O Citrus Research e da Fundação de Desenvolvimento é reconhecida por fornecer financiamento. Graças ao Anjo Hoyte e Flores Michael para a realização de bioensaios.

<ol><li> Montagem de um design personalizado, dois porta-dividido T-olfactómetro descrito anteriormente no Mann et al. 10 é mostrada na Figura 1. O olfactómetro é constituído por um tubo de vidro de 30 cm, que é bifurcado em duas portas separadas com uma tira de Teflon formar um labirinto em T. Cada metade é análogo a um braço de um olfactómetro estilo 2-escolha permitindo o sujeito de teste para escolher entre dois campos de odor potencial. <ol><li> Ensaios de montagem e subsequente deve ocorrer dentro de uma sala com temperatura controlada ou câmara ambiental. </li><li> Monte vidro olfatômetro T-labirinto vertical, como mostrado na Figura 1 e posicioná-lo sob uma lâmpada fluorescente luz 900 lux. </li><li> Para a difusão de luz ideal, o conjunto deverá ser montado dentro de um 1,0 x 0,6 x 0,6 m recipiente opaco para maximizar a difusão da luz uniforme. </li><li> Ligue os braços olfatômetro de fontes de odor que serão alojados em fase sólida micro-extracção / exploração de odor fonte Chamber (SPMEC) (ARS, Inc., Gainesville, FL) através de Teflon; conectores de tubo de vidro. Cada SPMEC é constituído por um tubo de vidro (17,5 cm de comprimento x 3,5 cm de largura) suportado com uma entrada e uma válvula de saída para as correntes de ar de entrada e de saída (Figura 1). </li><li> Ligar o sistema de fornecimento de ar a uma fonte externa de ar humidificado e carbono-purificado que está sob pressão constante (o sistema de fornecimento de ar tem tanto um filtro de carbono para a purificação do ar interno e um borbulhador de ar para a humidificação se fontes externas estão disponíveis). </li><li> Dissolver amostras químicas desejadas dentro diluente apropriado (solvente) e uma pipeta sobre um substrato de libertação lenta, tal como um pavio de algodão (Petty John Packaging, Inc., Concord, NC). O tratamento de controlo deve ser composto de um pavio de algodão impregnado com apenas solvente. </li><li> Para evitar a contaminação significativa da vidraria, envolver os pavios de algodão tratados e controle no tecido laboratório (Kimwipes, Kimberly-Clark, Roswell, GA) e em lugar dos dois braços SPMEC (ARS, Inc., Gainesville, FL). No caso de amostras de plantas vivas, uma câmara de recolha de guilhotina volátil pode ser anexado ao olfactómetro contendo tratamentos em lugar do SPMEC (Figura 1). </li><li> Entregar purificado e ar humidificado por meio do SPMEC (ou câmara de guilhotina voláteis) por meio de duas bombas ligadas a um sistema de fornecimento de ar (Figura 1). Manter a taxa de fluxo de ar de 0,1 L / min através de ambos os braços do olfactómetro. </li></ol></li><li> Empregando olfactómetro para testar a resposta de repelentes de artrópodes putativos. Na presente descrição, um insecto hemípteros, psyllid citrino asiático, Diaphorina citri, foi utilizado como um teste de artrópodos. Resposta foi testada para produtos voláteis de citrinos, isoladamente ou em combinação com um (dissulfureto de dimetilo) e repelente de ar limpo como fontes de odor. <ol><li> Realizar todos os experimentos a uma temperatura padronizada e umidade relativa. </li><li> Antes de todos os testes, expor tassuntos est para limpar ar versus ar limpo ou ar solvente contra limpa no olfatômetro labirinto em T para verificar a ausência de viés posicional ou um efeito de solvente sobre o comportamento do sujeito teste. </li><li> Atribuir uma fonte de odor aleatoriamente a um dos braços do olfatômetro no início de cada bioensaio. Inverter esta posição depois de cada 10 indivíduos de teste analisadas, no mínimo, para eliminar o potencial de polarização de posicionamento. </li><li> Testar a resposta de um mínimo de 30 (e até 120) cobaias por combinação. </li><li> Permitir teste 100-300 sec sujeitos a exibir uma resposta comportamental com base na resposta previamente estabelecido (latência) intervalo. </li><li> Sujeito registo se entra no braço do tratamento, o braço de controlo ou permanece na porta de libertação ou abaixo da divisão labirinto em T. </li><li> Marcar uma escolha braço de tratamento ou controle quando um assunto de teste atravessa a divisão no labirinto em T e se move para qualquer braço olfatômetro. </li><li> Marcar uma escolha braço de liberação quando um teste sem prejuízo permanece na porta de libertação ou abaixo da divisão labirinto em T. </li><li> Limpar o olfactómetro e tubos de ligação cuidadosamente com uma solução de sabão a 2% e cozer os componentes de vidro a 200 ° F entre a utilização de tratamentos de odores diferentes. </li><li> Para os ensaios em que putativas tratamentos repelentes são apresentados no olfactómetro labirinto em T com ou sem um tratamento químico em relação ao ar puro, comparar o número de indivíduos de teste restantes no ponto de libertação e não entrando no olfactómetro entre os tratamentos por uma análise de variância ( ANOVA) seguida pelo teste HSD de Tukey (α &lt;0,05). Nos casos em que os indivíduos do teste deixar o braço de liberação, compare o número de escolher o braço de controle versus o braço de tratamento com qui-quadrado (χ 2) análise de α &lt;0,05. </li></ol></li></ol>

