Somos gratos aos Serviços Ambientais Association Education Trust, a Biologia Sintética em Cambridge fundo Synbio e do Ministério da Justiça Social e Empoderamento, Governo da Índia, para apoio financeiro.

<ol>
	<li>Zwirglmaier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+phylogeography+of+marine+Synechococcus+and+Prochlorococcus+reveals+a+distinct+partitioning+of+lineages+among+oceanic+biomes.">Global phylogeography of marine Synechococcus and Prochlorococcus reveals a distinct partitioning of lineages among oceanic biomes.</a> Environ Microbiol. 10, 147-161 (2008).</li><li>Galloway, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+cycles:+past,+present,+and+future.">Nitrogen cycles: past, present, and future.</a> Biogeochemistry. 70, 153-226 (2004).</li><li>Lea-Smith, D. 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PCC 6803 to survive rapidly changing light intensities.</a> Plant Physiol. 162, 484-495 (2013).</li><li>Liu, X., Sheng, J., Curtiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+production+in+genetically+modified+cyanobacteria.">Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6899-6904 (2011).</li><li>Xu, H., Vavilin, D., Funk, C., Vermaas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+deletions+of+small+cab-like+proteins+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+PCC+6803+-+Consequences+for+pigment+biosynthesis+and+accumulation.">Multiple deletions of small cab-like proteins in the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 - Consequences for pigment biosynthesis and accumulation.</a> J Biol Chem. 279, 27971-27979 (2004).</li><li>Castenholz, R. 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PCC6803 possesses a two-component polyhydroxyalkanoic acid synthase similar to that of anoxygenic purple sulfur bacteria.</a> Arch Microbiol. 170, 162-170 (1998).</li><li>Ng, A. H., Berla, B. M., Pakrasi, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+tuning+of+photoautotrophic+protein+production+by+combining+promoters+and+neutral+sites+in+Synechocystis+6803,+a+cyanobacterium.">Fine tuning of photoautotrophic protein production by combining promoters and neutral sites in Synechocystis 6803, a cyanobacterium.</a> Appl Environ Microbiol. , (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Os passos mais críticos na geração de mutantes não marcados são: 1) um projeto cuidadoso plasmídeo para garantir que apenas a região de destino é alterada; 2) garantir que as amostras permanecem axênico, especialmente quando cultivadas em sacarose; 3) para a geração de células chapeamento mutante marcada inicialmente transformado em placas de agar BG11 falta antibióticos, seguido por adição de ágar antibióticos mais 24 horas mais tarde; 4) cultura marcada mutantes para 4 dias completos antes de plaqueamento em BG11 além de agar de sacarose placas: 5) assegurando que os mutantes marcados são totalmente segregados e 6) confirmando completamente o genótipo de cepas mutantes. Para esta última etapa, os iniciadores adicionais concebidos para amplificar parte da região eliminada, pode ser utilizado para garantir que ele tiver sido removido. Southern blotting, enquanto laborioso, pode também ser usado. No entanto, nossa experiência é que o procedimento descrito neste artigo é suficiente para a verificação adequada de mutantes. Este procedimento tem também sido usado para gerar mutantes marcadas em Synechococcus elongatus PCC7942. No entanto, a transformação repetida deste cianobactéria demonstrou ser um desafio. Se mutantes marcados não podem ser segregadas, em seguida, diferentes condições ambientais altas concentrações de CO 2, com pouca luz (&lt;20 umol fotões m-2 s-1) ou nutrientes adicionais (isto é, glucose) pode ser testado. Por exemplo, a adição de glucose é essencial, a fim de gerar mutantes fotossistema II 21. Se mutantes marcados não segregar completamente, em seguida, o gene é provavelmente essencial para a viabilidade. No entanto, existem exemplos na literatura em que alguns grupos de pesquisa têm sido incapazes de knockout de um gene (por exemplo, Vipp em Synechocystis) 22, apenas para outros grupos de mostrar mais tarde que o gene não é essencial 23. Isto pode ser devido a diferenças nas estirpes de tipo selvagem ou projeto plasmídeo incorreta, resultando em efeitos polares diante, genes essenciais adjacentes. Se um mutante não totalmentesegregar nós recomendamos que o plasmídeo contendo a cassete NPT1 de pUC18K 20 entre os fragmentos esquerdo e direito ser utilizado para a transformação. É mais fácil de verificar a presença de bandas que correspondem ao tipo selvagem e mutante por PCR, uma vez que este fragmento tem cerca de 1,2 kb, em comparação com os 3,8 kb NPT1 / cassete de sacB. Este resultado é uma peça importante de evidência demonstrando que o gene é essencial. Geração de mutantes não marcados com cassetes de expressão inserida é geralmente mais desafiador do desenvolvimento de estirpes knockout. Em geral, expressar genes sob o controlo do promotor forte 13 cpcBAC1C2D. Em alguns casos, isto pode diminuir as hipóteses de sucesso de inserção da cassete do gene, se a sobre-expressão de uma proteína é prejudicial para a célula. Os promotores mais fracos deve então ser testado. De um modo geral observou-se que quanto maior for a cassete do gene é, mais difícil é para emSERT-lo no genoma. Nós não temos sido capazes de inserir cassetes de genes maiores que 5 kb. Além disso, deverá ser tomado em escolhendo locais para inserir cassetes de expressão no genoma. Locais neutras que não afectam a viabilidade ou crescimento celular deve ser usado. Exemplos incluem em Synechocystis e phaAB phace, que codificam as proteínas que codificam a via biossintética polihidroxibutirato 24,25. Mais recentemente uma extensa lista de sites neutros em Synechocystis foi identificado 26. Geração de mutantes não marcados em cianobactérias é um processo lento, levando cerca de 5-7 semanas, se todas as medidas estão a realizar corretamente. Isto é mais lento do que o método padrão de geração de orifícios marcadas utilizados pela maioria dos grupos de pesquisa investigaram cianobactérias. No entanto, a flexibilidade de ser capaz de introduzir outras mutações em mutantes não marcados parcialmente compensa este, uma vez que os plasmídeos adicionais containing uma variedade de cassetes que conferem resistência a antibióticos diferentes, não tem que ser construído. Para efeitos de investigação a capacidade de mutação múltiplos genes é por vezes necessário, a fim de caracterizar completamente o papel funcional de proteínas. Por exemplo, foi identificado um fenótipo deletério apenas mediante eliminação dos dois electrões pias oxidase terminais localizadas na membrana tilacoide, uma vez que a perda de apenas um destes complexos pode ser compensada pela actividade da outra 14. Desenvolvimento de uma estirpe para aplicações industriais também vai exigir várias modificações a uma estirpe, não apenas para a introdução de genes estranhos, mas também para aumentar a eficiência fotossintética, a otimização da colheita de luz e supressão de vias concorrentes para o substrato desejado. O principal fator limitante da velocidade da geração mutante não marcada é o momento de divisão lenta de espécies de cianobactérias modelo, entre 8-20 horas, dependendo das condições de luz. Under intensidades de luz mais altas e concentrações de CO 2, o crescimento é mais rápido. No entanto, existe o risco de que as estirpes mutantes que não podem tolerar qualquer luz elevada ou CO 2 vai ser seleccionado contra, ou que as estirpes mutantes irá sofrer alterações indesejáveis ​​antes da caracterização fenotípica. Por conseguinte, isso não é recomendado. No entanto, seria altamente vantajoso se um protocolo mais rápido para gerar mutantes não marcado foi desenvolvido. No geral, o que facilitaria o desenvolvimento de cepas tanto para a pesquisa básica e aplicações aplicadas. Tais estirpes poderia ser usado para o biocombustível, biomassa ou de produção química ou na compreensão de muitos aspectos da bioquímica de cianobactérias, genética e fisiologia.

