EMS foi apoiado por bolsas de Institutos Nacionais de Saúde (NIH) [número de concessão R01HL120919]; a American Heart Association [número de concessão 10SDG4350046]; Universidade de Rochester prêmio CTSA do NIH [número de concessão UL1 TR000042]; e os fundos de inicialização do Aab CVRI. MAT foi apoiado em parte por uma bolsa para a Universidade de Rochester Faculdade de Medicina e Odontologia da Med Into--Grad Iniciativa Howard Hughes Medical Institute; e um Prêmio de Serviço Institucional Ruth L. Kirschstein Nacional de Pesquisa do NIH [número de concessão GM068411].

NOTA: Todas as experiências com camundongos foram aprovados pelo Comitê da Universidade de Recursos Animais da Universidade de Rochester. 1. epicárdica Conseqüência Cultura Ensaio (Figura 1A) <ol><li> preparativos <ol><li> Prepare 5 ml de meio A para o isolamento de células do epicárdio primária suplementando o meio 199 (M199) com 5% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina (Pen / Strep). </li><li> Pré-aquecido meio A e 100 mL de Hanks Solução Salina Equilibrada (SSHE) num banho de água a 37 ° C. </li><li> Permitir lâminas de câmara revestidas com colagénio a aquecer até à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Adicionar 100 ul de meio A a cada poço da câmara de corrediça e rodar cuidadosamente para revestimento uniformemente a superfície do colagénio. Repita o procedimento para 8-12 poços. Remova a mídia depois de câmaras de revestimento. </li><li> Aliquota pré-aquecido HBSS em duas placas de 10 cm2 contendo 50 ml de cada vez de HBSS. </li></ol></li><li> Isolar embrionárias Corações de Dam gravida em 11,5 dias post coitum (DPC).30 <ol><li> Anestesiar rato com 0,5 mL de 13 mg / ml de cetamina / 0,88 mg / ml de cocktail de xilazina em 1x de Dulbecco tamponada com fosfato salino (DPBS) através de injecção intraperitoneal. Confirmar anesthetization adequada usando um teste toe pitada. Uma pitada suave é suficiente para determinar se o mouse é sensível. Qualquer movimento ou pata retirar indica que o animal não está suficientemente anestesiados para fazer a cirurgia. Eutanásia por deslocamento cervical. </li><li> Coloque o rato que enfrenta o lado ventral para cima e pulverizar o abdômen com 70% de etanol para reduzir a contaminação pelo cabelo. </li><li> Comprimir a pele com uma pinça e cortar uma incisão lateral no abdômen com uma tesoura cirúrgica. Segure a pele firmemente e puxe para além de indicações para a cabeça ea cauda de oposição. </li><li> Comprima o peritoneu com uma pinça e cortado com uma tesoura para expor a cavidade abdominal. </li><li> Remova cuidadosamente a decídua cortando ao longo da mesométrio. Transferir a decidua dissecados para pré-aquecido HBSS no primeiro10 cm 2 prato. </li><li> Separe a decídua pelo corte entre embriões. </li><li> Transferir um embrião para a segunda placa de 10 cm2 com HBSS pré-aquecido sob um microscópio de dissecação. Remova cuidadosamente o tecido e saco vitelino extraembryonic, então decapitar o embrião. </li><li> Beliscar a parede torácica com uma pinça e rasgar o tecido distante na linha média, expondo a cavidade torácica. </li><li> Coloque a pinça por trás do coração. Segure a via de saída e puxe o coração longe do embrião. Separar o trato pulmonar e pulmões do coração, se ainda ligado. </li></ol></li><li> Transferir o coração a um único poço da lâmina revestida de colagénio e coloque-o lado dorsal para baixo (Figura 1B). Repetir passos 1.2.7-1.3 para cada embrião. </li><li> Uma vez que todos os corações foram transferidas para poços individuais, incubar a corrediça câmara durante 30 min a 37 ° C, 5% de CO2 para permitir a adesão suficiente para a matriz de colagénio. </li><li> cuidadosamente adicionar20-50 mL de pré-aquecido meio de explante A volta de cada coração. Importante: Não adicione o meio demasiado depressa ou a um nível acima do coração, caso contrário corações pode soltar-se o substrato de colágeno. </li><li> Cultura os corações a 37 ° C, 5% de CO 2 durante cerca de 24 h, para permitir crescimento do epicárdio. Nota: excrescências podem ser observadas tão cedo quanto 3-4 horas de cultura (Figura 1C) e consiste principalmente de células de mesotélio que exibem morfologia de paralelepípedo, com a contaminação de