This work was funded by the German Ministry of Defense (Grant No. M-SAB1-6-A009).

O protocolo seguinte descreve técnicas para a investigação de migração celular endotelial precoce. O cultivo adequado de células endoteliais vasculares exige a pré-revestimento de frascos de cultura de células com proliferação de gelatina para assegurar adequada e manutenção de um fenótipo endotelial. 1. Pré-revestimento de frascos de cultura celular <ol><li> Dissolver a gelatina em PBS a 0,1 M a uma concentração final de 0,1%. </li><li> Autoclave a solução com parâmetros para autoclavagem líquido (para mais detalhes veja instruções da autoclave específico). </li><li> Adicionar um volume suficiente da solução de gelatina autoclavado a um frasco estéril de cultura de células (por exemplo, pelo menos 5 ml de um frasco de cultura de célula T25). </li><li> Transferir os frascos em uma incubadora (37 ° C, 5% de CO 2 não é necessária, mas não interfere) durante pelo menos 30 min. </li><li> Remover a solução de gelatina restante. Use os frascos pré-revestidas posteriormente (veja o cultivo de células) ou srasgou em condições estéreis até ser utilizado. </li></ol> 2. O cultivo celular de células endoteliais adiantados Nota: células estaminais embrionárias derivadas de células endoteliais precoces (CEE) foram obtidas a partir de corpos embrióides de murídeo diferenciadas por separação de células activada por magnética da fracção celular positiva PECAM-1 como descrito anteriormente 10,11. <ol><li> Cultura CEE sobre pratos de cultura de células revestidas com gelatina em DMEM suplementado com 15% de FCS, 50 U / ml de penicilina, 50 U / ml de estreptomicina, 200? M de L-glutamina, 100 uM ß-mercaptoetanol e 1% aminoácidos não-essenciais. Pega células sob condições estéreis. Cultivar as células com 5% de CO2 a 37 ° C e 95% de humidade até sub-confluência (máx. 80%). </li><li> Na sub-confluência, divididas as células a uma razão de 1: 5. Nota: Destacamento de células endoteliais é um passo crítico. <ol><li> Colher as células com RT Accutase. Remova a mídia, enxaguar com PBS e adicionar 1 ml de Accutase por 25 centímetros <sup&gt; 2. </li><li> Incubar o balão à temperatura ambiente durante 2-10 min, até que as células têm destacado. Dispersa-se as células e transferi-los para a aplicação desejada. Nota: A neutralização química dos Accutase não é necessária, uma vez que tem lugar quando as células inoculadas são armazenadas na incubadora a 37 ° C. No entanto, Accutase actividade também pode ser diminuída pela adição de meio DMEM contendo FCS. </li></ol></li></ol> 3. Boyden Câmara Nota: Os ensaios de câmara de Boyden são realizados por meio de sistemas de pastilhas de tereftalato de polietileno de luz-opaco com 8 um de tamanho de poro. <ol><li> Pré-revestimento as inserções de filtro (que se encaixam no interior de poços de cultura de células, criando assim uma câmara de Boyden) por adição de 500 ul de 0,1% de gelatina dissolvidos em PBS a 0,1 M durante pelo menos 30 min. </li><li> Se as células são para ser expostas a produtos químicos tóxicos, expor de acordo com o desenho experimental específico antes da colheita das células. Nota: As células foram expostas a 12,5 ug clorambucil / ml de DMEMdurante 24 h. No que diz respeito ao desenho experimental específico, as instruções podem variar. </li><li> Colheita CEE e determinar o número de células utilizando uma câmara de contagem de células. Nota: Os dispositivos de contagem automática pode ser usado, mas deve ser usado com cautela: contagem manual de células é mais preciso e é altamente recomendado. </li><li> Adicionar 