Esta pesquisa foi realizada no Projeto CRIS USDA-ARS 5.325-42.000-037-00D e com os resultados de CRADA 58-3K95-7-1198 e TFCA 58-5325-8-419. Os autores agradecem Suterra para o dom do (Z, Z) -11,13-hexadecadienal, B. Higbee para discussões produtivas, e J. Baker para assistência técnica.

1. Preparação de compostos voláteis detectados a partir da planta hospedeira para EAG Triagem <ol><li> Após a identificação apropriada e de autenticação de todos os voláteis através de GC-MS, executar EAG análise baforada de cada volátil disponível. Triagem inicial pode ser um número idêntico de baixo das respostas antenais (N = 3-5) para cada sexo, a fim de alcançar uma indicação de chemoreceptivity relativa num curto período de tempo (Tabela 1). </li><li> Prepara-se uma solução de cada volátil a uma concentração de 5 mg / mL em pentano. Firmemente selar e refrigerar a amostra até estar pronto para utilização imediata (por exemplo, acetofenona, densidade = 1,03 g / mL, volume = (0,005 g/1.03 g / mL) × 1,000 = 4,85 uL de acetofenona para um balão volumétrico de 1,0 mL e diluir até 1,0 mL com pentano). </li><li> Pouco antes de análise EAG, remover os frascos contendo o 5 concentração mg / mL de voláteis a ser testadas e deixa-se aquecer até à temperatura ambiente. Enquanto isso, rotular o número adequado de pipetas Pasteur paracorrelacionam-se com cada volátil a ser testado, e envolva um pequeno pedaço de parafilme (ca. 15 × 15 mm) sobre a ponta da pipeta. Para os iniciais de rastreio 10 pipetas de estímulo (N = 4 para cada sexo masculino e feminino) são carregados no caso de uma preparação de mau ou obstáculo imprevistas. </li><li> Utilizando um par de pinças, gentilmente dobrar o disco bioensaio para metade, para facilitar a colocação para a pipeta, em seguida, parcialmente colocar o disco dobrada na extremidade mais larga da pipeta de modo que ca. 2-3 milímetros do disco estão expostos. Alinhe as pipetas rotulados e preparado em um suporte de rack. </li><li> Usando uma pipeta ou uma seringa, de carga de 10 uL (50 ug) de solução volátil para cada disco e permitir que a 2 minutos de passar antes de inserir totalmente discos para a pipeta. Uma vez carregado, imediatamente vedar a extremidade da pipeta com parafilme (ca. 15 × 30 mm). A quantidade de estímulo volátil a ser carregado e inchado provavelmente variar com as espécies insectos. </li><li> Seguindo o mesmo protocolo descrito acima preparar controles paraincluir em cada análise. Para o controle de carga negativa de 10 uL de apenas pentano em cada disco, espere 2 minutos, coloque na pipeta rotulados, e selo. Para o controle positivo, carregar 10 L (50 mg) para o disco, espere 2 minutos, de carga para a pipeta rotulados, e vedação com parafilme. </li><li> A viabilidade da preparação de insetos antenal provavelmente irá variar com a espécie, mas descobrimos que Amyelois transitella antenas normalmente permanecer ativo e consistente por mais de 30 minutos após a excisão utilizando o protocolo descrito. Esta quantidade de tempo será geralmente permitir até 4-10 amostras de voláteis a serem avaliadas. A Tabela 2 fornece um exemplo de vezes e sequências. </li></ol> 2. Preparação de antenas de inseto para EAG Bioensaio <ol><li> O foco deste experimento é EAG análise, portanto, o pressuposto de que cada pesquisador terá acesso aos insetos devidamente criados. </li><li> Para esta experiência, vamos estar estudando 3-4 dias old, acasaladas mariposas machos e fêmeas. Traças individuais são transferidos para um pequeno, o recipiente, com tampa de plástico no dia da análise. Imediatamente antes do bioensaio, a traça a ser testado é transferido de cabeça em um aparelho de fixação (isto é, feito a partir de várias pontas pipetadores de plástico) e protegido por trás. A manipulação do inseto pode ser visto sob um baixo consumo de energia estereomicroscópio para facilitar a excisão. </li><li> Antenas são esmiuçadas por meio de uma ferramenta fio de ponta. O titular da forquilha, com uma película pequena de gel de eléctrodo, é colocado em estreita proximidade para a transferência rápida de antenas. A primeira antena é excisado utilizando tesouras micro e colocado no garfo, assegurando a base da antena é colocada sobre a porção não-vermelho do garfo (o eléctrodo de terra indiferente). Um conjunto temporizador