células mesenquimais mínima (Figuras 1D, E). Os resultados representativos foram adquiridos utilizando um microscópio de dissecção equipado com uma câmara. </li></ol> 2. A ablação genética e indução de EMT em epicárdicas excrescências Cuidado: Pega adenovírus com cuidado de acordo com as diretrizes de biossegurança aprovados. <ol><li> Preparar 15 ml de meio B (M199 suplementado com 1% FBS e 1% de Pen / Strep) e pré-aquecido a 37 ° C num banho de água. </li><li> Para excisãoalelos floxed, prepare explante meio B suplementado com 2,5 x 10 4 ufc / ml de adenovírus que expressam Cre recombinase (Ad / CRE) ou vírus controle. Nota: sobreexpressão mediada adenoviral de genes candidatos pode também ser levada a cabo para avaliar o ganho de fenótipos funcionais. títulos virais deve ser determinada pelo utilizador final. </li><li> Remova cuidadosamente corações empobrecido-epicárdio de culturas de crescimento usando uma pinça. corações de transferência para tubos de 1,5 ml com 800 ul de Trizol e armazenar a -80 ° C para posterior isolamento do ARN e análise de expressão génica. </li><li> Lavar cada poço com DPBS para eliminar as células do sangue e excesso de detritos celulares. </li><li> Adicionar 500 ul de explante meio B, suplementado com adenovírus (es) a cada cultura de crescimento e incubar durante 24 horas a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Para a indução de EMT, remova o material e encher com 37 ° C explante meio B, suplementado com factor de crescimento de transformação recombinante (TGF) -β1 [10 ng / ml] ou veículo (h 4mMácido ydrochloric (HCl) contendo 1 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA)). Explantes de cultura para uma 24 horas adicionais a 37 ° C, 5% de CO 2. Proceda com gene / proteína analisa expressão ou imunocitoquímica, conforme detalhado nos protocolos subsequentes. Nota: A indução de EMT epicárdica foi estimulada com várias concentrações de TGF-β1 variando de 0,5 ng / mL - 10 ng / ml 26,31-33. Concentrações mais elevadas de ligando pode resultar na ligação não específica a todos os receptores de TGF-β. A concentração de TGF-β1 deve refletir os objetivos experimentais específicos. </li></ol> Análise Expression 3. Gene de epicárdicas excrescências <ol><li> corações empobrecido-epicárdio descongelamento previamente armazenadas em Trizol (2.2). </li><li> Aspirar meios de culturas EPDC e lavar duas vezes com DPBS. </li><li> Adicionar 800 mL Trizol temperatura ambiente para explante culturas. </li><li> Incubar corações empobrecido-epicárdio e culturas EPDC em Trizol por 5 min a temperatu quarto<html> ré. Pipeta cima e para baixo dez vezes para homogeneizar a amostra lisadas. Nota: Os corações pode exigir mais de pipetagem para homogeneizar completamente. </li><li> Transferir os lisados ​​para tubos de 1,5 ml e completar o isolamento de RNA total acordo com as instruções do fabricante. Adicionam-se 10 ug de glicogénio antes da precipitação para aumentar o rendimento de ARN. Um explante dado irá produzir cerca de 0,5-1,0 ug de ARN. </li><li> Remover o ADN contaminante, com a ADNase I e a transcrição reversa mRNA de 0,5 ug acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Validar a pureza de explantes e / ou indução de EMT com transcrição reversa quantitativa do epicárdio (qRT) -PCR 34 utilizando SYBR Green e os marcadores descritos na Tabela 1. Os níveis de ARNm Normalizar a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) e calcular a expressão relativa usando o 2 - método ΔΔCt 35. Os resultados típicos são mostrados na Figura 2A. </li></ol>title &quot;&gt; 4. análise de proteínas de epicárdicas excrescências <ol><li> Aspirar meios de culturas EPDC e lavar duas vezes com DPBS. </li><li> Adicionar 10 ul de tampão de lise proteína arrefecido com gelo (Tris 50 mM, pH 7,5, cloreto de sódio 150 mM, 1 mM de ácido etilenodiaminotetraacético pH 8,0, 1% de Triton X-100, cocktail 1x inibidor da protease) a cada câmara bem e coloque a lâmina Secção de gelo. Cortar cerca de ¼ do fundo em uma ponta da pipeta P200 e usar a parte restante para raspar as células fora do slide. Pipeta cima e para baixo para as células do epicárdio lisar e transferência para um tubo de 1,5 ml. </li><li> Sonicate explantes lisadas em baixa (160 W) durante 