods for dispersal research
Uploaded: 2016-01-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
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O financiamento foi fornecido pelo USDA CRIS 5347-22620-021-00D e, em parte, pela Agricultura e Alimentação Research Initiative Competitive Grant não. 2011-67009-30141 do Instituto Nacional de Alimentação e Agricultura USDA. Somos gratos pelo apoio técnico de Johanna Nassif. Agradecemos também a Paul Baker, David Horton, Diego Nieto, e Frances Sivakoff por fornecer algumas das imagens utilizadas na Figura 3.

1. Mark Interno, retenção e procedimento de detecção <ol><li> Procedimento de marcação interna <ol><li> Coletar insetos de interesse (n ≈ 100 indivíduos) de uma colônia de laboratório criados em dieta artificial ou a partir do campo e dividir em dois recipientes de criação limpas. </li><li> Colocar 20 ml de uma dieta regular de pacotes (tratamento de controlo negativo não marcado) para um dos recipientes. Completar um segundo pacote de 20 ml de dieta artificial com 1,0 ml de uma solução / 1,0 mg ml IgG frango / IgY, misture bem, e colocá-lo em outro recipiente. Nota: Se o inseto de interesse não tem uma dieta artificial, a marca pode ser colocado sobre ou em qualquer dieta que eles são normalmente sustentada em (por exemplo, feijão verde, ovos da traça, água, açúcar, mel). </li><li> Permitir que os insetos para retomar sua atividade alimentar durante 24 h. </li></ol></li><li> Procedimento de retenção de marca Interno <ol><li> Remova os pacotes de dieta de cada recipiente e fornecer os insetos wom outra fonte de alimento para mantê-las ao longo da duração da experiência (por exemplo, feijão verde). </li><li> Recolha uma coorte (n = 20) de insectos por dia (ou em qualquer intervalo de tempo desejado) a partir de cada tratamento e congelar imediatamente a -20 ° C. </li></ol></li><li> Sanduíche procedimento ELISA <ol><li> Adicionar 50 ul de anticorpo de coelho anti-galinha IgY anticorpo primário diluído 1: 500 em tampão salino Tris (TBS) a cada poço de uma microplaca de ELISA limpo e incubar durante um mínimo de 1 hora à TA (nota: as microplacas também podem ser incubadas ó / N a 4 ° C). </li><li> Descartar o anticorpo a partir da placa e bloquear cada cavidade com 300 uL de uma solução não gorda de leite seco a 1,0% durante 30 min. </li><li> Enquanto espera para as etapas de incubação anteriores, colocar insetos congelados individualmente em 1,6 mL tubos de microcentrífuga com 1,0 ml de TBS. </li><li> Moer cada insecto com um pilão limpa até completamente homogeneizada e adicionar 100 ul de cada amostra para um poço individual do ELISAprato. Deixar as amostras a incubar à TA durante 1 h. </li><li> Adicionar 100 ul de negativo (TBS apenas) e positivos (clara de ovo em TBS) a poços de controlo na primeira coluna de cada placa de ELISA. Além disso, adicionar 100 ul de controlos negativos (insectos insectos não marcado) para os 8 poços na última coluna de cada placa (Figura 1). Permitir que as amostras de controlo a incubar à TA durante 1 h. Note-se que o molde fornecido na Figura 1 é o modelo que usamos para os nossos ensaios padronizados. A colocação das amostras nos poços é a critério do investigador. </li><li> Lavar cada poço três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e em seguida, adicionar Tween 50 ul de anticorpo de coelho anti-IgG de galinha / IgY conjugado com peroxidase diluído a 1: 10000 em solução de leite a 1% e incubar durante 1 h à TA. </li><li> Lavar cada poço três vezes com PBS-Tween e adicionar 50 ul de tetrametilbenzidina (TMB) a cada poço. </li><li> Após 10 min, ler os poçoscom um espectrofotómetro de microplacas fixado a um comprimento de onda de 650 nm. </li></ol></li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53693/53693fig1.jpg" /> Figura 1. Um diagrama esquemático que mostra as designações bem padronizados usados ​​para um típico de 96 cavidades de microplacas ELISA. Cada placa contém 7 poços dedicados a controlos negativos de solução salina tamponada com Tris (TBS), uma bem dedicados a um controlo positivo proteína (Pos Ctrl), 80 poços individuais dedicados a insetos recapturados (Amostra 1 ... 