As cianobactérias são um filo antiga e diversificada evolutivamente de bactérias encontradas em quase todos ambiente natural na Terra. Em ecossistemas marinhos são particularmente abundantes e desempenham um papel fundamental em muitos ciclos de nutrientes, sendo responsável por cerca de metade da fixação de carbono 1, a maioria da fixação de nitrogênio 2 e centenas de milhões de toneladas de produção de hidrocarbonetos 3 nos oceanos anualmente. Cloroplastos, a organela responsável pela fotossíntese em algas e plantas eucariótica, são susceptíveis de ter evoluído de uma cianobactéria que foi engolida por um organismo hospedeiro 4. As cianobactérias provaram organismos modelo útil para o estudo da fotossíntese, transporte de electrões 5 e vias bioquímicas, muitos dos quais são conservados em plantas. Em adição cianobactérias são cada vez mais utilizados para a produção de alimentos, biocombustíveis 6, 7 e electricidade industriais compostos 8, devido à sua oiconversão ghly eficiente de água e CO 2 a biomassa usando a energia solar 9. Muitas espécies podem ser cultivadas em terras não-aráveis ​​com nutrientes mínimos e água do mar, o que sugere que as cianobactérias potencialmente poderiam ser cultivadas em grande escala, sem afetar a produção agrícola. Certas espécies também são fontes de produtos naturais, incluindo antifúngicos, antibacterianos e anti-câncer compostos 10,11. A capacidade de gerar mutantes é a chave para a compreensão de cianobactérias fotossíntese, bioquímica e fisiologia, e essencial para o desenvolvimento de cepas para fins industriais. A maioria dos trabalhos publicados produzir estirpes geneticamente modificados por inserção de uma cassete de resistência a antibiótico no local de interesse. Isto limita o número de mutações que podem ser introduzidas numa estirpe, como apenas algumas cassetes de resistência aos antibióticos estão disponíveis para uso em cianobactérias. Estirpes que contêm genes que conferem re antibióticosistance não pode ser usado para a produção industrial em lagoas abertas, o que é susceptível de ser o único meio de baixo custo para a produção de biocombustíveis e outros produtos de baixo valor 12. A geração de mutantes sem marcação supera essas limitações. mutantes não marcadas não contêm DNA estranho, a não ser intencionalmente incluídos, e pode ser manipulado diversas vezes. Por isso, é possível gerar o maior número de alterações em uma cepa como desejado. Além disso, os efeitos polares de genes a jusante do local de modificação pode ser minimizado, permitindo a modificação mais preciso do organismo 13. Para gerar estirpes mutantes, plasmídeos suicidas contendo dois fragmentos de ADN idênticos às regiões no cromossoma de cianobactérias que flanqueiam o gene a ser suprimido (denominado a 5 &#39;e 3&#39; que flanqueiam regiões) são construídos em primeiro lugar. Dois genes são então inserida entre estas regiões flanqueadoras. Uma delas codifica uma proteína de resistência a antibiótico; o segundo codifica SacB, que produces levanossacarase, um composto que confere sensibilidade à sacarose. Na primeira fase do processo, os mutantes marcadas, as estirpes ou seja, contendo algum ADN estranho, são gerados. A construção de plasmídeo é misturado com as células de cianobactérias e o ADN é tomado naturalmente pelo organismo. Os transformantes são seleccionados por crescimento em placas de agar contendo os antibióticos apropriados e o genótipo mutante verificada por PCR. plasmídeos suicidas não pode replicar dentro da estirpe de interesse. Portanto, quaisquer colónias resistentes ao antibiótico irá resultar a partir de um evento de recombinação em que o gene de interesse é inserida no cromossoma. Para gerar mutantes não marcados, o mutante marcada é, em seguida, misturado com um segundo plasmídeo suicida contendo apenas as regiões f lanqueadoras 5 &#39;e 3&#39;. No entanto, se for necessária a inserção de ADN estranho, num plasmídeo que consiste em 5 &#39;e 3&#39; com regiões de uma cassete que contém os genes de interesse inserido entre estes fragmentos de ADN de flanqueamento, pode ser utilizado. Selecção é através de crescimento em placas de agar contendo sucrose. Como a sacarose é letal para as células quando o produto do gene sacB é expresso, as únicas células que sobrevivem são aquelas nas quais ocorreu um segundo evento de recombinação, em que o gene de sensibilidade de sacarose, em adição ao gene de resistência aos antibióticos, foi recombinado para fora do cromossoma e para o plasmídeo. Como consequência da permuta de recombinação, as regiões f lanqueadoras e qualquer ADN entre eles são inseridos no cromossoma. Temos utilizado com sucesso destes métodos para gerar múltiplas mutações cromossómicas na mesma estirpe de Synechocystis sp. PCC6803 (doravante referida como Synechocystis) 13,14, para introduzir mutações pontuais em um gene de interesse 13 e para a expressão de cassetes de genes. Enquanto a geração de nocautes não marcado foi demonstrada antes de nosso trabalho em Synechocystis 15,16, um método detalhado, auxiliado poruma apresentação visual dos passos críticos, não está disponível publicamente. Nós também aplicaram o mesmo método para geração de nocautes marcados em outro cianobactéria modelo, Synechococcus sp. PCC7002 (doravante referida como Synechococcus). Este protocolo fornece um método claro, simples para a geração de mutantes e um protocolo rápido para validar e armazenar estas estirpes.