durante 10 minutos e é iniciado o segunda antena é excisado e colocado ao lado da primeira antena com ambas as bases do mesmo lado da forquilha. </li><li> Alternativamente, as antenas podem ser deixados segura dentro do holdintubo g, excisadas, em seguida, removido gentilmente entre o tubo eo insecto usando uma ferramenta de fio de ponta com um pouco de gel na extremidade. </li><li> Antenas são verificados para garantir a base e da ponta estão imersos em gel de eléctrodo e sem bolhas estão presentes no gel. As extremidades / dicas pode ser cortado para garantir a plena exposição ao gel do eletrodo. Cuidado deve ser usado para assegurar que o resto de cada antena não é coberta com gel, garantindo assim máxima superfície antenal é exposto para o sopro. </li><li> O garfo preparado é então inserido na sonda pré-amplificador e mantidos sob um fluxo constante de ar humidificado a 200 mL / min para o tempo remanescente do minutos de período de espera 10. O tempo de consumo e EAG vezes de iniciação são anotados (Tabela 2) e 30 segundos antes da baforada primeiro estímulo, a pipeta contendo o controlo positivo é selada e colocada no suporte que é ajustado para dirigir ar / baforada de fluxo 2-3 mm a partir de o preparado antenas. </li><li> Após cada experiment, as traças de teste são sacrificados em um ambiente de gelo seco e devidamente eliminados. </li><li> Mariposas fêmeas são dissecados para verificar o status de acasalamento. Machos que coabitam Supõe-se que acasalaram. </li></ol> 3. EAG Protocolo para os componentes individuais <ol><li> Respostas antenais são registados através do software AutoSpike incluídos com o instrumento EAG Syntech. A configuração na guia Propriedades AutoSpike para o canal com a sonda EAG é fixado em uma taxa de amostragem de 106,7, NO para corrigir, e um filtro de 0-42 Hz. Para a guia Filtro, o filtro EAG é ON eo corte baixa é definida a 0,1 Hz. </li><li> Puffs estímulo são 1-2 segundos de duração. Um timer de 1 minuto é iniciado após cada baforada. </li><li> A pipeta próximo teste volátil é selada e colocada no suporte. A sequência de voláteis de ensaio, ao acaso entre corre para garantir que não há compostos de teste de forma consistente seguir outro teste volátil, é seguida (por exemplo, Tabela 2) cuidadosamente allowing 1 minuto entre baforadas. </li><li> Para facilitar a facilidade de leitura respostas EAG, porções de réguas são colocados no ecrã do computador eo nível de linha de base para o ápice do sinal de deflexão para baixo é medido em milímetros e registados numa folha de dados (isto é, para a configuração de 5 mV, 33 milímetros = 2,5 mV). O software tem a capacidade de reprodução das gravações guardadas para análise futura. Conversão de milímetro, quer mV ou amplitude mV é realizada na análise de dados mais tarde. </li><li> Após a baforada final de controlo positivo (por exemplo, gravar # 12) é administrado, as antenas são removidos, o garfo é limpo com uma limpe-etanol saturado e deixada a secar antes de utilização posterior. </li><li> Para aumentar o rendimento dos ensaios, a excisão do próximo conjunto de antenas pode ser iniciado por um técnico de laboratório segundo cerca de 10 minutos antes do final do experimento atual - após o sopro quarto, o segundo teste volátil do experimento atual, conforme tabela 2. Isto irá permitir que for do início da experiência seguinte directamente após as extremidades experimentais correntes. </li><li> Maior número de repetições (em antenas diferentes) pode ser realizada em compostos de interesse para proporcionar maior validação estatística. </li></ol> 4. Um Exemplo de Análise EAG de Blends ou outras matrizes (Tabela 3) <ol><li> Em seguida, as proporções e os volumes de duas misturas terciária (3-misturas de componentes) são calculadas para fornecer um exemplo de combinar os voláteis eliciar respostas EAG elevada (Tabela 4). Os cálculos são para algumas proporções de base, uma razão 1:1:1 molar de α-humuleno: 2-undecanona: 2-feniletanol e comparando a uma proporção de mistura de segunda 01:02:04. </li><li> Utilizando protocolos similares descrito anteriormente, as misturas são preparadas e rotuladas pipetas de Pasteur são carregados, juntamente com os controlos necessários positivos e negativos. </li><li> As amostras voláteis são soprados através de