80), e 8 poços dedicados a não marcados (negativos) controles de insetos (Ctrl Neg 1 ... 8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53693/53693fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 2. Mark Externo, Retenção, e procedimento de detecção <ol><li> Procedimento de marcação externo <ol><li> Coletar insetos de interesse (n ≈ 100indivíduos) de uma colônia de laboratório ou de campo e local em dois recipientes de plástico 1,0 L com um buraco de diâmetro 2,5 centímetros socou para fora do lado de cada recipiente. </li><li> Pulverizar os insectos no primeiro recipiente com 1,0 ml de dH 2 O (tratamento de controlo negativo), utilizando um nebulizador médico. Pulverizar os insectos no segundo recipiente com 1,0 ml de uma solução 5.0% de clara de ovo de galinha utilizando um nebulizador médico. </li><li> Prenda a mangueira do nebulizador a uma tomada de ar do laboratório padrão e, em seguida, inserir a boca do nebulizador para o 2,5 centímetros buraco do recipiente. Em seguida, ligue a saída de ar gradualmente até o nebulizador produz um vapor. </li><li> Continue a pulverização (marcação) até a solução clara de ovo foi dispensado (aprox. 2-5 min). </li><li> Remover o nebulizador e colocar uma rolha no orifício do recipiente de plástico. Permitir que os insetos para se situar em temperatura ambiente, até a solução secar completamente. </li></ol></li><li> Procedimento de retenção de marca externa<ol><li> Coloque cada tratamento dos insetos secos em um recipiente limpo criação separado para evitar mais exposição para a marca. </li><li> Adicionar água e comida para os recipientes limpos para sustentar os insectos ao longo da duração do estudo. </li><li> Recolha uma coorte (n = 20) de insectos a partir de cada tratamento diariamente e congelar imediatamente a -20 ° C. </li></ol></li><li> Procedimento ELISA indireto <ol><li> Coloque os insetos congelados individualmente em 1,6 mL tubos de microcentrífuga e adicionar 1,0 ml de TBS. </li><li> Mergulhe as amostras para 1 hora em um conjunto agitador orbital a 120 rpm. </li><li> Adicionar controlos negativos e positivos, tal como descrito no Passo 1.3.5. </li><li> Após a imersão, pipetar uma aliquota de 100 ul de cada amostra para um dos 80 poços de amostra designado numa nova placa de 96 poços de ELISA tal como mostrado na Figura 1 Permitir que as amostras a incubar durante 1 hr à temperatura ambiente. (Nota: as microplacas também pode ser incubadas O / N a 4 ° C). </li><li> Lavar os poços três vezes comPBS-Tween e depois adicionar 300 ul de solução salina tamponada com fosfato contendo 1% de albumina de soro bovino (PBS-BSA) a cada poço. </li><li> Após 30 min à TA, lavar duas vezes com PBS-Tween. </li><li> Adicionar 50 ul de anticorpo de coelho anti-albumina de ovo anticorpo primário diluído 1: 8000 em PBS-BSA-Silwet (0,05%) a cada poço e incubar durante 1 h à TA. </li><li> Lavar cada poço três vezes com PBS-Tween e em seguida adicionar 50 uL de IgG de cabra anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano diluído a 1: 2000 em PBS-BSA-Silwet (0,05%) durante 1 h à TA. </li><li> Lavar cada poço três vezes com PBS-Tween e adicionar 50 ul de substrato TMB a cada poço. </li><li> Após 10 min, ler os poços com um espectrofotómetro de microplacas fixado a um comprimento de onda de 650 nm. </li></ol></li></ol> Análise 3. Dados <ol><li> Calcular o valor da absorvância média dos insectos 8 de controlo negativo em cada placa de ELISA e, em seguida, calcular o desvio padrão com base nos controlos negativos reunidas from todas as placas de ELISA de um dado estudo 12. </li><li> Adicionar seis vezes o desvio padrão combinado para a média obtida para cada placa de ELISA para se obter um valor limite positivo de ELISA. Qualquer amostra de insectos originando um valor de absorvância igual a ou maior do que este valor é considerado positivo para a presença da marca proteína. </li></ol>

A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais nesta publicação é somente para a finalidade de fornecer informações específicas e não implica recomendação ou endosso pelo Departamento de Agricultura dos EUA. O USDA é um fornecedor de oportunidades iguais e empregador.