500 ul de meio de cultura de células para dentro do compartimento inferior da câmara da câmara de Boyden. </li><li> Adicionar exatamente 10 4 CEE em 500 ï¿½ de meio de cultura de células por elemento do filtro no compartimento de câmara superior. Eliminar as bolhas. </li><li> Incubam-se as inserções de filtro na incubadora durante exactamente 8 h. </li><li> Lavar uma vez com PBS e substituir o meio com 0,5 ml de paraformaldeído 4% em ambos os compartimentos durante 25 min para a fixação das células. Lavar o filtro amplamente mas, pelo menos, três vezes com 0,1 M de PBS. </li><li> Extirpar as membranas com um bisturi. </li><li> Monte a membrana entre duas lamelas de vidro com meio de montagem contendo DAPI para stainin nuclearg. Preste atenção à orientação. Assegure-se que apenas as células que migraram para o lado do compartimento inferior da membrana são contadas. </li><li> Contagem de células que migraram para o lado do compartimento inferior da membrana com um microscópio de fluorescência com uma ampliação de 400X. Não confunda poros da membrana com células migraram (Figura 1A, 1B). Investigar um número razoável de repetições biológicas (pelo menos 3 repetições biológicas por condição). </li></ol> 4. cicatrização de feridas Assay <ol><li> Dependendo do equipamento disponível, escolher com cuidado os pratos de cultura de células ou placas: Ao usar microscopia DIC, evitar placas de cultura com base na superfície de plástico ou placas bem mas utilizam dispositivos baseados em vez de vidro. Nota: Se estiver usando microscopia de contraste de fase, pratos de plástico com base também pode ser usado. </li><li> Cultive CEE em um dispositivo de cultura de células adequado (por exemplo, quatro centímetros de vidro de fundo petri prato adequado para imagens de células vivas) Até 80% de confluência. Importante: não cultivar as células para completar confluência. </li><li> Raspe as monocamadas com estéreis 10 dicas ul pipeta. Empurrar a ponta suavemente sem demasiada pressão sobre a superfície do prato e movê-lo em linha recta sem problemas de um lado para o other.Wash as células duas vezes com PBS a 0,1 M para remover as células destacadas. </li><li> Adicionar um volume suficiente do meio para o prato de cultura. Se for o caso, adicionar compostos que devem ser investigadas. Nota: 1,5 ml de meio contendo 15 ng / ml de ácido alfa linolénico foi adicionado. </li><li> Monte o prato de cultura sob um microscópio capaz de imagens de células vivas. Certifique-se de 5% de CO2, 37 ° C e numa atmosfera humidificada. Nota: A humidificação é especialmente importante para evitar a evaporação forma. </li><li> Adquirir imagens de lapso de tempo superior a 24 horas a intervalos de 10 min. Plano para tamanhos de arquivos grandes. Nota: A resolução de 512 x 512 pixels é geralmente suficiente; no entanto, recomendamos o uso de imagens de pelo menos 1.024 x 1,024. </li><li> Meça a largura da abertura em t = 0 horas e em t = 24 horas usando a ferramenta comprimento do software fornecido com o microscópio ou usar software de código aberto (por exemplo, ImageJ). Nota: Em software de aquisição e análise de imagem específico geral é fornecido pelo fabricante. Por isso, para obter mais detalhes técnicos sobre o uso do software, consulte o manual. </li></ol> Rastreamento 5. celular <ol><li> Dependendo do equipamento disponível, escolher com cuidado os pratos de cultura de células ou placas: Ao usar microscopia DIC, evitar placas de cultura com base na superfície de plástico ou placas bem mas utilizam dispositivos baseados em vez de