antenas características de macho e fêmea, e as respostas são medidos e registrados ema uma folha de dados (Tabela 3). </li></ol> 5. Os resultados representativos Para orangeworm umbigo feminino as seguintes definições são usadas: 2 puffs segundo, 10 vezes, 10 segundos de gravação segunda janela, e 5 da escala mV. A deflexão negativa é a resposta típica, ainda que o valor absoluto é gravado (por exemplo, -3400 mV deflexão é gravado como 3.400 mV). Uma resposta relativamente fraca da prep para o controlo positivo é descartado. A Figura 1 fornece uma representação gráfica de uma resposta fraca à do controlo positivo por orangeworm umbigo. Por exemplo de um resultado de controlo pobre, a resposta fêmea média da antena para acetofenona é tipicamente ca. 2600 mV (Figura 2), se a preparação só deu uma resposta de ca. 1300 mV seria descartado e um outro par de antenas preparado. Da mesma forma, a resposta média do sexo masculino a (Z, Z) -11,13-hexadecadienal foi typically 3000 mV, assim, qualquer resposta inferior a 1500 mV foi tipicamente descartado. O controlo positivo, no início e no fim de cada experiência também fornece informações acerca da condição das antenas. Uma regra de ouro que seguimos para a verificação rápida é se a resposta da antena para o sopro da pós-controle (registro # 12, Tabela 2) ou é inferior a 75% do sopro 1 º do controle pré-(registro # 1 , Tabela 2) ou menos do que a baforada nd 2 do controlo de pré-(Pormenores # 2, Tabela 2), em seguida, a experiência não é usado na análise de dados devido a possível degradação da prep (Figura 3). Um exemplo da primeira regra de ouro seria registro # 1 = 2730 mV e registro # 12 = 1680 mV; ea segunda regra de ouro se o registro # 2 = 2350 mV e registro # 12 = 1680 mV, Em cada um desses casos , os resultados de preparação e experimentação, seriam eliminados. Aexemplo representativo de corrigir os valores de resposta EAG como medidos para o controlo positivo seria como se segue. <table border="1"><tbody><tr><td> Executar # </td><td> EAG (mV) </td><td> Executar # 2 </td><td> EAG (mV) </td><td> Executar # 3 </td><td> EAG (mV) </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2800 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2420 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 3030 </td></tr><tr><td> A Cmpnd </td><td> 3000 </td><td> A Cmpnd </td><td> 2500 </td><td> A Cmpnd </td><td> 3440 </td></tr><tr><td> (-) Ctrl </td><td> 530 </td><td> (-) Ctrl </td><td> 755 </td><td> (-) Ctrl </td><td> 910 </td></tr><tr><td> Cmpnd B </td><td> 2400 </td><td> Cmpnd B </td><td> 2000 </td><td> Cmpnd B </td><td> 2560 </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2770 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2400 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 3020 </td></tr></tbody></table> Utilizando os valores acima para uma N = 3 experiência, a resposta de controlo negativo é subtraído de cada valor dentro de cada experimento sob a suposição de controlo negativo é a resposta de linha de base da antena para a baforada mecânica e de solvente residual. <table border="1"><tbody><tr><td> Executar # 1 </td><td> EAG (mV) </td><td> Executar # 2 </td><td> EAG (mV) </td><td> Executar # 3 </td><td> EAG (mV) </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2270 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 1665 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2120 </td></tr><tr><td> A Cmpnd </td><td> 2470 </td><td> A Cmpnd </td><td> 1745 </td><td> A Cmpnd </td><td> 2530 </td></tr><tr><td> (-) Ctrl </td><td> 0 </td><td> (-) Ctrl </td><td> 0 </td><td> (-) Ctrl </td><td> 0 </td></tr><tr><td> Cmpnd B</td><td> 1870 </td><td> Cmpnd B </td><td> 1245 </td><td> Cmpnd B </td><td> 1650 </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2240 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 1645 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2110 </td></tr></tbody></table> Os controles positivos para cada experimento seria, então, em média e corrigidos a 1.000 mV, observando a relação para a correção para 1.000 mV. Uma folha de dados (por exemplo, Excel) pode ser facilmente manipulado para converter as respostas aos dados utilizáveis. <table border="1"><tbody><tr><td> Executar # 1 </td><td> Médio (mV) </td><td> Executar # 2 </td><td> Médio (mV) </td><td> Executar # 3 </td><td> Médio (mV) </td></tr><tr><td> (+) Ctrl </td><td> 2255 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 1655 </td><td> (+) Ctrl </td><td> 2115 </td></tr><tr><td> (+) Ctrl adj. </td><td> 1000 (0.443) </td><td> (+) Ctrl adj. </td><td> 1000 (0.604) </td><td> (+) Ctrl adj. </td><td> 1000 (0.473) </td></tr></tbody></table> Multiplicando pelo rácio de correcção dentro de cada experiência, os valores para o composto A e composto B são então ajustados. <table border="1"><tbody><tr><td> Executar # 1 </td><td> Adj. EAG (mV) </td><td> Executar # 2 </td><td> Adj. EAG (mV) </td><td> Executar # 3 </td><td> Adj. EAG (mV) </td></tr><tr><td> A Cmpnd </td><td> 1094 </td><td> A Cmpnd </td><td> 1054 </td><td> A Cmpnd </td><td> 1197 </td></tr><tr><td> Cmpnd B </td><td> 828 </td><td> Cmpnd B </td><td> 752 </td><td> Cmpnd B </td><td> 780 </td></tr></tbody></table> As médias (meios) para cada composto são então determinada, juntamente com outros dados estatísticos relevantes e as respostas EAG para os compostos testados pode então ser avaliadopara a candidatura para mais investigações. <table border="1"><tbody><tr><td> Composto </td><td> EAG (mV) </td><td> Não. Funciona, N = </td></tr><tr><td> A </td><td> 1115 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> B </td><td> 787 </td><td> 3 </td></tr></tbody></table><img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig1.jpg" /> Figura 1. EAG representativas para a resposta antenal do sexo masculino (1180 mV) para o controlo de pré-(1 r baforada controle positivo) que seria descartado devido à resposta antenal pobre depois de assegurar as antenas têm um bom contacto com o gel. Barras azuis nas janelas inferiores representam o sopro de duas segundo volátil. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig2.jpg" /> <s<html> trong&gt; Figura 2. EAG Representante para a resposta do sexo feminino antenal (3.400 mV) para o 1 º sopro de pré-controle, que seria considerado adequado. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig3.jpg" /> Figura 3. EAG Representante para a resposta do sexo feminino antenal (1.680 mV) para o posto de controle (controle positivo anterior para cada experimento) que possa ser considerada pobre, e sugestivo de antenas de degradação (&lt;75% de 1 º de controle pré-ou &lt; 2 nd valor sopro de pré-controle). Para este exemplo o 1 º sopro de pré-controle foi 2.730 mV e 2 º controle pré-sopro foi 2.350 mV. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . dflinebreak &quot;&gt; <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig4.jpg" /> Figura 4. Representativas EAG para a resposta feminina antenal (mV 3800) para a baforada de uma mistura candidata volátil e as medições subsequentes do deflexão máxima inicial (mV 3800), a inclinação inicial durante a duração de sopro (0,3 s/1.2 mV = 0,25 s / mV), ea inclinação para a duração de sopro remanescente (1,6 s/1.9 mV = 0,84 s / mV). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig4large.jpg" target="_blank">para ver figura maior</a> . <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig5.jpg" /> Figura 5. Vaso pequeno modificado contendo uma matriz de amostra e os voláteis associados a ser soprado através A. transitella antenas. <img alt="Tabela 1" src="/files/ftp_upload/3931/3931table1.jpg" /> Tabela 1. SITU emissão volátil de amêndoas nonpareil (2007) e as respostas EAG determinados por uma configuração diferente e menos sensível no programa Autospike. <img alt="Tabela 2" src="/files/ftp_upload/3931/3931table2.jpg" /> Tabela 2. Exemplo de uma forma para a gravação do sexo masculino e feminino respostas antenais para individuais componentes voláteis. <img alt="Tabela 3" src="/files/ftp_upload/3931/3931table3.jpg" /> Tabela 3. Exemplo de uma forma para a gravação do sexo masculino e feminino respostas antenais a misturas voláteis e / ou bouquets. <img alt="Tabela 4" src="/files/ftp_upload/3931/3931table4.jpg" /> Tabela 4. Exemplos de preparação de 10 mL de uma dose de 5 mg / ml de solução para duas diferentes proporções de misturas. <img alt="Tabela 5" src="/files/ftp_upload/3931/3931table5.jpg" /> Tabela 5. Exemplo de formulário para gravar duas conseqüênciaspuffs cutive de simples componentes voláteis através de antenas características de macho e fêmea.