O procedimento de imunomarcação de proteínas artrópode foi descrita pela primeira vez quase um quarto de século atrás 9. Desde então, o procedimento foi adaptado para estudar os padrões de dispersão de uma ampla variedade de artrópodes, usando administrados internamente e externamente de IgG / IgYs. Estas proteínas têm provado marcadores firmes para a grande variedade de espécies de insectos testadas até à data. No entanto, como mencionado acima, a principal limitação para a utilização de I...

Acompanhando o movimento de pragas de artrópodes, inimigos naturais (parasitóides e predadores), e polinizadores na natureza é essencial para compreender melhor como para melhorar os serviços ecossistêmicos. O componente-chave para a maioria dos tipos de pesquisa dispersão é ter um método confiável para marcar o artrópode (s) de interesse. Uma variedade de materiais (por exemplo, tintas, corantes, pós coloridos, tags, elementos raros, proteínas) têm sido utilizados para marcar os artrópodes para avaliar sua dinâmica populacional, capacidades de dispersão, alimentando comportamentos, e outras interações ecológicas 1,2. A adequação de um marcador utilizado para qualquer dada pesquisa dispersão será dependente do tipo de estudo a ser conduzido. Há três grandes categorizações para a marcação artrópodes: (1) marca-release-recaptura (MRR), captura de marcação (2), e auto de captura-marcação-(3). Para a pesquisa marca de liberação e recaptura, o investigador normalmente marca os artrópodes coletivamente no laboratóry e libera-los em um ponto central no campo. Os artrópodes são então recapturado em vários intervalos espaciais e temporais, utilizando diferentes dispositivos de captação (por exemplo, rede de varredura, de vácuo, armadilha pegajosa) 3,4,5. Os espécimes recapturados são examinados para a marca específica para distinguir liberado de indivíduos nativos. Para a pesquisa de captura-marcação, o investigador geralmente se aplica a marca diretamente no campo usando equipamento de pulverização (por exemplo, pulverizador costal, lança e bico pulverizador). Os melhores marcadores para pesquisa captura-marcação são baratos e de fácil aplicação para o habitat do artrópode. Para a pesquisa de auto-captura marcação, o investigador geralmente se aplica a marcas de um artrópode bait 6,7 ou 8 ninho entrada. Por sua vez, o artrópode própria marca internamente por devorar a isca marcada ou externamente por &quot;escovar&quot; contra a marca à medida que sai do ninho. Como mencionado acima, muitos tipos de marcadores têm sido nósed para marcar uma variedade de espécies de artrópodes. No entanto, muito poucos são úteis para todos os três destas categorias de investigação de dispersão. O desenvolvimento do processo de imunomarcação de proteínas foi um grande avanço para a marcação de insetos. Imunomarcação de proteínas coloca um rótulo em artrópodes interna ou externamente, que, por sua vez, é detectado através de um ensaio anti-proteína específica imunossorvente ligado a enzima (ELISA). Os primeiros marcadores de proteínas utilizadas foram tais imunoglobulina de coelho (IgG) e IgG de galinha / IgY 9,10. Eles provaram ser muito eficazes para marcas MRR e pesquisa de auto-captura marcação (ver discussão). Infelizmente, as proteínas IgG / IgY são caros e não são, portanto, prático para a investigação captura-marcação ea maioria dos tipos de pesquisa de auto-captura marcação. Subsequentemente, os testes ELISA de detecção de proteína de segunda geração foram desenvolvidos para proteínas contidas na clara do ovo de galinha (albumina), leite de vaca (caseína) e leite de soja (inibidor de tripsina de proteína). Cada ensaio é altamente sensível, específico, e, maisimportante, utiliza proteínas que são muito menos caros do que as proteínas de IgG / 11 IgY. Estas proteínas têm se mostrado eficazes para MRR, captura-marcação e pesquisa de auto-captura marcação (ver discussão). Neste artigo, nós descrevemos e demonstrar como conduzir marca proteína estudos de retenção de laboratório. Tais estudos são a primeira fase da pesquisa necessária para qualquer tipo de estudo de campo de dispersão. Especificamente, é fundamental que os investigadores sabem quanto tempo a marca será mantida nas espécies de artrópodes segmentados antes de embarcar em estudos de dispersão de campo. Aqui, descrevemos e demonstrar como interna e externamente marcar insetos para MRR, captura-marcação e estudos tipo de campo auto-captura marca. Nós, então, demonstrar como detectar a presença das marcas com ELISAs indiretos e de sanduíche.