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O autor recebeu financiamento que foi fornecido pelo Citrus Research e da Fundação para o Desenvolvimento.

Aqui, um dispositivo de doseamento e o protocolo são descritos para medir a resposta de artrópodes pequenos (Insecta: Hemiptera: Psyllidae) a odorantes. O método envolve um teste de escolha, permitindo que o insecto para fazer uma escolha entre dois campos odorantes no caso dos ensaios de avaliação de um atraidor putativo. Além disso, o sujeito de teste pode apresentar três tipos de comportamentos, deixando o braço de lançamento e introduzindo um dos dois campos potenciais de odor, ou permanecendo no braço de libertação, no caso de ensaios de repelência. O olfatômetro permite alta de coleta de dados a transferência, pois aproveita o geotactic negativo (tendência de se mover para cima) e phototactic positivo (tendência de se mover em direção à luz) resposta comportamental natural de artrópodes muitos. Embora a presente demonstração usa um exemplo de teste psilídeo insecto, o ensaio pode ser prontamente adaptado para os artrópodes em geral, tanto as que utilizam voo ou andando como modos predominantes de transporte. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; olfatômetros projetados para medir a resposta dos insetos foram inicialmente desenvolvidos há décadas e têm desempenhado um papel importante na elucidação atrativos e repelentes de insectos 12. Os modelos específicos de tais olfatômetros variam amplamente, no entanto, variações sobre o tema geral do ensaio de dois escolha descrito aqui, bem como, semelhantes em tubos de ensaios de Y tem sido muitas vezes utilizado para medir a resposta de artrópodes a produtos químicos. Túneis maiores de voo que podem causar a fuga contínua dos insectos 9 também resultaram na recolha de dados inovador elucidar os mecanismos fundamentais de vôo de insetos e orientação para semioquímicos, assim como, os dados de informação do uso prático de ferramentas de controle de pragas. Muitas vezes, é necessário para adaptar um desenho olfactómetro e instrumentação associada para a biologia do sujeito de teste específico de artrópodes. Essas olfatômetros que podem ser usados ​​dentro de um grupo de insectos em geral são mais úteis do que os specific a um grupo pequeno, no entanto, por vezes, o significado económico de um pequeno grupo de insectos dita a necessidade de desenvolvimento de um olfactómetro muito específica e método de dosagem. O projeto descrito atualmente baseia-se em técnicas de artrópodes previamente conhecidas. Ela permite a um ensaio de dois mais padrão de escolha de Y-tubo bioensaios em que a arena experimental ou teste de escolha assume a forma de um dispositivo de vidro em forma de Y 7. Tipicamente, um dos braços de um tal tubo em Y receberá um odorante tratamento, enquanto o outro será deixado em branco 13. Variações sobre olfatômetros podem incluir a adição de múltiplos braços radiais 14 e até mesmo a adição de um meio de solo para o ensaio do comportamento dos organismos que se movem através do solo 15. Ao desenvolver tais olfatômetros e ensaios associados, é importante considerar a proximidade condições naturais são replicadas e, assim, a verdadeira relevância das respostas comportamentais avaliadas em termos de biologia os indivíduos do teste. Para a lagrau rge, os dados recolhidos só será tão útil quanto a relevância do bioensaio de comportamento em relação à ecologia comportamental do organismo 16. O olfatômetro descritos atualmente e bioensaio comportamental é projetado especificamente para um inseto hemípteros que tende a iniciar vôo tão curto &quot;saltos&quot; 16. A orientação vertical do olfactómetro e a fonte de luz de acordo facilitar o início do movimento de insectos e, assim, o comportamento subsequente orientação quimicamente mediada pode ser ensaiada de forma eficiente e com alto rendimento. Este arranjo ensaio comportamental pode provavelmente ser utilizados para uma ampla gama de voar ou andar taxa de artrópodes ou pode ser também facilmente modificado para se adequar a necessidade de não-artrópodes organismos.