<table><tbody><tr><td>NaNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5506</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>citric acid</td><td>Sigma</td><td>C0759</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA</td><td>Fisher</td><td>EDT002</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;BO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>339067</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;MoO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>331058</td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>Co(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>239267</td><td></td></tr><tr><td>Ferric ammonium citrate</td><td>Sigma</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>SODC001</td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>Sigma</td><td>T1375</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>SODH001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>cyanocobalamin</td><td>Sigma</td><td>47869</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;S&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>72049</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher</td><td>SUC001</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 90 mm triple vented</td><td>Greiner</td><td>633185</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m filters</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>100 ml conical flasks</td><td>Pyrex</td><td>CON004</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M 100 mm x 38&amp;nbsp;m</td><td>Bemis</td><td>FIL003</td><td></td></tr><tr><td>Phusion high fidelity DNA polymerase&amp;nbsp;</td><td>Phusion</td><td>F-530</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Melford</td><td>MB1200</td><td></td></tr><tr><td>DNA purification kit&amp;nbsp;</td><td>MoBio</td><td>12100-300</td><td></td></tr><tr><td>Restriction endonucleases</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 ligase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani broth</td><td>Invitrogen</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Sigma</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET plasmid miniprep kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>14 ml round-bottom tube</td><td>BD falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA polymerase</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td></td></tr><tr><td>425-600 &amp;micro;m glass beads</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent bulbs</td><td>Gro-Lux</td><td>69</td><td></td></tr><tr><td>HT multitron photobioreactor</td><td>Infors</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation of marked and markerless mutants in model cyanobacterial species