<table><tbody><tr><td>Food storage container (for insect rearing)</td><td>Rubbermaid/Tupperware</td><td>Various sizes</td><td>Various manufacturers &amp;amp; vendors. Mesh fabric is glued in a window</td></tr><tr><td>Small volume nebulizer (Micro Mist)</td><td>Teleflex-Hudson RCI</td><td>1881</td><td>Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap</td><td>Continental Lab Products</td><td>4445.X</td><td>Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids.</td></tr><tr><td>Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5x20 grid)</td><td>RPI Corp.</td><td>145746</td><td>This design is nice because it doesn&#039;t crowd the tubes.</td></tr><tr><td>Dispenser, repeater</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>Anything similar will help speed up the dispensing.</td></tr><tr><td>Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 ml</td><td>Kimble Chase</td><td>749521-1500</td><td>Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse.</td></tr><tr><td>BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom)</td><td>BD</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>Ovation pipette, manual (20-200 &amp;micro;l)</td><td>VistaLab</td><td>1057-0200 or 1070-0200</td><td>Any similar type will work. This model is ergonomic.</td></tr><tr><td>Reservoirs, sterile reagent</td><td>VistaLab</td><td>4054-1000</td><td>Anything similar will work.</td></tr><tr><td>Electronic pipette, 8-channel (50-1,200 &amp;micro;l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730391</td><td>If you had to pick one electronic model, this size is most useful.</td></tr><tr><td>Electronic pipette, 8-channel (10-300 &amp;micro;l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730361</td><td>Anything similar will work.</td></tr><tr><td>Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z369802&amp;nbsp;</td><td>Anything similar will work for manual plate washing.</td></tr><tr><td>Microplate reader with absorbance detection</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 250</td><td>Anything similar will work.</td></tr><tr><td>Chicken IgG/IgY</td><td>United States Biological</td><td>I1903-15R</td><td>Also available from other sources</td></tr><tr><td>Egg whites</td><td>Grocery store</td><td>&amp;ldquo;All Whites&amp;rdquo;, &amp;ldquo;Egg Beaters&amp;rdquo;, &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;</td><td>Mix 5 ml with 95 ml dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O for 5% solution</td></tr><tr><td>Tris (Trizma Base)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>2.42 g/L to make TBS</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>29.22 g/L to make TBS and 8.0&amp;nbsp;g&amp;#8288;/&amp;#8288;L for PBS</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td>1.14 g/L for PBS</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>0.2 g/L for PBS</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>0.2 g/L for PBS</td></tr><tr><td>Tween 20, EIA grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>Add 0.5 ml per L to PBS after salts are dissolved.</td></tr><tr><td>PBS with 1% BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3688</td><td>Mix 1 packet in 1 L dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6409</td><td>Mix 100 &amp;micro;l in 50 ml TBS</td></tr><tr><td>Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%)</td><td>Grocery store</td><td></td><td>Mix 10 g with 1 L dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O for 1% solution</td></tr><tr><td>Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9046</td><td>Mix 100 &amp;micro;l in 1 L of 1% milk</td></tr><tr><td>Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6534</td><td>Dilute 125 &amp;micro;l in 1 L PBS-BSA</td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154</td><td>Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3&amp;nbsp;ml Silwet</td></tr><tr><td>Vac-In-Stuff (Silwet L-77) silicon-polyether copolymer</td><td>Lehle Seeds</td><td>VIS-01</td><td>Add as last ingredient</td></tr><tr><td>TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate</td><td>SurModics</td><td>TMBW-1000-01</td><td></td></tr></tbody></table>