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O autor tem uma pesquisa existente cooperativa e contrato de desenvolvimento com a Paramount Empresa Agropecuária, uma empresa com ligações com Suterra LLC.

Uso dos registos eletroantenogramas como um bioensaio para determinar as respostas quimiorecepção de um insecto alvo é bastante comum e numerosos estudos utilizando EAG como um detector para efluente de um cromatograma de gás (GC-EAD) podem ser encontradas na literatura. 9,10 O método demonstrado proporcionará uma triagem rápida de quantidades equivalentes de componentes voláteis, com repetições elevadas para atribuição confiante da capacidade de resposta relativa. O programa AutoSpike no software...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Acetofenona </td><td> Alfa-Aesar </td><td> A12727 </td><td> Controle positivo Feminino </td></tr><tr><td> (Z, Z) -11,13-hexadecadienal </td><td> Suterra </td><td></td><td> Controle positivo Masculino </td></tr><tr><td> α-humuleno </td><td> Aldrich </td><td> 53675 </td><td> Sesquiterpeno </td></tr><tr><td> 2-undecanona </td><td> Aldrich </td><td> U1303 </td><td> Derivado de ácido graxo </td></tr><tr><td> 2-feniletanol </td><td> Aldrich </td><td> 77861 </td><td> Benzenóide </td></tr><tr><td> Pentano </td><td> EMD </td><td> PX0167-1 </td><td> Solvente </td></tr><tr><td> 4-Channel controlador de aquisição </td><td> Syntech </td><td> EuDAC-4 </td><td></td></tr><tr><td> EAG sonda, pré-amplificador </td><td> Syntech </td><td> Tipo PRG-2 </td><td></td></tr><tr><td> Titular Antena </td><td> Syntech </td><td> Para PRG-2 </td><td> Eletrodo de Fork </td></tr><tr><td> Controlador de estímulo </td><td> Syntech </td><td> CS-55 </td><td> O fluxo de ar e puffs </td></tr><tr><td> Gel Eletrodo Spectra </td><td> Parker </td><td> 12-02 </td><td></td></tr><tr><td> Discos de bioensaios </td><td> Whatman </td><td> 2017-006 </td><td> 6 milímetros </td></tr><tr><td> Pipetas Pasteur </td><td> VWR </td><td> 14673-010 </td><td> 5 ¾ &quot;(14,6 cm) </td></tr><tr><td> Parafilm M </td><td> Bemis </td><td> PM-992 </td><td></td></tr></tbody></table>