vidro. Nota: Se estiver usando microscopia de contraste de fase, pratos de plástico com base também pode ser usado. </li><li> Semente de 5 x 10 4 CEE em DMEM suplementado em um dispositivo de cultura de células adequado (por exemplo, placa de 24 poços múltiplos) e cultivar as células com 5% de CO2 a 37 ° C e 95% de humidade durante 1-2 dias. </li><li> Quando as células têm crescido a um 80% De confluência, remova a mídia ea cultura das células com novas mídias na presença das respectivas substâncias de ensaio (por exemplo, 12,5 ug chlorambucil / ml DMEM). Sempre incluem células de controlo (tratados com o solvente, por exemplo, etanol) a 37 ° C durante um certo período de tempo (24 h, dependendo do sistema de ensaio individual). </li><li> Montar o prato de cultura sob um microscópio capaz de imagens ao vivo de células (37 ° C, 5% de CO 2 e 95% de humidade). Adquirir imagens de lapso de tempo superior a 24 horas em intervalos predefinidos. Adquirir imagens em intervalos de 10 min. </li><li> Realizar rastreamento manual de CEE pela utilização do plugin ImageJ MTrackJ. Escolha 10 células aleatoriamente a partir do campo de visão e rastrear seus movimentos através da adição de um ponto de dados por ponto no tempo usando a opção &quot;Adicionar&quot; comando de MTrackJ. </li></ol> Nota: MTrackJ está disponível gratuitamente no ImageJ e está dispon [Meijering, Mtrackj &quot;http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/&quot;.]le em [Rasband, ImageJ. &quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/&quot;]. Um manual detalhado sobre o plugin MTrackJ está disponível em &quot;http://www.imagescience.org&quot;. 6. Imagens de células vivas / Avaliação do Potencial de Membrana Mitocondrial <ol><li> Cultive CEE em um dispositivo de cultura de células adequado (por exemplo, quatro centímetros de vidro de fundo placa de Petri adequado para imagens de células vivas) até uma confluência de 80%. Importante: Não cultivar as células para completar confluência. </li><li> Se for o caso, expor as células a produtos químicos. Nota: As células foram expostas a 12,5 ug / ml clorambucil, durante 24 h. No que diz respeito ao desenho experimental específico, as instruções podem variar. </li><li> Prepara-se uma solução de estoque 10 mM de tetrametilrodamina (TMRM) em DMSO. Proteger da luz. Nota: A solução-mãe pode ser armazenado a -20 ° C. </li><li> Dilui-se a solução de stock em meio de cultura celular a uma solução de trabalho com uma concentração de 10 uM (1: 1000 de diluição). Proteger da luze utilizar o mais rapidamente possível. Nota: A solução de trabalho pode ser mantida à temperatura ambiente durante algum tempo (&gt; 1 h), no entanto, a preparação de uma solução de trabalho de fresco é altamente recomendável. </li><li> Adicionar 2 ml da solução de trabalho de 1 ml (solução de carga) fresco meio de cultura de células. </li><li> Carregar as células através da substituição do meio de cultura de células com a solução de carga. Incubar durante 15 min a 37 ° C, 5% de CO2 e atmosfera humidificada (incubadora). Cuidado: Quase todos os indicadores de fluorescência são exportados por células ao longo do tempo vivendo; portanto, evitar o carregamento prolongado ou atrasado a análise. </li><li> Sem lavar, coloque o prato sob um microscópio apropriado para imagens de células vivas. Importante: indicadores de fluorescência são altamente sensíveis à luz, portanto, evitar a exposição à luz desnecessária. </li><li> Adquirir imagens sem alterar os parâmetros de aquisição de garantir a comparabilidade entre as diferentes imagens. </li></ol>

