We thank Dr. Chao-Sheng Cheng at National Tsing Hua University, Taiwan, for performing the circular dichroism measurement. We also thank Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA, for providing the anti-HP-NAP monoclonal antibody. We appreciate Drs. Han-Wen Chang and Chung-Chu Chen at Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for providing advice for IRB application, Mr. Te-Lung Tsai at the Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for supervising the analysis of isolated neutrophils, and Ms. Ju-Chen Weng at National Tsing Hua University, Taiwan, for her technical assistance. This work was supported by grants from the Ministry of Science and Technology of Taiwan (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 and NSC98-2311-B-007-006-MY3), the Joint Research Program of National Tsing Hua University and Mackay Memorial Hospital (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1), and the research program of National Tsing Hua University (104N2052E1).

O sangue humano foi coletado de voluntários saudáveis ​​com o consentimento informado por escrito antes e aprovação do Conselho de Revisão Institucional da Universidade Nacional Tsing Hua, Hsinchu, Taiwan. 1. Expressão Recombinante de HP-PNA em E. coli <ol><li> Prepara-se o plasmídeo pET42a-PNA contendo a sequência de ADN de HP-NAP de H. pylori 26695 estirpe como descrito anteriormente 16. Prepare os plasmídeos contendo a sequência de ADN de HP-NAP com as mutações pontuais desejadas como descrito (ver protocolo, passo 8). </li><li> Transformar 10 ng dos plasmídeos de DNA acima referidas em E. coli BL21 (DE3) células competentes por choque térmico durante 45 segundos a 42 ° C, as células raia no caldo de lisogenia (LB) agar contendo 50 ug / ml de canamicina, e incubar as placas a 37 ° C durante 16 horas. </li><li> Inocular colónias individuais em tubos individuais contendo 5 ml de caldo de LB com 50 ug / ml de canamicina e crescem-los como pré-culturas em três7 ° C durante 16 horas com agitação a 170 rpm. </li><li> Inocular 2 ml de células de pré-cultura acima em 200 ml de caldo LB contendo 50 ug / ml de canamicina num balão de 1 L. Incubar o balão de cultura inoculado a 37 ° C durante 2 horas com agitação a 170 rpm até que a absorvância a 600 nm atingir aproximadamente 0,4-0,5 detectado por um UV / VIS. </li><li> Adicionar 80 ul de 1 M de isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) para a cultura acima, para uma concentração final de 0,4 mM para induzir a expressão de HP-NAP. Incubar a cultura durante 3 h até que a absorvância a 600 nm atingir aproximadamente 1,6-1,7. </li><li> Centrifugar as células a 6000 xg, a 4 ° C durante 15 minutos para remover o sobrenadante. Armazenar o sedimento de células à temperatura de -70 ° C até à purificação. </li></ol> 2. Preparação da fracção de proteína solúvel contendo HP-NAP Nota: Todos os passos seguintes são realizados a 4 ° C. <ol><li> Ressuspender 50 ml da célula pEllet preparado no protocolo passo 1.6 em 20 mL de Tris-HCl a 20, pH 9,0, NaCl 50 mM contendo 0,13 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 0,03 mM de N-alf a-tosil-L-lisinil-clorometilcetona (TLCK), e 0,03 mM de N-tosil-L-f enilalaninil-clorometilcetona (TPCK), a 4 ° C como previamente descrito 16. </li><li> À dissociação das células das bactérias fazendo passar a suspensão bacteriana por meio de um homogeneizador de alta pressão operado a uma gama de 15.000 a 20.000 psi durante 7 vezes a 4 ° C. </li><li> Centrifugar o lisado celular a 30000 x g a 4 ° C durante 1 h para separar as fracções proteicas solúveis e insolúveis usando uma ultracentrífuga. Transferir o sobrenadante como a fracção de proteína solúvel