electroantennographic bioassay as a screening tool for host plant volatiles

Voláteis de plantas desempenham um papel importante na interação planta-inseto. Insetos herbívoros usar voláteis de plantas, conhecidos como cairomônios, para localizar sua planta hospedeira. 1,2 Quando uma planta hospedeira é um dano de alimentação importante agronômico mercadoria por pragas de insetos podem causar sérios prejuízos econômicos aos produtores. Por conseguinte, cairomônios pode ser usado como atractivos para atrair ou confundir estes insectos e, assim, oferecem uma alternativa ambientalmente amigável para pesticidas para controlo de insectos. 3 Infelizmente, as plantas podem emitir um vasto número de voláteis com composições diferentes e os rácios de emissões dependentes da fenologia da mercadoria ou a hora do dia. Isto torna a identificação de componentes biologicamente ativos ou misturas de componentes voláteis um processo árduo. Para ajudar a identificar os componentes bioativos de emissões de voláteis de plantas hospedeiras que empregamos o laboratório baseado eletroantenografia bioensaio de triagem (EAG). EAG é uma ferramenta eficaz para avaliar e record eletrofisiologicamente as respostas olfativas de um inseto através de seus receptores antenais. O processo de triagem EAG pode ajudar a reduzir o número de produtos voláteis testados para identificar promissores componentes bioactivos. No entanto, bioensaios EAG apenas fornecer informações sobre a ativação dos receptores. Ele não fornece informações sobre o tipo do comportamento dos insetos do composto provoca, o que poderia ser como um tipo, atrativo repelente ou outra resposta comportamental. Voláteis que desencadeiem uma resposta significativa por EAG, em relação a um controle apropriado positivo, são normalmente tomadas para mais testes de respostas comportamentais da praga. O delineamento experimental apresentado irá detalhar a metodologia empregada para a tela à base de amêndoa voláteis de plantas hospedeiras 4,5 por medição das respostas eletrofisiológicas antenais de um adulto de insetos pragas umbigo orangeworm (Amyelois transitella) com os componentes isolados e misturas simples de componentes através de EAG bioensaio. O método utiliza dois exantenas cised colocado em um suporte de eletrodo de &quot;garfo&quot;. O protocolo demonstrado aqui apresenta uma resposta rápida, o método de alto rendimento padronizado para voláteis de triagem. Cada volátil é a um conjunto de montante, constante como para padronizar o nível de estímulo e, assim, permitir que as respostas antenais para ser indicativo da chemoreceptivity relativa. O controlo negativo ajuda a eliminar a resposta eletrofisiológica para tanto a força de solvente residual e mecânica do sopro. O controlo positivo (neste exemplo acetofenona) é um composto único que provocou uma resposta consistente de macho e fêmea traça umbigo orangeworm (SE). Um padrão semioquímicos adicional que proporciona uma resposta consistente e é utilizado para estudos de bioensaio com a traça Agora o macho é (Z, Z) -11,13-hexdecadienal, um componente de aldeído a partir da feromona do sexo feminino produzidos. 6-8

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Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Um método para rapidamente tela voláteis de plantas hospedeiras por medição da resposta electrofisiológica de orangeworm umbigo do adulto (<em&gt; Amyelois transitella</em&gt;) Antenas com os componentes isolados e misturas através de análise eletroantenográfica é demonstrada.