5 min em um banho de água gelada com 30 ciclos seg ON e OFF. </li><li> Centrifugar os lisados ​​durante 10 minutos a 10000 xg, 4 ° C. Transferir o sobrenadante para um tubo fresco e determinar a concentração de proteína utilizando um ensaio de proteína de 36. Nota: A explante dada vai render até 1,5 ug de proteína total. Descobrimos que pooling explantes de dois corações umd carga de proteína de 2 ug por poço é suficiente para detectar o músculo liso α-actina (ACTA2) e GAPDH 9. A detecção de outras proteínas alvo podem exigir reunindo múltiplas amostras de explante tal como determinado pelo utilizador final. </li></ol> 5. Imunocitoquï¿½ica de epicárdicas excrescências <ol><li> Remova a mídia da cultura de explantes e lavar duas vezes com DPBS. </li><li> Suavemente adicionar 500 uL de paraformaldeído a 4% (v / v) ou de metanol arrefecido em gelo a cada poço e corrigir explantes durante 5 min à temperatura ambiente ou 10 min a -20 ° C, respectivamente. Fix acordo com as especificações de anticorpo, tal como recomendado pelo fabricante. </li><li> Remover fixador e lavar cada poço com DPBS três vezes durante 5 min. </li><li> Permeabilizar as células com 500 ul de 0,1% (v / v) de Triton X-100 em DPBS durante 5 min. </li><li> Remoção da solução de permeabilização e enxaguar com DPBS três vezes por 5 min. </li><li> Bloquear as células com soro a 10% em DPBS durante 30 minutos à temperatu quartoré. </li><li> Continuar com coloração de anticorpo primário acordo com as recomendações do fabricante e as condições óptimas como determinado pelo utilizador final. </li><li> Remoção da solução de anticorpo e lavar com DPBS três vezes durante 5 min. </li><li> Aplicar anticorpo secundário por instruções do fabricante e contrastante com um corante nuclear apropriado. </li><li> Remoção da solução de anticorpo e lavar com DPBS três vezes durante 5 min. </li><li> Remover paredes deslizantes câmara de acordo com as instruções do fabricante e adicionar meio de montagem aquoso directamente para as células. Coloque uma lamela sobre as células e selar com unha polonês. Os resultados típicos são mostrados na Figura 2B - 2D utilizando microscopia confocal invertido. </li></ol> 6. Cultura Ensaio Ex Vivo (Figura 3A) <ol><li> preparativos <ol><li> Preparar 12 ml de meio de cultura ex vivo usando um (1: 1) mistura de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM): M199 suplementado com 10%FBS e 1% de Pen / Strep. </li><li> Em um banho de água a 37 ° C, pré-aquecido ex vivo meio de cultura e 100 ml de HBSS. </li><li> Alíquotas de 1 ml meio de pré-aquecida em 8-12 poços de uma placa de 24 poços. </li><li> Transferência de HBSS pré-aquecido a duas 2 placas de 10 cm, contendo 50 ml de cada vez. </li></ol></li><li> Isolar rato corações embrionárias em HBSS (como descrito em 1.2) a partir de vacas prenhes em 12,5 dpc. </li><li> Transferir cada coração para um único poço da placa de 24 poços contendo meio de cultura ex vivo. Incubar a placa a 37 ° C, 5% de CO2 com agitação suave manualmente ou utilizando uma plataforma de agitação para evitar a adesão. proceder imediatamente para o passo 7.1. </li></ol> 7. Epicárdica Labeling e EMT Indução em culturas ex vivo <ol><li> Para identificar o epicárdio, prepare-se 12 ml de meio de cultura C 37 ° ex vivo suplementado com 3,0 x 10 6 ufc / ml de Ad / GFP. Para ablação direccionada de alelos floxed, transferência de 6 ml de umad / GFP suplementado meio de cultura para um novo tubo de 15 ml. Adicionar Ad / Cre ou controlar adenovírus a uma concentração final de 1,5 x 10 6 pfu / ml. Nota: O ganho de função análises também pode ser levada a cabo com a entrega de genes mediada por adenovírus apropriado. </li><li> Cuidadosamente remover o meio de cultura de cada poço da placa de 24 poços utilizando uma ponta de pipeta P1,000. </li><li> Adicionar cuidadosamente meio de cultura suplementado com adenovírus (es) a cada poço. </li><li> Incubar a placa a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 24 horas com agitação suave. </li><li> Para a indução de EMT, preparar 12 ml de 37 ° C ex vivo meio de cultura contendo 10 ng / ml de TGF-β1 e ml de factor de crescimento de 20 ng / derivado de plaquetas (PDGF) ou -BB veículo (HCl 4 mM contendo 1 mg / ml de BSA ). </li><li> Cuidadosamente remover o meio de cultura de cada poço da placa de 24 poços utilizando uma ponta de pipeta P1,000. Lave os corações com 1 ml de DPBS. </li><li> Retire os DPBS e encher os corações com a cultura ex vivo medium contendo TGF-β1 e PDGF-BB ou veículo. </li><li> Incubar durante 24 horas a 37 ° C, 5% de CO2 com agitação suave. </li></ol> 8. A crioconservação e imuno-histoquímica de culturas ex vivo <ol><li> Preparar os corações para a criopreservação. <ol><li> Remover o meio de cultura e lava-se duas vezes com corações DPBS arrefecido com gelo. </li><li> Adicionar 1 mL de 4% (v / v) de paraformaldeído a cada coração e fixar durante 2 horas a 4 ° C com agitação suave. </li><li> Remover o fixador e lava-se duas vezes com DPBS corações. Transferir os corações para poços frescas com 1 ml de 10% (w / v) de sacarose preparado em DPBS. Incubar a placa durante a noite a 4 ° C com agitação suave. </li><li> transferir cuidadosamente corações para novos poços com 18% (w / v) de sacarose preparado em DPBS. Incubar a placa durante a noite a 4 ° C com agitação suave. </li><li> Transferir cada coração a uma cryomold contendo meio de congelamento de tecidos. congelar imediatamente blocos usando azoto líquido e armazenar a -80 &amp; #176; C. </li></ol></li><li> Seção corações em 5 mm, utilizando um criostato e colocar secções de tecido em lâminas de microscópio carregados positivamente. Loja desliza a -80 ° C até à coloração. </li><li> Realizar imuno-histoquímica em secções de detecção da membrana basal sub-epicárdico. <ol><li> Descongelar as lâminas durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Reidratar as seções por lavagem duas vezes em DPBS durante 5 minutos com balanço suave. </li><li> secção permeabilizar com 0,1% (v / v) de Triton X-100 em PBS durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as lâminas duas vezes em DPBS durante 5 minutos com balanço suave. </li><li> Seque o DPBS excesso e definir a região de coloração com uma caneta rotulagem hidrofóbica. secções de bloco com soro a 10% em DPBS durante 30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Remova o bloco e aplicar anticorpo colágeno tipo IV (ColIV, 1: 200) diluído em bloco. Incubar durante a noite a 4 ° C numa câmara com humidade controlada. </li><li> Lavam-se as lâminas três vezes em DPBS durante5 min com balanço suave. </li><li> Dilui-se o anticorpo secundário conjugado com fluorescência (1: 500) e DAPI (1: 5000) em DPBS e aplicam-se as lâminas. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente. Escolha um anticorpo secundário apropriado com um comprimento de onda de emissão e de excitação distinta da GFP. </li><li> Lavam-se as lâminas três vezes em PBS durante 5 min com agitação suave. Mount slides com meio de montagem. </li></ol></li></ol> 9. Imagem e Quantificação de culturas ex vivo <ol><li> Ter uma imagem de usuário cego e quantificar secções coradas. Imagem pelo menos cinco secções de tecido não-consecutivos de um dado coração em 4-5 locais arbitrários ao longo do epicárdio (extremidade do coração), utilizando um microscópio de fluorescência confocal ou na 40X. Os resultados típicos são mostrados na Figura 3B usando microscopia confocal invertido. </li><li> contagem manual do número total de células positivas para GFP em uma dada imagem. Identificar migrando EPDC como GFP pocélulas sitive localizados dentro ou fora da membrana basal subepicárdico ColIV. Determinar a percentagem de migração de células de GFP, como o número de células positivas para GFP migrar sobre o número total de células positivas para GFP em uma dada imagem. Os resultados típicos são mostrados na Figura 3C-D, utilizando microscopia confocal invertido. </li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui destacamos métodos detalhados para isolar células do epicárdio primária por conseqüência e controlar a migração EPDC em ex vivo culturas cardíacos. Para as culturas conseqüência, o tempo apropriado para remover o coração empobrecido-epicárdio varia ligeiramente entre os experimentos. A monitorização periódica dos explantes após uma incubação durante a noite é recomendado para avaliar a extensão da excrescência do epicárdio e para extrair o coração diante de fibroblastos aparecer. ...