administering and detecting protein marks on arthropods for dispersal research

Monitoramento movimento artrópode é muitas vezes necessária para entender melhor a dinâmica da população, associados padrões de dispersão, preferências de planta hospedeira, e outras interações ecológicas. Artrópodes são geralmente acompanhados na natureza por marcá-los com uma marca única e, em seguida, re-coleta-los ao longo do tempo e espaço para determinar as suas capacidades de dispersão. Além de marcas físicas reais, tais como pó de cor ou tinta, vários tipos de proteínas têm se mostrado muito eficaz para a marcação de artrópodes para a investigação ecológica. As proteínas podem ser administrados internamente e / ou externamente. As proteínas podem então ser detectados em artrópodes recapturados com um enzyme-linked immunosorbent assay específico para a proteína (ELISA). Aqui nós descrevemos protocolos para marcação externa e internamente artrópodes com a proteína. Dois exemplos experimentais simples são demonstradas: (1) uma proteína de marca interna introduzida para um insecto, proporcionando uma dieta enriquecida em proteína e (2) uma marca de proteína externa um topicamentepplied para um insecto usando um nebulizador médico. Nós, então, relacionar um guia passo-a-passo do sanduíche e métodos indiretos de ELISA utilizados para detectar marcas de proteína sobre os insetos. Nesta demonstração, são discutidos vários aspectos da aquisição e detecção de marcadores de proteína em artrópodes para marca-release-recaptura, captura-marcação, e os tipos de auto de captura de marca-de investigação, juntamente com as várias maneiras que o procedimento imunomarcação tem sido adaptado para atender a uma ampla variedade de objectivos de investigação.

Marcação interna: Os resultados do teste de retenção marca interna são mostrados na Figura 2A. O ELISA valor limiar crítico calculada foi 0,054. No geral (todos os quatro tempos do estudo combinado), os insectos tratados sem proteína originou consistentemente valores baixos de ELISA (x = 0,038 ± 0,002, n = 80). Por outro lado, todos os insectos alimentados com...

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Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.

Administrando e Detecção de Marcas de proteína em artrópodes para a dispersão de Pesquisa

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

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Research

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Environment

7.3K visualizações.  Arid-Land Agricultural Research Center. Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated. 

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A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes. The majority of them belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). We have focused on characterizing arthropod kinin receptors from the tick and mosquito. Arthropod kinins are multifunctional neuropeptides with myotropic, diuretic, and neurotransmitter function. Here, a method for systematic analyses of structure-activity relationships of insect kinins on two heterologous kinin receptor-expressing systems is described. We provide important information relevant to the development of biostable kinin analogs with the potential to disrupt the diuretic, myotropic, and/or digestive processes in ticks and mosquitoes.
The kinin receptors from the southern cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini), and the mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), were stably expressed in the mammalian cell line CHO-K1. Functional analyses of these receptors were completed using a calcium bioluminescence plate assay that measures intracellular bioluminescence to determine cytoplasmic calcium levels upon peptide application to these recombinant cells. This method takes advantage of the aequorin protein, a photoprotein isolated from luminescent jellyfish. We transiently transfected the aequorin plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in cell lines that stably expressed the kinin receptors. These cells were then treated with the cofactor coelenterazine, which complexes with intracellular aequorin. This bond breaks in the presence of calcium, emitting luminescence levels indicative of the calcium concentration. As the kinin receptor signals through the release of intracellular calcium, the intensity of the signal is related to the potency of the peptide.
This protocol is a synthesis of several previously described protocols with modifications; it presents step-by-step instructions for the stable expression of GPCRs in a mammalian cell line through functional plate assays (Staubly et al., 2002 and Stables et al., 1997). Using this methodology, we were able to establish stable cell lines expressing the mosquito and the tick kinin receptors, compare the potency of three mosquito kinins, identify critical amino acid positions for the ligand-receptor interaction, and perform semi-throughput screening of a peptide library. Because insect kinins are susceptible to fast enzymatic degradation by endogenous peptidases, they are severely limited in use as tools for pest control or endocrinological studies. Therefore, we also tested kinin analogs containing amino isobutyric acid (Aib) to enhance their potency and biostability. This peptidase-resistant analog represents an important lead in the development of biostable insect kinin analogs and may aid in the development of neuropeptide-based arthropod control strategies.

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

This protocol provides instructions for clonal-cell line selection and a calcium bioluminescence assay to analyze the structure-activity relationships of synthesized arthropod neuropeptides on their cognate GPCRs. This assay can be used for receptor deorphanization and structure-activity relationship studies for synthetic analog design and peptide/drug-lead discovery.