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Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+culture+conditions+on+endothelial+cell+growth+and+responsiveness.">Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness.</a> Tissue &amp; Cell. 30, 525-530 (1998).</li><li>Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. 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The authors have nothing to disclose.

Exposição dérmica a substâncias químicas tóxicas, muitas vezes resulta em desordem cicatrização de feridas graves. Os mecanismos subjacentes são em grande parte desconhecido. A cicatrização de feridas é um processo complexo que consiste em diferentes fases (hemostasia, inflamação, proliferação e remodelação). A migração celular está envolvida em cada fase, no entanto, é de extrema importância para a formação do tecido de granulação. Aqui, novos vasos sanguíneos são formados por angio- ou vas...

A migração celular é importante em muitos processos fisiológicos e patológicos incluindo desenvolvimento, várias doenças, e a cicatrização de feridas após a lesão da pele. Após lesão da pele, inflamação remove as unidades de tecido de granulação e danificados ou necróticas fechamento da ferida preliminar e permite a formação de uma rede de novos capilares através vasculogenesis (romance de formação) ou angiogênese (surgimento de vesículas existentes) 1-3. Ambos vasculo- angiogénese e exige a migração de células endoteliais. A rede de crescimento de vasos sanguíneos é essencial para o transporte de oxigénio e nutrientes para os queratinócitos proliferam que em última análise se submetem a queratinização, formar um novo epitélio e fornecer o fechamento da ferida. Prejudicada migração de células endoteliais é uma causa subjacente da ferida desordem 4,5 cura. Assim, os métodos para avaliar a migração de células endoteliais iniciais são necessárias para explorar a pathophysiolgia de distúrbios da migração celular e para identificar novas estratégias para a intervenção terapêutica. Exposição cutânea aos agentes alquilantes (por exemplo, enxofre e mostardas de azoto) provoca transtorno 6 ferida cura. Esses compostos foram utilizados como agentes de guerra química em vários conflitos no século 20 e permanecem motivo para grande preocupação devido à estoques existentes em regiões politicamente instáveis ​​e síntese relativamente simples. Embora mostarda de enxofre foi sintetizado pela primeira vez em 1822, a patologia molecular e clínica de exposição SM não é compreendido em pormenor e um antídoto para a exposição SM foi identificada. Vários estudos têm sido realizados para compreender e modelar a cicatrização de feridas prejudicada após a exposição SM e para testar compostos potencialmente candidatos capazes de reservar esse efeito. Schmidt et ai (2009). Testaram o efeito de clorambucil, alquilando um composto com propriedades semelhantes a SM em mouSE modelos de corpos embrióides e encontrada uma dramática redução, por vezes mais de 99% na formação dos vasos 7. Este efeito adverso foi mais pronunciado, numa fase de desenvolvimento que, sob condições fisiológicas, é dominada pela proliferação e migração de células precursoras endoteliais vasculares. Assim, estas células foram identificadas como sendo particularmente sensível a agentes de alquilação. Steinritz et ai (2010). Testados sequestrantes de espécies reactivas de oxigénio (ROS), nomeadamente, N-acetilcisteína (NAC) e ácido alfa-linolénico (ALA) para a sua capacidade para reduzir a toxicidade SM em modelos de ratinho embrióides corpo e, em particular, a 8 restaurar a formação de vasos. Foram observados efeitos de protecção temporárias, indicando que a formação de ROS excessiva era susceptível de contribuir para os efeitos adversos da SM na cicatrização de feridas. Estes efeitos não eram permanentes e os dois compostos candidatos pode não ser capaz de restabelecer a formação de vasos e a cicatrização de feridas, a longo prazo 8. However, esses experimentos foram realizados em um complexo modelo 3D, que permitiu que a investigação de migração celular. Assim, subsequentemente testado NAC e ALA para os efeitos benéficos sobre a migração de células de CEE que têm um papel chave no processo de formação de vasos 9. Além disso, há evidências de que a polaridade da célula é necessária para a migração celular. Disfunção mitocondrial conduzindo a formação de ROS foi mostrado para danificar polaridade celular e pode, consequentemente, afectar adversamente a migração celular. Assim, imagens de células vivas em relação à função mitocondrial foi realizada e os efeitos de ROS sequestrantes foram examinados. O protocolo que se segue descreve os requisitos gerais de cultivo da CEE, o ensaio de câmara de Boyden, o ensaio de cicatrização de feridas, incluindo a análise de células e seguimento da utilização de TMRM para a avaliação da função mitocondrial em detalhe. Aspectos importantes de protocolos experimentais para o cultivo CEE ea migração são realçados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Boyden Chamber&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 &#181;m</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>#351151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 &#181;m</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>#351152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound&#160; healing assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>Word Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>#FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assessment of mitochondrial potential</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#T669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>PAA, Pasching, Austria</td>
			<td># L11-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Linolenic acid</td>
			<td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td>
			<td>&#160;# L2376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorambucil</td>
			<td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td>
			<td># 23125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany</td>
			<td># G2500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of endothelial cell migration after exposure to toxic chemicals