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation of cyanobacteria, especially model organisms such as Synechocystis sp. PCC6803 and Synechococcus sp. PCC7002, is a key tool for both basic and applied research. Generation of unmarked mutants, whereby chromosomal alterations are introduced into a strain via insertion of an antibiotic resistance cassette (a manipulatable fragment of DNA containing one or more genes), followed by subsequent removal of this cassette using a negative selectable marker, is a particularly powerful technique. Unmarked mutants can be repeatedly genetically manipulated, allowing as many alterations to be introduced into a strain as desired. In addition, the absence of genes encoding antibiotic resistance proteins in the mutated strain is desirable, as it avoids the possibility of 'escape' of antibiotic resistant organisms into the environment. However, detailed methods for repeated rounds of genetic manipulation of cyanobacteria are not well described in the scientific literature. Here we provide a comprehensive description of this technique, which we have successfully used to generate mutants with multiple deletions, single point mutations within a gene of interest and insertion of novel gene cassettes.

O plasmídeo concepção é crítica para a geração bem sucedida de ambos os mutantes marcadas e não marcadas. A Figura 1 dá um exemplo do plasmídeo A e B usadas para gerar um mutante de deleção nos genes de Synechocystis cpcC1 e cpcC2 13. Em cada caso, as regiões f lanqueadoras 5 &#39;e 3&#39; são aproximadamente 900-1.000 pb. flanqueando reduzidas pode ser utilizado, embora o menor temos testadas com sucesso tem sido aproximadamente 500 pb. O plasmídeo B, também pode conter uma cassete de genes entre a 5 &#39;e 3&#39; ~ 1 kb regiões que flanqueiam ou uma versão modificada da sequência do gene nativo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54001/54001fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2: Verificação de mutantes marcados e não marcados, por exemplo cpcC1 / cpcC2 <strong&gt; em Synechocystis e SYNPCC7002_A1173 em Synechococcus. (A) O tamanho esperado do tipo selvagem Synechocystis (em cima), não marcado (meio) e amplicons gerados usando primers cpcC1C2for e cpcC1C2rev knockout marcada (em baixo), cerca de 200 pb de cada lado do região cromossómica a ser excluído. (B) O tamanho esperado do tipo selvagem Synechococcus (topo) e knockout marcado (inferior) produtos de amplificação gerados utilizando os iniciadores A1173for e A1173rev, aproximadamente 200 pb em cada lado da região cromossómica para ser apagada. Amplicões de gel mostrando agarose gerados a partir de (C) de tipo selvagem de Synechocystis (pista 2), não marcado (pista 3) e marcado knockouts cpcC1 / cpcC2 (pista 4), ​​e (D) do tipo selvagem Synechococcus (pista 6) e o SYNPCC7002_A1173 acentuada knockout (pista 7). Os marcadores são exibidosnas pistas 1 e 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54001/54001fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Após a transformação do plasmídeo A para as células, tipicamente várias centenas de colónias aparecerá em uma placa após cerca de 7-10 dias. Colónias são &lt;1 mm de diâmetro e não vai aumentar de tamanho para as próximas semanas. Por isso, é crítica a utilização de um palito de extremidade embotada para remover a colónia e raia-o em um BG11 + canamicina placa de ágar fresco. Aproximadamente metade das colônias manchado de re vai crescer depois de 4-6 dias. Se os genes não são essenciais e mutantes demonstram crescimento similar à estirpe do tipo selvagem sob a luz contínua de 20-40 mol fótons m -2 s-1 (por exemplo terminais mutantes oxidase em Lea-Smith et al., 2013 14) (Figura 3), em seguida, todos os cromossomos devem conter uma cópia do t<html> ele NPT1 / cassete sacB sequência inserida, tal como determinado através de PCR. Se os genes não são essenciais e mutantes demonstram um fenótipo de crescimento lento sob luz contínua de 20-40 umol fotões m-2 s-1 (por