O epicárdio é uma única camada de células mesoteliais que reveste o coração e impactos cardíaca desenvolvimento, maturação e reparação. Através de uma troca altamente coordenada de sinais parácrinos, o diálogo íntimo entre o miocárdio e epicárdio é indispensável para o crescimento cardíaco e a formação de não-miócitos cardíacos linhagens 1. Células derivadas de epicárdio (EPDC) emergir a partir de um subconjunto de células do epicárdio através de um epitelial-a-mesenquimal transição (EMT) 2, invadem o espaço subepicárdico e miocárdio subjacente, e se diferenciam em grande parte, em células murais vasculares coronárias e fibroblastos cardíacos, e para uma menor extensão, células endoteliais e cardiomiócitos 3-9. Os mecanismos que regulam EMT epicárdico e EPDC invasão têm sido atribuídas à acção coordenada de vários ligandos, incluindo as moléculas segregadas 10-13, receptores da superfície das células e moléculas de adesão, 14,15 mentoLators de polaridade apical-basal, 16,17, 18,19 GTPases pequenas, e factores de transcrição 2,20,21. Enquanto muitos dos efectores moleculares de migração EPDC ter sido definida, uma melhor compreensão dos sinais fisiológicos que estimulam EPDC mobilização no embrião pode acelerar o desenvolvimento de estratégias para manipular este processo no adulto para melhorar a reparação cardíaca. Estudos destinadas a identificação de novos reguladores de EPDC mobilização dependem de purificação desta população de células ou traçando a migração de células do epicárdio individuais. Um ou uma combinação de genes marcadores, incluindo WT1, Tcf21, Tbx18, e / ou ALDH1A2, é vulgarmente utilizada para identificar o epicárdio fetal 1. No entanto, a utilização destes marcadores para controlar a migração EPDC não é óptima quanto a expressão de marcadores do epicárdio diminui ao longo do desenvolvimento do coração e é muitas vezes perdida quando as células do epicárdio submetidos a transdifdiferen- em células mesenquimais. A aplicação do sistema Cre / loxP, em conjunto com os repórteres de rastreamento de linhagem, tem sido útil na rotulagem permanentemente o epicárdio e seus descendentes durante o desenvolvimento do coração e após a lesão isquêmica no adulto 7,22,23. Várias linhas de Cre-restrito do epicárdio foram geradas e são amplamente usadas para rotular EPDC e para o gene condicional estratégias de exclusão 1. Estes estudos levaram à caracterização de várias linhagens do epicárdio, e a identificação de mediadores críticos de EPDC motilidade e diferenciação. No entanto, evidências acumuladas também sugere o epicárdio é uma população heterogênea de células progenitoras 4,24,25. Deste modo, apenas um subconjunto de células do epicárdio vai ser alvo utilizando um determinado condutor de Cre. A fim de marcar todo o epicárdio independentemente da especificidade de Cre, um número de laboratórios utilizaram cul excrescênciasistemas tura ou ex vivo métodos de cultura de órgão para isolar fielmente ou marcar as células do epicárdio sem depender da expressão genética de uma linhagem marcadores 26-28. Para ex vivo estudos de migração, corações embrionárias são isoladas antes da EMT epicárdio e cultivadas em meio suplementado com uma proteína verde fluorescente (GFP) -expressing adenovirus (Ad / GFP) 9,18. Esta abordagem permite a marcação eficiente de todo o epicárdio ao invés de um subconjunto de células, a recombinação mediada por Cre. Culturas cardíacos são subsequentemente expostas a indutores conhecidos de EMT para estimular a mobilização de EPDC 28,29. Ex vivo e in vivo são complementadas por análises in vitro Culturas de explantes do epicárdio, que são uma abordagem particularmente útil para explorar mecanismos detalhados condução migração EPDC. Aqui, descrevemos métodos para isolar as células do epicárdio primárias para estudos in vitro de epicardiai EMT, bem como um sistema de cultura de órgãos ex vivo para análises de EPDC motilidade. Recentemente, demonstrou a utilidade e robustez deste método pelo geneticamente modulando o factor relacionado com myocardin transcrição (MRTF) / factor de resposta do soro (SRF) eixo sinalização para manipular a migração baseado em actina de EPDC 9. Enquanto nossos resultados destacam uma via de sinalização necessária para regular a migração EPDC, estes métodos são adequados para desvendar os mecanismos que coletivamente orquestram a migração EPDC e diferenciação. Além disso, o ex vivo sistemas de cultura de explante e poderia ser implementado em telas funcionais para identificar novos reguladores de EPDC mobilização para aplicações terapêuticas em regeneração cardíaca.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="751">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone&#160;</td>
			<td style="width:141px;">SH3002201</td>
			<td style="width:203px;">DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone</td>
			<td style="width:141px;">SH3003102</td>
			<td style="width:203px;">HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Medium 199</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone</td>
			<td style="width:141px;">SH3025301</td>
			<td style="width:203px;">M199</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone</td>
			<td style="width:141px;">SH3002802</td>
			<td style="width:203px;">DPBS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Gemini&#160;</td>
			<td style="width:141px;">100-106</td>
			<td style="width:203px;">FBS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Penicillin/Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone</td>
			<td style="width:141px;">SV30010</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture Slides</td>
			<td style="width:163px;">Corning</td>
			<td style="width:141px;">354557</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Multiwell 24-well plates</td>