Exposição a substâncias químicas (incluindo alquilantes agentes químicos de guerra, como enxofre e nitrogênio mostardas) causar uma infinidade de sintomas clínicos, incluindo ferida desordem de cura. O processo fisiológico de cicatrização de feridas é altamente complexa. A formação de tecido de granulação é um passo fundamental neste processo, resultando em um fechamento da ferida preliminar e fornecendo uma rede de novos vasos sanguíneos capilares - quer através vasculogenesis (romance de formação) ou a angiogénese (brotação de navios existentes). Ambos vasculo- angiogénese e requerem funcional, migração dirigida de células endoteliais. Assim, a investigação de células endoteliais (CEE) migração precoce é importante para entender a fisiopatologia da química induzida ferida distúrbios de cicatrização e identificar potencialmente novas estratégias para intervenção terapêutica. Foram avaliados a cicatrização de feridas prejudicada após alquilação exposição agente e testados compostos candidatos potenciais para trratamento. Foi utilizado um conjunto de técnicas delineadas neste protocolo. A câmara de Boyden modificada para investigar quantitativamente quimiocinese da CEE é descrito. Além disso, a utilização do ensaio de cicatrização da ferida, em combinação com a análise de faixas para avaliar qualitativamente migração é ilustrado. Finalmente, que demonstram a utilização do TMRM corante fluorescente para a investigação do potencial de membrana mitocondrial para identificar os mecanismos subjacentes à migração celular perturbado. O protocolo a seguir descreve técnicas básicas que foram adaptadas para a investigação da CEE.

Exposição dérmica para agentes alquilantes provoca eritema, formação de bolhas e ulceração dérmica que está associada com uma desordem de cura de feridas. A cicatrização de feridas requer vasculogénese angio- e que se baseiam na migração de células endoteliais. Migração quantitativa pode ser avaliada pela utilização do ensaio de câmara de Boyden. Como mostrado na Figura 1C exposição de CEE para o clorambucil agente alquilante resultou numa diminuição significativa na migração d...

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Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Avaliação da migração de células endoteliais após a exposição a produtos químicos tóxicos

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

assessment-endothelial-cell-migration-after-exposure-to-toxic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.6K visualizações.  Bundeswehr Institute of Pharmacology and Toxicology. Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

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Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell migration. However, when explants are established, these cells also move collectively, maintaining many of the features which make individual keratocytes an attractive model to study migration: rapid rates of motility, extensive actin-rich lamellae with a perpendicular actin cable, and relatively constant speed and direction of migration. In early explants, the rapid interconversion of cells migrating individually with those migrating collectively allows the study of the role of cell-cell adhesions in determining the mode of migration, and emphasizes the molecular links between the two modes of migration. Cells in later explants lose their ability to migrate rapidly and collectively as an epithelial to mesenchymal transition occurs and genes associated with wound healing and inflammation are differentially expressed. Thus, keratocyte explants can serve as an in vitro model for the reepithelialization that occurs during cutaneous wound healing and can represent a unique system to study mechanisms of collective cell migration in the context of a defined program of gene expression changes. A variety of mutant and transgenic zebrafish lines are available, which allows explants to be established from fish with different genetic backgrounds. This allows the role of different proteins within these processes to be uniquely addressed. The protocols outlined here describe an easy and effective method for establishing these explant cultures for use in a variety of assays related to collective cell migration.

Zebrafish keratocytes migrate in cell sheets from explants and provide an in vitro model for the study of the mechanisms of collective cell migration in the context of epithelial wound healing. These protocols detail an effective way to establish primary explant cultures for use in collective cell migration assays.