exemplo, ficobilissoma mutantes deficientes em Lea-Smith et al., 2014 13) (Figura 3), em seguida vários ciclos de re-estrias em placas de agar com BG11 progressivamente maiores quantidades de canamicina são essenciais para a obtenção de um mutante marcada segregada. Uma vez que um mutante segregada é obtido este deve ser re-semeadas em uma BG11 mais canamicina placa de agar fresco para garantir que a segregação é completa. Se rodadas repetidas de estrias não resultar em uma segregada marcada mutante, em seguida, o gene é provável essencial para a sobrevivência. A Figura 4 apresenta um esboço das etapas experimentais envolvidos na geração mutante não marcada. /54001/54001fig3highres.jpg &quot;Width =&quot; 700 &quot;/&gt; Figura 3:. O crescimento de mutantes de Synechocystis Os exemplos de mutantes que demonstram (a) O crescimento semelhante à do tipo selvagem e (B) um crescimento mais lento do que o de tipo selvagem. O mutante ΔCOX carece de citocromo-oxidase devido ao apagamento dos genes CtaC1D1E1. O mutante ΔCyd carece de quinol oxidase devido ao apagamento dos genes CydAB. O mutante de oliva carece de uma porção do ficobilissoma devido a deleção dos genes CpcABC1C2D. As amostras em (B) foram borbulhar com ar para facilitar o crescimento. Reproduzido a partir de dados publicados em Lea-Smith et al, 2013 14 e 2014 13 (www.plantphysiol.org; de Copyright Sociedade Americana de biólogos da planta).. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54001/54001fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Geração de mutantes sem identificação é altamente eficiente. Após transformação do plasmídeo B para o mutante marcada, um período de incubação de quatro dias e o chapeamento subsequente em agar com sucrose BG11 mais placas, centenas de colónias são obtidos por 1-10 ul de suspensão de células transformadas. No entanto, uma série de diluições devem ser testadas, variando de 0,1 a 100 ul, tal como uma quantidade excessiva leva a uma redução da concentração de sacarose por célula, resultando numa fraca selecção de mutantes não marcados. Se um gramado de células é visto ao longo de toda a placa de concentrações, em seguida, mais baixas devem ser julgados. Uma vez que as colónias individuais são obtidos em placas, em patching BG11 com sacarose e BG11 mais placas de agar canamicina é um passo essencial. Tipicamente para os mutantes não marcados em que uma região do cromossoma está a ser eliminado, a maioria das colónias serão sensíveis e resistentes à canamicina de sacarose. A amplificação por PCR da região alvo nestas colónias mostram que quase 100% demonstrar a unmarked perfil mutante, por exemplo, Figura 2. Se uma cassete do gene está a ser inserido no cromossoma, em seguida, tipicamente uma proporção mais elevada de canamicina são observadas colónias resistentes resistentes e sacarose. Estes mutantes podem crescer em sacarose, devido a uma mutação no gene sacB. Se não há colónias resistentes à sacarose e sensíveis à canamicina são geradas, em seguida, a cassete de gene é prejudicial para a célula. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54001/54001fig4highres.jpg" width="700" /> Figura 4: Geração de mutantes marcados e não marcados em Synechocystis detalhando (A) Representação esquemática de recombinação e (B) passos experimentais envolvidos na geração de mutantes.. Um plasmídeo é primeiro misturado com as células. Após a incubação em placas de agar contendo canamicina, as colónias em que um evento de recombinação ocorre entre as 5 &#39;umD 3 &#39;que flanqueiam regiões (indicados a azul e vermelho, respectivamente) e a sequência homóloga no cromossoma, são isolados. Além disso, o / cassete sacB NPT1 entre a 5 &#39;e 3&#39; que flanqueiam regiões está inserido no cromossoma. A seguir a segregação um mutante marcada é gerado. Células mutantes marcadas são então misturados com o plasmídeo B, que pode conter ou (C) 1: as regiões f lanqueadoras 5 &#39;e 3&#39;; 2: 5 &#39;e 3&#39; que flanqueiam regiões com uma cassete de expressão