Artrópodes (incluindo insetos e aracnídeos) são muitas vezes definidas como pragas, porque quer competir com o consumo humano em ambientes agrícolas ou urbanas ou transmitir patógenos causadores de doenças 1. Uma grande quantidade de investimento é feito no desenvolvimento de ferramentas de controle de pragas. Estas ferramentas podem variar muito e progresso significativo foi feito no desenvolvimento de ferramentas biorational que quer modificar ou explorar o comportamento natural de pragas com o uso de atrativos comportamentais ou repelentes 2,3. Artrópodos muitas vezes dependem de sinais olfativos ou sugestões para acasalar e / ou de acolhimento local 4. Portanto descoberta de atrativos efetivos ou repelentes de pragas muitas vezes pode levar ao desenvolvimento de ferramentas de controle. Este processo de descoberta envolve várias etapas. Primeiro, o comportamento natural do assunto de teste deve ser entendida. Por exemplo, deve-se determinar se um sexo de uma dada espécie atrai o opostosexo por localização companheiro. Se assim for, deve-se determinar se esta atracção é mediada por uma substância química e química que onde é produzido. Os próximos passos incluem determinar quando o produto químico é produzido e a sua eventual identificação. Durante todo este processo, a resposta do sujeito de teste (insecto ou ácaro) comportamental a odorantes deve ser testado. Inicialmente, o comportamento do sujeito de teste será testado para o material natural. Por exemplo, a resposta de uma mariposa macho podem ser testados à do extracto da sua conspecific fêmea glândula pheromone. Alternativamente, a resposta de um herbívoro aos odores naturais da sua planta hospedeira pode ser testada. Enquanto estas investigações, muitas vezes têm um foco prático no desenvolvimento de ferramentas de gestão de 5,6, que também pode ser aplicado para a pesquisa que aborda questões mais fundamentais, como a especiação 7. Passos seguintes envolvem a testar a resposta do artrópode de versões sintéticas de produtos naturais identificados. Understanding como artrópodes responder aos produtos químicos exige o desenvolvimento de ferramentas adequadas para medir o seu comportamento. Os dados gerados por essas ferramentas vai depender da forma como o investigador é capaz de medir comportamentos naturais em um ambiente controlado. Mais de seis décadas atrás, olfatômetros vôo sustentado e túneis foram desenvolvidos para medir a resposta do inseto a odores 8,9. Olfatômetros variar significativamente em design e muitas vezes são adaptados para o inseto específico ou problema a ser investigado. O objetivo deste artigo é descrever a concepção e utilização de uma orientação vertical, olfatômetro labirinto em T para medir a resposta dos insetos a odores (Figura 1). Orientação vertical do olfactómetro da tira vantagem do geotaxis negativo (tendência para se mover para cima) exibida por muitos insectos. Uma fonte de luz posicionada directamente por cima do olfactómetro aproveita o fototaxia positivo (tendência para se mover para a fonte de luz) exibida por muitos insectos. O olfactometer é particularmente útil para insectos hemípteros, que tendem a não exibir movimento prontamente em olfatômetros orientados horizontalmente e que são altamente influenciadas pela intensidade de luz no que diz respeito à orientação. No entanto, este dispositivo pode ser utilizado para uma grande variedade de insectos rastejantes voadores e, assim como aracnídeos. O olfactómetro podem ser empregues para avaliar ambos os atrativos e repelentes. No caso de attractants, o campo de odor bifurcado (Figura 1) é estabelecida com o atraidor putativo libertado de um lado contra o ar limpo libertado no lado oposto. A escolha é registada quando o insecto libertado na base do olfactómetro escolhe um dos dois campos de odor. No caso dos repelentes, um comportamento terceira é possível. Para além de um movimento ascendente em qualquer um dos dois campos de odor, a falta de movimento ascendente pode ser gravada indicando um estímulo não responsiva ou repelir estímulo dos campos tanto de odor.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do Equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Duas portas dividido T-olfactómetro </td><td> Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL </td><td> Nenhum (custom made) </td><td> Se indisponível a partir de ARS, Sul Científica (Gainesville, FL) também atualmente constrói e distribui equipamentos. </td></tr><tr><td> Em fase sólida detenção micro-extração / câmara-fonte odor com Teflon; conectores de vidro de tubo. </td><td> Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL </td><td> RV R3- </td><td> Veja acima comentário </td></tr><tr><td> Ar do sistema de entrega </td><td> Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL </td><td> HADS-2AFM2C.4 </td><td> Veja acima comentário </td></tr><tr><td> Guilhotina câmara </td><td> Analítica ReseSistemas de arco (ARS), Inc. Gainesville, FL </td><td> L3GP3 </td><td> Veja acima comentário </td></tr></tbody></table>