Bioensaio eletroantenográfica como uma ferramenta de triagem para voláteis da planta hospedeira

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.6K visualizações.  Agricultural Research Service. Um método para rapidamente tela voláteis de plantas hospedeiras por medição da resposta electrofisiológica de orangeworm umbigo do adulto ( Amyelois transitella) Antenas com os componentes isolados e misturas através de análise eletroantenográfica é demonstrada.

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A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative positive or negative regulators of cell death. In this system, N. benthamiana leaves are co-infiltrated with a 35S driven expression cassette containing the gene to be analyzed, and the GUS vector pCAMBIA 2301 using Agrobacterium strain LBA4404 as a vehicle. Because live cells are required for GUS expression to occur, loss of GUS activity is expected when this marker gene is co-expressed with positive regulators of cell death. Equally, increased GUS activity is observed when anti-apoptotic genes are used compared to the vector control. As shown below, we have successfully used this system in our lab to analyze both pro- and anti-death players. These include the plant anti-apoptotic Bcl-2 Associated athanoGene (BAG) family, as well as, known mammalian inducers of cell death, such as BAX. Additionally, we have used this system to analyze the death function of specific truncations within proteins, which could provide clues on the possible post-translational modification/activation of these proteins. Here, we present a rapid and sensitive plant based method, as an initial step in investigating the death function of specific genes.

A &#946;-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

Programmed cell death assays commonly used in mammalian systems such as DNA laddering or TUNEL assays, are often difficult to reproduce in plants. In combination with a GUS reporter system, we propose a rapid, plant based transient assay to analyze the potential death properties of specific genes.

A β-glucuronidase (GUS) Ensaio Baseado Morte celular

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

Biologia

Herbivore-induced Blueberry Volatiles and Intra-plant Signaling

Herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) are commonly emitted from plants after herbivore attack1,2. These HIPVs are mainly regulated by the defensive plant hormone jasmonic acid (JA) and its volatile derivative methyl jasmonate (MeJA)3,4,5. Over the past 3 decades researchers have documented that HIPVs can repel or attract herbivores, attract the natural enemies of herbivores, and in some cases they can induce or prime plant defenses prior to herbivore attack. In a recent paper6, I reported that feeding by gypsy moth caterpillars, exogenous MeJA application, and mechanical damage induce the emissions of volatiles from blueberry plants, albeit differently. In addition, blueberry branches respond to HIPVs emitted from neighboring branches of the same plant by increasing the levels of JA and resistance to herbivores (i.e., direct plant defenses), and by priming volatile emissions (i.e., indirect plant defenses). Similar findings have been reported recently for sagebrush7, poplar8, and lima beans9..
Here, I describe a push-pull method for collecting blueberry volatiles induced by herbivore (gypsy moth) feeding, exogenous MeJA application, and mechanical damage. The volatile collection unit consists of a 4 L volatile collection chamber, a 2-piece guillotine, an air delivery system that purifies incoming air, and a vacuum system connected to a trap filled with Super-Q adsorbent to collect volatiles5,6,10. Volatiles collected in Super-Q traps are eluted with dichloromethane and then separated and quantified using Gas Chromatography (GC). This volatile collection method was used n my study6 to investigate the volatile response of undamaged branches to exposure to volatiles from herbivore-damaged branches within blueberry plants. These methods are described here. Briefly, undamaged blueberry branches are exposed to HIPVs from neighboring branches within the same plant. Using the same techniques described above, volatiles emitted from branches after exposure to HIPVs are collected and analyzed.

A push-pull method for collecting plant volatiles is described. The method allows for a comparison of volatiles induced by herbivore feeding, exogenous methyl jasmonate, and mechanical damage. This technique is also used to investigate the volatile response of undamaged branches to exposure to volatiles from herbivore-damaged branches within blueberry plants.