contendo genes de interesse inserida entre estas sequências; 3: 5 &#39;e 3&#39; que flanqueiam regiões com a sequência de tipo selvagem com as alterações de nucleótidos desejadas inseridos entre estas sequências. Um segundo evento de recombinação homóloga ocorre entre o 5 &#39;e 3&#39; que flanqueiam regiões e as regiões homólogas no cromossoma, resultando na remoção do NPT1 / sacB cassete e, ou o knockout não marcado ou de um mutante com uma inserção ou alterado selvagem Tiporegião e introduzida no cromossoma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54001/54001fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Receitas da solução </td><td></td></tr><tr><td> Químico </td><td> Quantidade (g) </td></tr><tr><td> 100x BG11 (por L) </td><td></td></tr><tr><td> NaNO3 </td><td> 149,6 </td></tr><tr><td> MgSO 4 .7H 2 O </td><td> 7,49 </td></tr><tr><td> CaCl 2 .2H 2 O </td><td> 3.6 </td></tr><tr><td> Ácido cítrico </td><td> 0,6 </td></tr><tr><td> Adicionar 1,12 ml de 0,25 M de Na 2 EDTA, pH 8,0 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25 M de Na2EDTA, pH 8,0 (100 ml) </td><td></td></tr><tr><td> na 2 </sub&gt; EDTA </td><td> 9.3 </td></tr><tr><td> Oligoelementos (100 ml) </td><td></td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td> 0,286 </td></tr><tr><td> MnCl 2 .4H 2 O </td><td> 0,181 </td></tr><tr><td> ZnSO 4 .7H 2 O </td><td> 0,022 </td></tr><tr><td> Na 2 MoO 4 .2H 2 O </td><td> 0,039 </td></tr><tr><td> CuSO 4 .5H 2 O </td><td> 0,008 </td></tr><tr><td> Co (NO 3) 2 .6H 2 O </td><td> 0,005 </td></tr><tr><td> Estoque de ferro (100 ml) </td><td></td></tr><tr><td> citrato de amónio férrico </td><td> 1.11 </td></tr><tr><td> De partida de fosfato (por 100 ml) </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> 3.05 </td></tr><tr><td> Na 2 CO 3 estoque (por 100 ml) </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Na 2 CO 3 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Tampão de TES, pH 8,2 (100 ml) </td><td></td></tr><tr><td> TES </td><td> 22,9 </td></tr><tr><td> NaHCO3 estoque (100 ml) </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> 8.4 </td></tr><tr><td> HEPES, pH 8,2 (por 500 ml) </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 119.15 </td></tr><tr><td> A vitamina B 12 (por 50 ml) </td><td></td></tr><tr><td> cyanocobalamin </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> Media Luria Bertani (por 500 ml) </td><td></td></tr><tr><td> caldo de Luria Bertani </td><td> 12,5 </td></tr><tr><td> 1 M de MgCl2 (100 ml) </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 .6H 2 O </td><td> 20,33 </td></tr><tr&gt; <td> Solução A (para 200 ml) </td><td></td></tr><tr><td> MnCl 2 .4H 2 O </td><td> 0,395 </td></tr><tr><td> CaCl 2 .2H 2 O </td><td> 1,47 </td></tr><tr><td> 2- (N-morfolino) de hidrato de ácido etanossulfónico, ácido 4-Morpholineethanesulfonic (MES) </td><td> 0,4265 </td></tr><tr><td> Solução A + glicerol </td><td></td></tr><tr><td> 10 ml de solução A </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml de glicerol </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1: As soluções utilizadas neste estudo. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> cartilha </td><td> Seqüência </td></tr><tr><td> cpcC1C2leftfor </td><td> GTAC TCTAGA GCGGCTAAATGCTACGAC </td></tr><tr><td> CPCC1C2leftrev </td><td> GATC GGATCC GCGGTAATTGTTCCCTTTGA </td></tr><tr><td> cpcC1C2rightfor </td><td> GATC GAGCTC TGCACTGGTCAGTCGTTC </td></tr><tr><td> cpcC1C2rightrev </td><td> GACT GAATTC ATCGTTGCTTGAACGGTCTC </td></tr><tr><td> frente M13 </td><td> TGTAAAACGACGGCCAGT </td></tr><tr><td> reverso M13 </td><td> CAGGAAACAGCTATGAC </td></tr><tr><td> cpcC1C2for </td><td> GTTTTCATTGGCATCGGTCT </td></tr><tr><td> cpcC1C2rev </td><td> ATGTCCCAGGAACGACTGAC </td></tr><tr><td> A1173for </td><td> AGCAAACCGTTTTTGTGACC </td></tr><tr><td> A1173rev </td><td> TGCAAGGTGGCGAACTGTAT </td></tr></tbody></table> Tabela 2:. Os iniciadores utilizados em locais de endonucleases de restrição deste estudo encontram-se sublinhados.