Um Ensaio Bioluminescência Cálcio de análise funcional do Mosquito ( Aedes aegypti) E Tick ( Rhipicephalus microplus) G receptores acoplados à proteína

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Imunologia e Infecção

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells named wing imaginal discs formed during embryonic development. In the larval stages the imaginal discs grow, increasing its number of cells and forming monolayered epithelial&#160;structures. Inside the pupal case, the imaginal discs bud out and fold into bilayers along a line that becomes the future margin of the wing. During this process, the longitudinal primodia veins originate vein cells on the prospective dorsal and ventral surfaces of the wing. During the pupal stage the stripes of vein cells of each surface communicate in order to generate tight tubes; at the same time, the cross-veins begin their formation.
With the help of appropriate molecular markers, it is possible to identify the major elements composing the wing during its development. For this reason, the ability to accurately detect transcripts or proteins in this structure is critical for studying their abundance and localization related to the development process of the wing.
The procedure described here focuses on manipulating pupal wings, providing detailed instructions on how to dissect the wing during the pupal stage. The dissection of pupal tissue is more difficult to perform than their counterparts in third instar larvae. This is why this approach was developed, to obtain rapid and efficient high quality samples. Details of how to immunostain and mount these wing samples, to allow the visualization of proteins or cell components, are provided in the protocol. With little expertise it is possible to collect 8-10 high quality pupal wings in a short amount of time.

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

The ability to accurately detect transcripts or proteins in Drosophila tissues is critical for studying their abundance and localization related to the development process. Here is the description of a straightforward procedure to dissect pupal wings. These wings can be used as samples in several techniques (immunohistochemistry, PCR assay, etc.).

Um método rápido e eficiente para dissecar asas Pupal de Drosophila apropriado para Immunodetections ou ensaios PCR

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Biologia do Desenvolvimento

A Method for Quantifying Foliage-Dwelling Arthropods

Terrestrial arthropods play an important role in our environment. Quantifying arthropods in a way that allows for a precise index or estimates of density requires a method with high detection probability and a known sampling area. While most described methods provide a qualitative or semi-quantitative estimate adequate for describing species presence, richness, and diversity, few provide an adequately consistent detection probability and known or consistent sampling areas to provide an index or estimate with adequate precision to detect differences in abundance across environmental, spatial, or temporal variables. We describe how to quantify leaf-dwelling arthropods by sealing the leaves and end of branches in a bag, clipping and freezing the bagged material, and rinsing the previously frozen material in water to separate arthropods from the substrate and quantify them. As we demonstrate, this method can be used at a landscape scale to quantify leaf-dwelling arthropods with adequate precision to test for and describe how spatial, temporal, environmental, and ecological variables influence arthropod richness and abundance. This method allowed us to detect differences in density, richness, and diversity of leaf-dwelling arthropods among 5 genera of trees commonly found in southeastern deciduous forests.

We describe how to quantify leaf dwelling arthropods by sealing the leaves and end of branches in a bag, clipping and freezing the bagged material, and rinsing the previously frozen material in water to separate arthropods from the substrate for quantification.

Um método para quantificar artrópodes da folhagem-habitação

Terrestrial arthropods play an important role in our environment. Quantifying arthropods in a way that allows for a precise index or estimates of density ...

Ambiente

Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, various technologies are being developed as control tools. A subset of these tools focuses on modifying the behavior of arthropods by attraction or repulsion. Therefore, arthropods are often the focus of behavioral investigations. Various tools have been developed to measure arthropod behavior, including wind tunnels, flight mills, servospheres, and various types of olfactometers. The purpose of these tools is to measure insect or arachnid response to visual or more often olfactory cues. The vertical T-maze oflactometer described here measures choices performed by insects in response to attractants or repellents. It is a high throughput assay device that takes advantage of the positive phototaxis (attraction to light) and negative geotaxis (tendency to walk or fly upward) exhibited by many arthropods. The olfactometer consists of a 30 cm glass tube that is divided in half with a Teflon strip forming a T-maze. Each half serves as an arm of the olfactometer enabling the test subjects to make a choice between two potential odor fields in assays involving attractants. In assays involving repellents, lack of normal response to known attractants can also be measured as a third variable.

A vertical, T-maze olfactometer is described for assaying the behavioral response of arthropods. The olfactometer allows the experimenter to measure choices performed by test subjects when subjected to two potential odor fields. Both attraction to and repulsion from odorants can be measured with this device.

Ensaio Escolha Vertical labirinto em T para a resposta de Artrópodes para odores

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, ...