			<td style="width:163px;">Falcon</td>
			<td style="width:141px;">08-772-1</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:163px;">Leica</td>
			<td style="width:141px;">M50</td>
			<td style="width:203px;">Equipped with Leica KL300 LED might source</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:244px;">Confocal miscroscope</td>
			<td style="width:163px;">Olympus</td>
			<td style="width:141px;">1X81</td>
			<td style="width:203px;">Equipped with muli-argon laser 405/488/515, FV10-MCPSU laser 405/440/635, 559 laser, and mercury lamp</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Bioruptor</td>
			<td style="width:163px;">Diagenode&#160;</td>
			<td style="width:141px;">UCD-200</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Transforming growth factor beta 1</td>
			<td style="width:163px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:141px;">100-B-001</td>
			<td style="width:203px;">TGF-&#946;1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Platelet-derived growth factor BB</td>
			<td style="width:163px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:141px;">220-BB-010</td>
			<td style="width:203px;">PDGF-BB</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Trizol Reagent</td>
			<td style="width:163px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:141px;">15596-026</td>
			<td style="width:203px;">Caution, hazardous material</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">AM1907</td>
			<td style="width:203px;">DNaseI</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:163px;">BioRad</td>
			<td style="width:141px;">1708891</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">UltraPure Glycogen</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">10814-010</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">SYBR Green</td>
			<td style="width:163px;">BioRad</td>
			<td style="width:141px;">170-8880</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Protease inhibtor cocktail tablets</td>
			<td style="width:163px;">Roche</td>
			<td style="width:141px;">11836170001</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Alexa Goat-anti-rabbit 488</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">A11008</td>
			<td style="width:203px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Alexa Goat anti-rabbit 594</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">A-11012</td>
			<td style="width:203px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Alexa Goat anti-mouse 594</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">A-11005</td>
			<td style="width:203px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Mouse anti-smooth muscle alpha actin, Cy3-conjugated&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:141px;">C6198</td>
			<td style="width:203px;">monoclonal antibody, clone 1A4</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Mouse anti-Wilms tumor 1 (WT1)</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td>MA1-46028</td>
			<td style="width:203px;">monoclonal antibody, clone 6F-H2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Rabbit anti-ZO1</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td>40-2200</td>
			<td style="width:203px;">polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Rabbit anti-Collagen Type 4</td>
			<td style="width:163px;">Millipore</td>
			<td style="width:141px;">AB756P</td>
			<td style="width:203px;">polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">D1306</td>
			<td style="width:203px;">DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Fluorescent mounting medium&#160;</td>
			<td style="width:163px;">DAKO</td>
			<td style="width:141px;">S3023</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">16% Paraformaldehyde solution</td>
			<td style="width:163px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:141px;">15710</td>
			<td style="width:203px;">PFA diluted to 4% in DPBS. Caution, hazardous material</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Sucrose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:141px;">S0389</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td style="width:163px;">Triangle Biomedical Sciences</td>
			<td style="width:141px;">TFM-B</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Pap pen</td>
			<td style="width:163px;">DAKO</td>
			<td style="width:141px;">S2002</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Disposable mictrotome blades&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Sakura Finetek</td>
			<td style="width:141px;">4689</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:163px;">Globe Scientific</td>
			<td style="width:141px;">1358W</td>
			<td style="width:203px;">positively charged, 25 x 75 x 1mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Cryostat&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Leica</td>
			<td style="width:141px;">CM1950</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Forceps</td>
			<td style="width:163px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:141px;">11295-00</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:163px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:141px;">91460-11</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Disposable base molds</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:141px;">22-363-553</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Ketamine</td>
			<td style="width:163px;">Hospira</td>
			<td>NDC 0409-2051-05</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Xylazine</td>
			<td style="width:163px;">Akorn</td>
			<td>NADA 139-236</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epicardial outgrowth culture assay and ex vivo assessment of epicardial-derived cell migration