vertical t-maze choice assay for arthropod response to odorants

Dada a importância econômica dos insetos e aracnídeos como pragas de culturas agrícolas, ambientes urbanos ou como vetores de doenças de plantas e humanos, várias tecnologias estão sendo desenvolvidas como ferramentas de controle. Um subconjunto dessas ferramentas foca modificar o comportamento dos artrópodes por atracção ou repulsão. Portanto, os artrópodes são frequentemente o foco das investigações do comportamento. Várias ferramentas foram desenvolvidas para medir o comportamento de artrópodes, incluindo túneis de vento, moinhos de vôo, servospheres, e vários tipos de olfatômetros. O objetivo dessas ferramentas é para medir a resposta do inseto ou aracnídeo a estímulos visuais ou mais frequentemente olfativo. O oflactometer T labirinto vertical descrito aqui mede opções realizadas por insetos em resposta a atrativos ou repelentes. É um dispositivo de ensaio de elevado rendimento que tira proveito da fototaxia positivo (atracção à luz) e negativos (geotaxis tendência para andar ou voar para cima) exibidas pelos artrópodes muitos. O olfactometer é constituído por um tubo de vidro de 30 cm, que é dividido em dois com uma tira de Teflon formando um labirinto em T. Cada metade serve como um braço do olfatômetro permitindo que os indivíduos do teste que fazer uma escolha entre dois campos de odor potencial em ensaios envolvendo atrativos. Nos ensaios envolvendo repelentes, a falta de resposta normal a attractants conhecidos também pode ser medida como uma terceira variável.