Neurociência

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

A Single-fly Ensaio para comportamento de forrageamento em<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

SwarmSight: Real-time Tracking of Insect Antenna Movements and Proboscis Extension Reflex Using a Common Preparation and Conventional Hardware

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis during feeding. The ability to rapidly obtain high-resolution measurements of natural antenna and proboscis movements and assess how they change in response to chemical, developmental, and genetic manipulations can aid the understanding of insect behavior. By extending our previous work on assessing aggregate insect swarm or animal group movements from natural and laboratory videos using the video analysis software SwarmSight, we developed a novel, free, and open-source software module, SwarmSight Appendage Tracking (SwarmSight.org) for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The software processes frames about 120 times faster than humans, performs at better than human accuracy, and, using 30 frames per second (fps) videos, can capture antennal dynamics up to 15 Hz. The software was used to track the antennal response of honey bees to two odors and found significant mean antennal retractions away from the odor source about 1 s after odor presentation. We observed antenna position density heat map cluster formation and cluster and mean angle dependence on odor concentration.

This protocol describes steps for using the novel software, SwarmSight, for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The free, open-source software processes frames about 120 times faster than humans and performs at better than human accuracy.

SwarmSight: Acompanhamento em tempo real dos movimentos de antena do inseto e reflexo de extensão Proboscis usando uma preparação comum e Hardware convencional

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

Bioensaio eletroantenográfica como uma ferramenta de triagem para voláteis da planta hospedeira

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Biologia

The Ingestion of Fluorescent, Magnetic Nanoparticles for Determining Fluid-uptake Abilities in Insects

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid acquisition require assessing mouthpart structure and function relationships; however, fluid uptake mechanisms are historically inferred from observations of structural architecture, sometimes unaccompanied with experimental evidence. Here, we report a novel method for assessing fluid-uptake abilities with butterflies (Lepidoptera) and flies (Diptera) using small amounts of liquids. Insects are fed with a 20% sucrose solution mixed with fluorescent, magnetic nanoparticles from filter papers of specific pore sizes. The crop (internal structure used for storing fluids) is removed from the insect and placed on a confocal microscope. A magnet is waved by the crop to determine the presence of nanoparticles, which indicate if the insects are able to ingest fluids. This methodology is used to reveal a widespread feeding mechanism (capillary action and liquid bridge formation) that is potentially shared among Lepidoptera and Diptera when feeding from porous surfaces. In addition, this method can be used for studies of feeding mechanisms among a variety of fluid-feeding insects, including those important in disease transmission and biomimetics, and potentially other studies that involve nano- or micro-sized conduits where liquid transport requires verification.

Fluid-feeding insects have the ability to acquire minute quantities of liquids from porous surfaces. This protocol describes a method to directly determine the ability for insects to ingest liquids from porous surfaces using feeding solutions with fluorescent, magnetic nanoparticles.

A ingestão de fluorescente, nanopartículas magnéticas para determinar as capacidades de absorção de fluido em insetos

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid ...

Coletando hemolinfa de pequenos artrópodes

A Precise and Quantifiable Method for Collecting Hemolymph from Small Arthropods

Arthropods are known to transmit a variety of viruses of medical and agricultural importance through their hemolymph, which is essential for virus transmission. Hemolymph collection is the basic technology for studying virus-vector interactions. Here, we describe a novel and simple method for the quantitative collection of hemolymph from small arthropods using Laodelphax striatellus (the small brown planthopper, SBPH) as a research model, as this arthropod is the main vector of rice stripe virus (RSV). In this protocol, the process begins by gently pinching off one leg of the frozen arthropod with fine-tipped tweezers and pressing the hemolymph out of the wound. Then, a simple micropipette consisting of a capillary and a pipette bulb is used to collect the transudative hemolymph from the wound according to the principle of capillary forces. Finally, the collected hemolymph can be dissolved into a specific buffer for further study. This new method for collecting hemolymph from small arthropods is a useful and efficient tool for further research on arboviruses and vector-virus interactions.

Autor em destaque: um método preciso e quantificável para coletar hemolinfa de pequenos artrópodes  

We describe a method to collect quantifiable hemolymph efficiently from small arthropods for subsequent analysis.

Administrando e Detecção de Marcas de proteína em artrópodes para a dispersão de Pesquisa

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