Uma única camada de linhas de células do epicárdio do coração, proporcionando factores parácrinos que estimulam a proliferação de cardiomiócitos e que contribui directamente progenitores cardiovasculares durante o desenvolvimento e a doença. Embora um certo número de factores têm sido implicados na célula (EPDC) mobilização derivado do epicárdio, os mecanismos que regem a sua migração e diferenciação subsequente são mal compreendidos. Aqui, apresentamos in vitro e as estratégias ex vivo para estudar EPDC motilidade e diferenciação. Em primeiro lugar, descreve-se um método de obtenção de células do epicárdio primárias por cultura excrescência do coração embrionário do rato. Nós também introduzir um protocolo detalhado para avaliar a migração tridimensional de EPDC marcado num sistema de cultura de órgãos. Nós fornecemos provas usando essas técnicas que deleção genética dos fatores de transcrição relacionados com myocardin no epicárdio atenua a migração EPDC. Esta abordagem serve como uma plataforma para avaliar modificadores candidatos da EPDCbiologia e pode ser utilizado para desenvolver telas genéticos ou químicas para identificar novos reguladores de EPDC mobilização que possam ser úteis para a reparação cardíaca.

O epicárdio pode ser eficazmente isolados utilizando um ensaio de cultura de crescimento, tirando partido da sua localização exterior e explorando a plasticidade do desenvolvimento e do comportamento migratório intrínseca de EPDC. Corações embrionárias murinas são isolados em E11.5 antes EMT epicárdico e o lado dorsal para baixo cultivadas em lâminas de câmaras revestidas com colagénio 26 (Figura 1A, B). corações explantados continuará a se con...