Atração de asiáticos cítricas (psilídeo Diaphorina citri) adultos aos odores de suas voláteis de plantas hospedeiras natal (citrus) é representado na figura 2A. Adultos de forma significativa (α &lt;0,05) mais escolheu o braço do labirinto em T olfactómetro receber odores de plantas cítricas vivos em comparação com um controlo (ar limpo) branco. Um exemplo de repulsão é mostrado na Figura 2B. Neste caso, os insectos foram expostos a um braço do labirinto em T voláteis de citrinos que receberam, enquanto que o segundo braço recebido voláteis a partir de uma planta cítrica que foi tratada com o dissulfureto conhecido, repelente de dimetilo 11. Neste caso, os três tipos de comportamentos foram observados. O número de psilídeo presos no braço de liberação e não responder não diferiu estatisticamente do número de entrar no braço recebendo os odores de plantas cítricas isoladamente (Figura 2B). No entanto, não entrou no braço psyllids contendo tele planta hospedeira volátil quando co-apresentado com o repelente (Figura 2B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50229/50229fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama esquemático de orientado verticalmente olfactómetro labirinto em T ligado ao sistema de fornecimento de ar e os dispositivos de libertação de odores de tratamento. O diagrama é uma adaptação da Figura 1 na Mann et al. 10. Um assunto de teste é colocado individualmente na câmara de lançamento do 2 porta-dividido T olfatômetro. Ela se move em direção aos odores através de uma válvula de gaveta que permite controlar o movimento ascendente no olfatômetro e impede o inseto de rastejar de volta para a área do ponto de lançamento. O tubo de 10 centímetros bifurca após o valor do portão. Uma resposta positiva a um odor é registado uma vez que o insecto se move 0,5 centímetros em um lado específico da divisão. A câmara de recolha de guilhotina volátil pode ser utilizado no lugar de um sólido de PHAse realização de micro-extração / câmara de odor de origem (SPMEC) como uma fonte de odor. <img alt="Figura 2" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50229/50229fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50229/50229fig2.jpg" /> Figura 2. Resposta de asiáticos cítricas psilídeo (Diaphorina citri) adultos para voláteis de plantas cítricas hospedeiro versus o controlo de ar limpo (A) ou voláteis de citrinos contra voláteis de citrinos co-libertados com um (dissulfureto de dimetilo) repelente (B) em um T orientada verticalmente -maze olfactómetro Figura 2A:. Uma forma de análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste HSD de Tukey (α &lt;0,05) foi realizado para comparar o número de psilídeo fazendo uma escolha entre ambos os braços (2 tratamentos, n = 120). As colunas indicadas por letras diferentes são significativamente diferentes uns dos outros (α &lt;0,05) Figura 2B:. One-way Analysé de variância (ANOVA) seguida pelo teste HSD de Tukey (α &lt;0,05) foi realizado para comparar o número de psilídeo fazendo uma escolha entre ambos os braços ou a permanecer no ponto de libertação (3 tratamentos, n = 120). As colunas indicadas por letras diferentes são significativamente diferentes uns dos outros (α &lt;0,05).

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Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants

A vertical, olfatômetro labirinto em T é descrito para o ensaio da resposta comportamental de artrópodes. O olfactómetro permite que o experimentador para medir escolhas realizadas por indivíduos de teste quando submetidos a dois campos de odor potencial. Ambos atração e repulsão de odores pode ser medida com este dispositivo.

Ensaio Escolha Vertical labirinto em T para a resposta de Artrópodes para odores

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, ...

vertical-t-maze-choice-assay-for-arthropod-response-to-odorants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.6K visualizações.  University of Florida. A vertical, olfatômetro labirinto em T é descrito para o ensaio da resposta comportamental de artrópodes. O olfactómetro permite que o experimentador para medir escolhas realizadas por indivíduos de teste quando submetidos a dois campos de odor potencial. Ambos atração e repulsão de odores pode ser medida com este dispositivo.