Zebrafish queratinócitos explantes para estudar migração celular Collective e reepitelização na cicatrização de feridas cutâneas

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Biologia do Desenvolvimento

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Otimização do Ensaio Wound zero para detectar mudanças na Murino estromais mesenquimais migração celular após a lesão por Extract fumo do cigarro Solúvel

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing cardiovascular progenitors during development and disease. While a number of factors have been implicated in epicardium-derived cell (EPDC) mobilization, the mechanisms governing their subsequent migration and differentiation are poorly understood. Here, we present in vitro and ex vivo strategies to study EPDC motility and differentiation. First, we describe a method of obtaining primary epicardial cells by outgrowth culture from the embryonic mouse heart. We also introduce a detailed protocol to assess three-dimensional migration of labeled EPDC in an organ culture system. We provide evidence using these techniques that genetic deletion of myocardin-related transcription factors in the epicardium attenuates EPDC migration. This approach serves as a platform to evaluate candidate modifiers of EPDC biology and could be used to develop genetic or chemical screens to identify novel regulators of EPDC mobilization that might be useful for cardiac repair.

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

Epicárdio Conseqüência Cultura Ensaio e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Avaliação da migração celular Epicárdica derivado

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analisando<em&gt; In Vivo</em&gt; Migração celular usando transplantes de células e de imagem Time-lapse em embriões Zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

Isolamento de células embrionárias de murino hegemônicos endoteliais

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

Uma nova técnica de transplante de almofada de gordura mamária para visualizar a geração de vasos de células vasculares endoteliais vasculares

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including embryogenesis and development, wound healing, tumor growth and metastasis, and ocular and cardiovascular diseases. Effective in vitro models that recapitulate the biology of angiogenesis are needed to appropriately study this process and identify mechanisms of regulation that can be ultimately targeted for novel therapeutic strategies. The bead angiogenesis assay has been previously demonstrated to recapitulate the multiple stages of endothelial sprouting in vitro. However, a limitation of this assay is a lack of endothelial &#8211; mural cell interactions, which are key to the molecular and phenotypic regulation of endothelial cell function in vivo. The protocol given here presents a methodology for the incorporation of mural cells into the bead angiogenesis assay and demonstrates a tight association of endothelial cells and pericytes during sprouting in vitro. The protocol also details a methodology for effective silencing of target genes using siRNA in endothelial cells for mechanistic studies. Altogether, this protocol provides an in vitro assay that more appropriately models the diverse cell types involved in sprouting angiogenesis, and provides a more physiologically-relevant platform for therapeutic assessment and novel discovery of mechanisms of angiogenesis regulation.

This protocol presents a novel in vitro bead assay that more appropriately models the process of in vivo sprouting angiogenesis by incorporating pericytes. This modification enables the bead assay to more faithfully recapitulate the heterotypic cellular interactions between endothelial cells and mural cells that are critical for angiogenesis.

Incorporando um grânulo de célula endotelial brotando ensaio pericitos

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

Visualização da migração celular tangencial no desenvolvimento Tectum óptica de Chick

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected tissues via a well-characterized cascade of pro-adhesive receptors which are upregulated on the leukocyte cell surface upon the inflammatory trigger. Inflammatory responses differ between individuals in the population and the genetic background can contribute to these differences. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have been shown to be a reliable source of ECs (hiPSC-ECs), thus representing an unlimited source of cells that capture the genetic identity and any genetic variants or mutations of the donor. hiPSC-ECs can therefore be used for modeling inflammatory responses in donor-specific cells. Inflammatory responses can be modeled by determining leukocyte adhesion to the hiPSC-ECs under physiological flow. This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

Microfluidic ensaio para a avaliação da adesão de leucócitos ao humano Induced Pluripotent células-tronco derivadas de células endoteliais (ECs-hiPSC)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

Em Vitro ensaios para avaliar a migração, invasão e proliferação de linhas de células humanas imortalizado primeiro trimestre trofoblasto

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...