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Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Introducing multiple genomic alterations into cyanobacteria is an essential tool in the development of strains for industrial and basic research purposes. We describe a system for generating unmarked mutants in the model cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC6803 and marked mutants in Synechococcus sp. PCC7002.

Geração de mutantes sem marcadores marcados e no modelo de cianobactérias da espécie

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

generation-marked-markerless-mutants-model-cyanobacterial

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.9K visualizações.  University of Cambridge. Introducing multiple genomic alterations into cyanobacteria is an essential tool in the development of strains for industrial and basic research purposes. We describe a system for generating unmarked mutants in the model cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC6803 and marked mutants in Synechococcus sp. PCC7002.

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Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

A mutagénese aleatória optogenetic Usando Histona-miniSOG em<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Genética

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

Alto Throughput Robotically Isolamento Assistida da temperatura sensível Lethal Mutantes em<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally identified by harnessing the competitions between amino acids and their analogs. However, this analog-based method is of low accuracy, and proper analogs for specific amino acids are limited. Here, we present an alternative strategy that enables an accurate, sensitive, and high-throughput screening of amino acid overproducers using rare-codon-rich markers. This strategy is inspired by the phenomenon of codon usage bias in protein translation, for which codons are categorized into common or rare ones based on their frequencies of occurrence in the coding DNA. The translation of rare codons depends on their corresponding rare transfer RNAs (tRNAs), which cannot be fully charged by the cognate amino acids under starvation. Theoretically, the rare tRNAs can be charged if there is a surplus of the amino acids after charging the synonymous common isoacceptors. Therefore, retarded translations caused by rare codons could be restored by feeding or intracellular overproductions of the corresponding amino acids. Under this assumption, a selection or screening system for identifying amino acid overproducers is established by replacing the common codons of the targeted amino acids with their synonymous rare alternatives in the antibiotic resistance genes or the genes encoding fluorescent or chromogenic proteins. We show that the protein expressions can be greatly hindered by the incorporation of rare codons and that the levels of proteins correlate positively with the amino acid concentrations. Using this system, overproducers of multiple amino acids can be readily screened out from mutation libraries. This rare-codon-based strategy only requires a single modified gene, and the host is less likely to escape the selection than in other methods. It offers an alternative approach for obtaining amino acid overproducers.

This study presents an alternative strategy to the conventional toxic analog-based method in identifying amino acid overproducers by using rare-codon-rich markers to achieve accuracy, sensitivity, and high-throughput simultaneously.

Identificando os produtores de aminoácidos com marcadores ricos em Codon raros

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Bioquímica

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of antibiotics and other secondary metabolites. Streptomyces coelicolor is a well-characterized, non-pathogenic species that is amenable to a variety of analyses in the lab. The phenotyping methods described here use S. coelicolor as a model streptomycete; however, the methods are applicable to all members of this large genus as well as some closely related actinomycetes. Phenotyping is necessary to characterize new species of Streptomyces identified in the environment, and it is also a vital first step in characterizing newly isolated mutant strains of Streptomyces. Proficiency in phenotyping is important for the many new researchers who are entering the field of Streptomyces research, which includes the study of bacterial development, cell division, chromosome segregation, and second messenger signaling. The recent crowdsourcing of antibiotic discovery through the isolation of new soil microbes has resulted in an increased need for training in phenotyping for instructors new to the field of Streptomyces research and their college or high school students. This manuscript describes methods for bacterial strain propagation, storage, and characterization through visual and microscopic examination. After reading this article, new researchers (microbiology education laboratories and citizen scientists) should be able to manipulate Streptomyces strains and begin visual characterization experiments.

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Here we present protocols for novice researchers to initiate phenotyping for the pharmacologically important bacterial genus Streptomyces.

Avaliação visual e microscópica de Streptomyces mutantes do desenvolvimento

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

Imunologia e Infecção

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. The non-replicative elementary body (EB) initiates infection of the host. Once inside, the EB differentiates into the reticulate body (RB). The RB then undergoes multiple rounds of replication, before differentiating back to the infectious EB form. This cycle is essential for chlamydial survival as failure to switch between cell types prevents either host invasion or replication.
Limitations in genetic techniques due to the obligate intracellular nature of Chlamydia have hampered identification of the molecular mechanisms involved in the cell-type development. We designed a novel dual promoter-reporter plasmid system that, in conjunction with live-cell microscopy, allows for the visualization of cell type switching in real time. To identify genes involved in the regulation of cell-type development, the live-cell promoter-reporter system was leveraged for the development of a forward genetic approach by combining chemical mutagenesis of the dual reporter strain, imaging and tracking of Chlamydia with altered developmental kinetics, followed by clonal isolation of mutants. This forward genetic workflow is a flexible tool that can be modified for directed interrogation into a wide range of genetic pathways.

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

This protocol utilizes fluorescent promoter-reporters, live-cell microscopy, and individual inclusion extraction in a directed forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants of Chlamydia trachomatis.

Abordagem genética de frente de células vivas para identificar e isolar mutantes do desenvolvimento em trachomatis de clamídia

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. ...