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T-maze Forced Alternation and Left-right Discrimination Tasks for Assessing Working and Reference Memory in Mice

Forced alternation and left-right discrimination tasks using the T-maze have been widely used to assess working and reference memory, respectively, in rodents. In our laboratory, we evaluated the two types of memory in more than 30 strains of genetically engineered mice using the automated version of this apparatus. Here, we present the modified T-maze apparatus operated by a computer with a video-tracking system and our protocols in a movie format. The T-maze apparatus consists of runways partitioned off by sliding doors that can automatically open downward, each with a start box, a T-shaped alley, two boxes with automatic pellet dispensers at one side of the box, and two L-shaped alleys. Each L-shaped alley is connected to the start box so that mice can return to the start box, which excludes the effects of experimenter handling on mouse behavior. This apparatus also has an advantage that in vivo microdialysis, in vivo electrophysiology, and optogenetics techniques can be performed during T-maze performance because the doors are designed to go down into the floor. In this movie article, we describe T-maze tasks using the automated apparatus and the T-maze performance of &alpha;-CaMKII+/- mice, which are reported to show working memory deficits in the eight-arm radial maze task. Our data indicated that &alpha;-CaMKII+/- mice showed a working memory deficit, but no impairment of reference memory, and are consistent with previous findings using the eight-arm radial maze task, which supports the validity of our protocol. In addition, our data indicate that mutants tended to exhibit reversal learning deficits, suggesting that &alpha;-CaMKII deficiency causes reduced behavioral flexibility. Thus, the T-maze test using the modified automatic apparatus is useful for assessing working and reference memory and behavioral flexibility in mice.

This article presents the protocol of T-maze tests using a modified automated apparatus for assessing the learning and memory functions in mice.

T-maze Alternância forçado e Tarefas esquerda-direita para a Avaliação da Discriminação de Trabalho e Memória de Referência em Ratos

Forced alternation and left-right discrimination tasks using the T-maze have been widely used to assess working and reference memory, respectively, in ...

Neurociência

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Métodos de Ensaio para Drosophila Comportamento

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). There are several behavioral mechanisms through which an insect learns salient associations and relates them to these events. It is important to understand this behavioral plasticity for programs aimed toward assisting insects that are beneficial for agriculture. This understanding can also be used for discovering solutions to biomedical and agricultural problems created by insects that act as disease vectors and pests. The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol was developed for honey bees (Apis mellifera) over 50 years ago to study how they perceive and learn about floral odors, which signal the nectar and pollen resources a colony needs for survival. The PER procedure provides a robust and easy-to-employ framework for studying several different ecologically relevant mechanisms of behavioral plasticity. It is easily adaptable for use with several other insect species and other behavioral reflexes. These protocols can be readily employed in conjunction with various means for monitoring neural activity in the CNS via electrophysiology or bioimaging, or for manipulating targeted neuromodulatory pathways. It is a robust assay for rapidly detecting sub-lethal effects on behavior caused by environmental stressors, toxins or pesticides.
We show how the PER protocol is straightforward to implement using two procedures. One is suitable as a laboratory exercise for students or for quick assays of the effect of an experimental treatment. The other provides more thorough control of variables, which is important for studies of behavioral conditioning. We show how several measures for the behavioral response ranging from binary yes/no to more continuous variable like latency and duration of proboscis extension can be used to test hypotheses. And, we discuss some pitfalls that researchers commonly encounter when they use the procedure for the first time.

The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol, developed for the honey bee (Apis mellifera), provides an ecologically-relevant and easily quantifiable means for studying several different mechanisms of learning in many insect species.

Um protocolo de resposta narigudo Extensão para investigar plasticidade comportamental em Insetos: Aplicação para Basic, biomédica e Pesquisa Agropecuária

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Aumento Time-dependente na resposta da rede à estimulação de culturas de pilha neuronais em matrizes do micro-elétrodo

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Electroencephalographic, Heart Rate, and Galvanic Skin Response Assessment for an Advertising Perception Study: Application to Antismoking Public Service Announcements