Herbívoro induzida Voláteis Blueberry e planta-Intra Sinalização

Herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) are commonly emitted from plants after herbivore attack1,2.  These HIPVs are mainly regulated by the defensive ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

Microscopia de fluorescência de Triagem e seqüenciamento da próxima geração: Ferramentas úteis para a identificação de genes envolvidos na integridade das Organelas

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Usando Seqüência de Detenção SECM como uma ferramenta para isolar Ribossomos Polipeptídeos encadernados

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been made in identifying the components of the editosome complex that catalyze RNA editing. However, it is still not clear how those proteins work together. Chemical compounds obtained from a high-throughput screen against the editosome may block or affect one or more steps in the editing cycle. Therefore, the identification of new chemical compounds will generate valuable molecular probes for dissecting the editosome function and assembly. In previous studies, in vitro editing assays were carried out using radio-labeled RNA. These assays are time consuming, inefficient and unsuitable for high-throughput purposes. Here, a homogenous fluorescence-based &#8220;mix and measure&#8221; hammerhead ribozyme in vitro reporter assay to monitor RNA editing, is presented. Only as a consequence of RNA editing of the hammerhead ribozyme a fluorescence resonance energy transfer (FRET) oligoribonucleotide substrate undergoes cleavage. This in turn results in separation of the fluorophore from the quencher thereby producing a signal. In contrast, when the editosome function is inhibited, the fluorescence signal will be quenched. This is a highly sensitive and simple assay that should be generally applicable to monitor in vitro RNA editing or high throughput screening of chemicals that can inhibit the editosome function.

A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.

RNA Catalisador como repórter para Triagem Drogas contra edição de RNA em Tripanossomas

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.

A Bioensaio simples para a avaliação dos fatores de crescimento endotelial vascular

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

assistida por laser Microdissecção (LAM) como ferramenta para transcricional Profiling de tipos de células individuais

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

A Plate Competition Assay As a Quick Preliminary Assessment of Disease Suppression

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against soilborne fungus Rhizoctonia solani. R. solani is a pathogen of a wide range of plant hosts worldwide. The fungus survives in soils as a saprophyte and grows rapidly on simple water agar media. The plate assay is a rapid method to compare composts for their ability to slow the growth of R. solani. The assay also correlates well with suppression of other soilborne fungal pathogens that survive as saprophytes in soils such as Alternaria early blights, Fusarium wilt, Phytophthora root rot, and Pythium root rot.

Presented is a protocol for a plate competition assay to identify whether a specific compost is likely to contain bacteria and fungi that suppress growth of Rhizoctonia solani.

Um ensaio de competição de placa como uma rápida avaliação preliminar de supressão da doença

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against ...

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Inferring the function of genes by manipulating their activity is an essential tool for understanding the genetic underpinnings of most biological processes. Advances in molecular microbiology have seen the emergence of diverse mutagenesis techniques for the manipulation of genes. Among them, transposon-insertion sequencing (Tn-seq) is a valuable tool to simultaneously assess the functionality of many candidate genes in an untargeted way. The technique has been key to identify&#160;molecular mechanisms for the colonization of eukaryotic hosts in several pathogenic microbes and a few beneficial symbionts.
Here, Tn-seq is established as a method to identify colonization factors in a mutualistic Burkholderia gladioli symbiont of the beetle Lagria villosa. By conjugation, Tn5 transposon-mediated insertion of an antibiotic-resistance cassette is&#160;carried out at random genomic locations in B. gladioli. To identify the effect of gene disruptions on the ability of the bacteria to colonize the beetle host, the generated B. gladioli transposon-mutant library is inoculated on the beetle eggs, while a control is grown in vitro in a liquid culture medium. After allowing sufficient time for colonization, DNA is extracted from the in vivo and in vitro grown libraries. Following a DNA library preparation protocol, the DNA samples are prepared for transposon-insertion sequencing. DNA fragments that contain the transposon-insert edge and flanking bacterial DNA are selected, and the mutation sites are determined by sequencing away from the transposon-insert edge. Finally, by analyzing and comparing the frequencies of each mutant between the in vivo and in vitro libraries, the importance of specific symbiont genes during beetle colonization can be predicted.