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Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epicárdio Conseqüência Cultura Ensaio e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Avaliação da migração celular Epicárdica derivado

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

epicardial-outgrowth-culture-assay-ex-vivo-assessment-epicardial

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

8.2K visualizações.  University of Rochester School of Medicine and Dentistry. Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility. 

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Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Ex Utero Eletroporação e Organotípicas Cultura Slice of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Biologia do Desenvolvimento

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Avaliação da migração de células endoteliais após a exposição a produtos químicos tóxicos

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head and heart progenitor cell development with pharyngeal arches (also known as branchial arches) ex vivo. Using this method, we have recently described that the second pharyngeal arch contains self-renewing heart progenitors and serves as a microenvironment for expansion of the progenitors during mouse heart development. The progenitor cells remain undifferentiated and expansive inside the arch, but quickly become functional cardiomyocytes as they migrate out of the arch. We also reported that first pharyngeal arch contains muscle progenitors giving rise to myotubes after leaving the arch. Here, we demonstrate the procedure for the dissection and ex vivo culture of first and second pharyngeal arches from developing mouse embryos. The method enables one to study head and heart progenitor/muscle development, including cardiomyocyte and myotube formation in detail ex vivo.

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

Ex Cultura Vivo de Pharyngeal Arcos para estudo do coração e do músculo Progenitores e seu nicho

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells&#8217; native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens1. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

Estabelecimento de um clinicamente relevantes<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock Cataract Surgery Modelo para investigar Epithelial Wound Repair em um microambiente Native

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying neuronal proliferation and differentiation. In addition, evolutionary modifications of its proliferative capability have been responsible for the dramatic expansion of cerebellar size in the amniotes, making the cerebellum an excellent model for evo-devo studies of the vertebrate brain. The constituent cells of the EGL, cerebellar granule progenitors, also represent a significant cell of origin for medulloblastoma, the most prevalent paediatric neuronal tumour. Following transit amplification, granule precursors migrate radially into the internal granular layer of the cerebellum where they represent the largest neuronal population in the mature mammalian brain. In chick, the peak of EGL proliferation occurs towards the end of the second week of gestation. In order to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation, we have developed a method for genetic manipulation through ex vivo electroporation of cerebellum slices from embryonic Day 14 chick embryos. This method recapitulates several important aspects of in vivo granule neuron development and will be useful in generating a thorough understanding of cerebellar granule cell proliferation and differentiation, and thus of cerebellum development, evolution and disease.

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer is the site of the largest transit amplification in the developing brain. Here, we present a protocol to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation using ex vivo electroporation and culture of cerebellar slices from embryonic Day 14 chick embryos.

Ex Cultura Vivo de Pintainho Cerebelar Slices e voltadas para o espaço Eletroporação do grânulo precursores de células

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analisando<em&gt; In Vivo</em&gt; Migração celular usando transplantes de células e de imagem Time-lapse em embriões Zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Produção em larga escala de cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas utilizando um altamente reprodutível pequeno-Based Molecule Protocolo de Diferenciação

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

O isolamento e a cultura de células primárias de Epicárdica derivado de espécimes de coração adulto e Fetal humano

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

Visualização da migração celular tangencial no desenvolvimento Tectum óptica de Chick

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An assay is described here to perfuse an isolated rat placenta and evaluate the maternal-to-fetal translocation of xenobiotics ex vivo. In addition, the evaluation of physiological processes such as fluid flow to the fetus and placental metabolism may be conducted with this methodology. This technique is suitable for evaluating maternal-to-fetal kinetics of pharmaceutical candidates or environmental contaminants. In contrast to current alternative approaches, this methodology allows the evaluation of the isolated maternal-fetal vasculature, with the systemic neural or immune involvement removed, allowing any observed changes in physiological function to be attributable to local factors within the isolated tissue.

Here is presented a protocol of ex vivo maternal-fetal vascular perfusion to enable the administration of a test article into maternal vasculature and to evaluate placental transfer of xenobiotic particles or pharmacological agents in addition to alterations in placental physiology.

Perfusão ex vivo da placenta de roedores

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...