The evaluation of advertising, products, and packaging is traditionally performed through methods based on self-reports and focus groups, but these approaches often appear poorly accurate in scientific terms. Neuroscience is increasingly applied to the investigation of the neurophysiological bases of the perception of and reaction to commercial stimuli to support traditional marketing methods. In this context, a particular sector or marketing is represented by public service announcements (PSAs). The objective of this protocol is to apply electroencephalography (EEG) and autonomic signal analysis to study responses to selected antismoking PSAs. Two EEG indices were employed: the frontal alpha band EEG asymmetry (the Approach Withdrawal (AW) index) and the frontal theta (effort index). Furthermore, the autonomic Emotional Index (EI) was calculated, as derived from the Galvanic Skin Response (GSR) and Heart Rate (HR) signals. The present protocol describes a series of operational and computational steps required to properly estimate, through the aforementioned indices, the emotional and cerebral reaction of a group of subjects towards a selected number of antismoking PSAs. In particular, a campaign characterized by a symbolic communication style (classified as "awarded" on the basis of the prizes received by specialized committees) obtained the highest approach values, as estimated by the AW index. A spot and an image belonging to the same PSA campaign based on the "fear arousing appeal" and with a narrative/experiential communication style (classified as "effective" on the basis of the economical/health-related improvements promoted) reported the lowest and highest effort values, respectively. This is probably due to the complexity of the storytelling (spot) and to the immediateness of the image (a lady who underwent a tracheotomy). Finally, the same "effective" campaign showed the highest EI values, possibly because of the empathy induced by the testimonial and the explicitness of the message.

The following protocol describes a series of operational and computational steps required to properly estimate the emotional and cerebral reaction of a group of subjects towards a selected number of Public Service Announcements (PSAs) against smoking, aired in the USA and Europe during the period between 1998 and 2015.

Eletroencefalográficos, frequência cardíaca e avaliação de resposta galvânica da pele para uma percepção de publicidade estudam: aplicativo para anúncios de anti-tabagismo serviço público

The evaluation of advertising, products, and packaging is traditionally performed through methods based on self-reports and focus groups, but these ...

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, oviposition, and mating. Myriad chemicals of varying volatilities have been identified as natural odorants that activate insect Olfactory Receptor Neurons (ORNs). However, studying the olfactory responses to low-volatility odorants has been hampered by an inability to effectively present such stimuli using conventional odor-delivery methods. Here, we describe a procedure that permits the effective presentation of low-volatility odorants for in vivo Single-Sensillum Recording (SSR). By minimizing the distance between the odor source and the target tissue, this method allows for the application of biologically salient but hitherto inaccessible odorants, including palmitoleic acid, a stimulatory pheromone with a demonstrated effect on ORNs involved in courtship and mating behavior1. Our procedure thus affords a new avenue to assay a host of low-volatility odorants for the study of insect olfaction and pheromone communication.

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

The overall goal of this protocol is to demonstrate how to present odorants of low volatility for single-sensillum recording from Drosophila olfactory receptor neurons that respond to long-chain cuticular pheromones.

Gravação eletrofisiológica de<em&gt; Drosophila</em&gt; Sensilla Tricoide em resposta aos odorantes de baixa volatilidade

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc superoxide dismutase 1 (SOD1). The structural instability of SOD1 and the detection of SOD1-positive inclusions in familial-ALS patients supports a potential causal role for misfolded and/or aggregated SOD1 in ALS pathology. In this study, we describe the development of a cell-based assay designed to quantify the dynamics of SOD1 aggregation in living cells by high content screening approaches. Using lentiviral vectors, we generated stable cell lines expressing wild-type and mutant A4V SOD1 tagged with yellow fluorescent protein and found that both proteins were expressed in the cytosol without any sign of aggregation. Interestingly, only SOD1 A4V stably expressed in HEK-293, but not in U2OS or SH-SY5Y cell lines, formed aggregates upon proteasome inhibitor treatment. We show that it is possible to quantify aggregation based on dose-response analysis of various proteasome inhibitors, and to track aggregate-formation kinetics by time-lapse microscopy. Our approach introduces the possibility of quantifying the effect of ALS mutations on the role of SOD1 in aggregate formation as well as screening for small molecules that prevent SOD1 A4V aggregation.