Integração gênica estável em Chlorella vulgaris usando Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Engineering of Green Microalgae, Chlorella vulgaris

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) serves as a widely employed tool for manipulating plant genomes. However, A. tumefaciens exhibit the capacity for gene transfer to a diverse array of species. Numerous microalgae species lack well-established methods for reliably integrating genes of interest into their nuclear genome. To harness the potential benefits of microalgal biotechnology, simple and efficient genome manipulation tools are crucial. Herein, an optimized AMT protocol is presented for the industrial microalgae species Chlorella vulgaris, utilizing the reporter green fluorescent protein (mGFP5) and the antibiotic resistance marker for Hygromycin B. Mutants are selected through plating on Tris-Acetate-Phosphate (TAP) media containing Hygromycin B and cefotaxime. Expression of mGFP5 is quantified via fluorescence after over ten generations of subculturing, indicating the stable transformation of the T-DNA cassette. This protocol allows for the reliable generation of multiple transgenic C. vulgaris colonies in under two weeks, employing the commercially available pCAMBIA1302 plant expression vector.

Autor em destaque: Protocolo de transformação otimizado para Chlorella vulgaris usando Agrobacterium tumefaciens 

This protocol outlines the utilization of Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) for integrating gene(s) of interest into the nuclear genome of the green microalgae Chlorella vulgaris, leading to the production of stable transformants.

Engenharia Genética Mediada por Agrobacterium tumefaciens de Microalgas Verdes, Chlorella vulgaris

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) serves as a widely employed tool for manipulating plant genomes. However, A. tumefaciens exhibit ...

Bioengenharia

Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans constitute a strain-specific barcode. The associated glycans show higher diversity in sugar composition and structure than those of eukaryotes and are important in bacterial-host recognition processes and interaction with the environment. In pathogenic bacteria, glycoproteins have been involved in different stages of the infectious process, and glycan modifications can interfere with specific functions of glycoproteins. However, despite the advances made in the understanding of glycan composition, structure, and biosynthesis pathways, understanding of the role of glycoproteins in pathogenicity or interaction with the environment remains very limited. Furthermore, in some bacteria, the enzymes required for protein glycosylation are shared with other polysaccharide biosynthetic pathways, such as lipopolysaccharide and capsule biosynthetic pathways. The functional importance of glycosylation has been elucidated in several bacteria through mutation of specific genes thought to be involved in the glycosylation process and the study of its impact on the expression of the target glycoprotein and the modifying glycan. Mesophilic Aeromonas have a single and O-glycosylated polar flagellum. Flagellar glycans show diversity in carbohydrate composition and chain length between Aeromonas strains. However, all strains analyzed to date show a pseudaminic acid derivative as the linking sugar that modifies serine or threonine residues. The pseudaminic acid derivative is required for polar flagella assembly, and its loss has an impact on adhesion, biofilm formation, and colonization. The protocol detailed in this article describes how the construction of null mutants can be used to understand the involvement of genes or genome regions containing putative glycosyltransferases in the biosynthesis of a flagellar glycan. This includes the potential to understand the function of the glycosyltransferases involved and the role of the glycan. This will be achieved by comparing the glycan deficient mutant to the wild-type strain.

Here, we describe the construction of null mutants of Aeromonas in specific glycosyltransferases or regions containing glycosyltransferases, the motility assays, and flagella purification performed to establish the involvement and function of their encoded enzymes in the biosynthesis of a glycan, as well as the role of this glycan in bacterial pathogenesis.

Geração de Mutantes Nulos para Elucidar o Papel das Glicosyltransferases Bacterianas na Motilidade Bacteriana

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

Monitoring Intraspecies Competition in a Bacterial Cell Population by Cocultivation of Fluorescently Labelled Strains

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a population always have accumulated mutations that are either detrimental or beneficial for the cell. If the fitness effect of a mutation provides the subpopulation with a strong selective growth advantage, the individuals of this subpopulation may rapidly outcompete and even completely eliminate their immediate fellows. Thus, small genetic changes and selection-driven accumulation of cells that have acquired beneficial mutations may lead to a complete shift of the genotype of a cell population. Here we present a procedure to monitor the rapid clonal expansion and elimination of beneficial and detrimental mutations, respectively, in a bacterial cell population over time by cocultivation of fluorescently labeled individuals of the Gram-positive model bacterium Bacillus subtilis. The method is easy to perform and very illustrative to display intraspecies competition among the individuals in a bacterial cell population.

Bacteria may accumulate either detrimental or beneficial mutations during their lifetime. In a population of cells individuals that have accumulated beneficial mutations may rapidly outcompete their fellows. Here we present a simple procedure to visualize intraspecies competition in a bacterial cell population over time using fluorescently labeled individuals.&#160;

Geração de mutantes sem marcadores marcados e no modelo de cianobactérias da espécie

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Geração de Mutantes Nulos para Elucidar o Papel das Glicosyltransferases Bacterianas na Motilidade Bacteriana

Monitorando a competição de subespécies em uma população de células bacterianas por cocultivação de cepas fluorescentes rotuladas