We describe a method to quantify the aggregation of misfolded proteins. Our protocol details lentiviral induced stable cell line generation, automated confocal imaging, and image analysis of protein aggregates. As an illustrative application, we studied the effect of small molecules in promoting SOD1 aggregation in a time- and dose-dependent manner.

Desenvolvimento de ensaio para quantificação de conteúdo elevado de Sod1 proteína mutante formação agregada em células vivas

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.

Rastreamento do comportamento larval de Drosophila em resposta à estimulação optogenética de neurônios olfativos

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR malfunction, expressed as either over- or under-activity caused by mutations, altered expression, trafficking, or localization, can contribute to numerous diseases, especially in the central nervous system. Therefore, understanding the receptor&#39;s biology as well as facilitating the discovery of compounds and small molecules is crucial in ongoing efforts to combat neurological diseases. Current approaches to studying the receptor have limitations including low throughput, high cost, and the inability to study its functional abilities due to the necessary presence of channel blockers to prevent NMDAR-mediated excitotoxicity. Additionally, the existing assay systems are sensitive to stimulation by glutamate only and lack sensitivity to stimulation by glycine, the other co-ligand of the NMDAR. Here, we present the first plate-based assay with high-throughput power to study an NMDA receptor with sensitivity to both co-ligands, glutamate and D-serine/glycine. This approach allows the study of different NMDAR subunit compositions and allows functional studies of the receptor in glycine- and/or glutamate-sensitive modes. Additionally, the method does not require the presence of inhibitors during measurements. The effects of positive and negative allosteric modulators can be detected with this assay and the known pharmacology of NMDAR has been replicated in our system. This technique overcomes the limitations of existing methods and is cost-effective. We believe that this novel technique will accelerate the discovery of therapies for NMDAR-mediated pathologies.

The goal of this protocol is to facilitate the study of NMDA-receptors (NMDAR) at a larger scale and allow the examination of modulatory effects of small molecules and their therapeutic applications.

Um ensaio de cálcio de alta produtividade-flux para estudar os receptores NMDA com sensibilidade de glicina/D-serina e glutamato

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Data Acquisition and Analysis In Brainstem Evoked Response Audiometry In Mice

Brainstem evoked response audiometry (BERA) is of central relevance in the clinical neurophysiology. As other evoked potential (EP) techniques, such as visually evoked potentials (VEPs) or somatosensory evoked potentials (SEPs), the auditory evoked potentials (AEPs) are triggered by the repetitive presentation of identical stimuli, the electroencephalographic (EEG) response of which is subsequently averaged resulting in distinct positive (p) and negative (n) deflections. In humans, both the amplitude and the latency of individual peaks can be used to characterize alterations in synchronization and conduction velocity in the underlying neuronal circuitries. Importantly, AEPs are also applied in basic and preclinical science to identify and characterize the auditory function in pharmacological and genetic animal models. Even more, animal models in combination with pharmacological testing are utilized to investigate for potential benefits in the treatment of sensorineural hearing loss (e.g., age- or noise-induced hearing deficits). Here we provide a detailed and integrative description of how to record auditory brainstem-evoked responses (ABRs) in mice using click and tone-burst application. A specific focus of this protocol is on pre-experimental animal housing, anesthesia, ABR recording, ABR filtering processes, automated wavelet-based amplitude growth function analysis, and latency detection.

Brainstem evoked response audiometry is an important tool in clinical neurophysiology. Nowadays, brainstem evoked response audiometry is also applied in the basic science and preclinical studies involving both pharmacological and genetic animal models. Here we provide a detailed description of how auditory brainstem responses can be successfully recorded and analyzed in mice.

Aquisição e análise de dados na audiometria de resposta evocada de tronco encefálico em camundongos

Brainstem evoked response audiometry (BERA) is of central relevance in the clinical neurophysiology. As other evoked potential (EP) techniques, such as ...