para uma proveta. </li><li> Medir a concentração de proteína da fracção da proteína solúvel pelo método de Bradford, utilizando um kit comercial, com albumina de soro de bovino (ASB) como o padrão de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Adicionar 177,6 mL de HCl 1 N em 20 ml de the fracção de proteína solúvel obtida a partir de 2,3 protocolo passo para ajustar o valor de pH a partir de pH 9,0 para pH 8,0. </li><li> Adicionar Tris-HCl a 20, pH 8,0, NaCl 50 mM à solução de proteína acima para fazer a concentração de proteína final seja 0,5 mg / ml. </li></ol> 3. A purificação do recombinante HP-NAP a partir de E. coli por Cromatografia Modo Batch Negativo com DEAE Resinas de permuta iónica <ol><li> Preparar 15 ml de resinas DEAE. <ol><li> Pesar 0,6 g de pó seco de resinas DEAE e suspendê-lo em 30 ml de Tris-HCl a 20, pH 8,0, NaCl 50 mM à temperatura ambiente durante pelo menos 1 dia. </li><li> Centrifugar a resina a 10.000 x g a 4 ° C durante 1 min. </li><li> Retirar e descartar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 15 ml de Tris-HCl a 20, pH 8,0, NaCl 50 mM. </li><li> Repita os passos Protocolo 3.1.2 a 3.1.4 quatro vezes mais. </li><li> Armazenar as 15 ml de resina assente (pasta a 50% em 30 ml de tampão de Tris) a 4 ° C para utilização subsequente. Nota: Todo o passo seguintes são realizados a 4 ° C. </li></ol></li><li> Adicionar 45 ml de as proteínas solúveis preparadas de protocolo passo 2,6-15 ml da resina e agita-se a pasta de proteína / resina com um agitador magnético a 4 ° C durante 1 h. </li><li> Verter a pasta de proteína / resina para uma coluna de plástico ou de vidro equipado com uma torneira de passagem. Permitir que a resina se contentar por gravidade. </li><li> Abrir a torneira para permitir que a solução de proteína para correr através da coluna por fluxo por gravidade até que o nível do líquido na coluna é um pouco acima da resina. Recolhe-se o fluxo de passagem como a fracção não ligada, que contém o HP-NAP purificada. </li><li> Adicionar 15 mL de gelo frio de 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl a 50 mM para a coluna. </li><li> Abrir a torneira para permitir que o tampão de lavagem para ser executado através da coluna por fluxo por gravidade até que o nível do líquido na coluna é um pouco acima da resina. Recolhe-se o fluxo de passagem como a fracção de lavagem. </li><li> Repita Protocolo passos 3.5 a 3.6 mais quatro vezes para recolher as fracções de lavagem adicionais. </li><li> Adicionar 15 mL de gelo frio de 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl a 1 M em uma coluna. </li><li> Abrir a torneira para permitir que o tampão de eluição de correr através da coluna por fluxo por gravidade até que o nível do líquido na coluna é um pouco acima da resina. Recolhe-se o fluxo de passagem como a fracção de eluição. </li><li> Repita os passos Protocolo de 3.8 a 3.9 mais quatro vezes para recolher as fracções de eluição adicionais. </li></ol> 4. Tampão do Exchange e endotoxina remoção do HP-NAP purificado por cromatografia Modo Batch Negativo com DEAE Resinas Nota: O purificada HP-NAP expressa em E. coli tem de ser sujeita a troca de tampão e a remoção de endotoxina antes de estimular os neutrófilos. <ol><li> Executar a diálise para mudar o tampão do HP-NAP purificada a solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (D-PBS), pH 7,2, a 4 ° C utilizando tubo de diálise com corte de peso molecular de 14 kDa, tal como previamente descrito 24. </li><li> Filtrar a HP-NAP dialisada através de uma syringe filtro com uma membrana carregada positivamente, hidrófila ligada a uma seringa descartável de 20 ml com caudais que vão de 2,5 a 4 ml / minuto a 4 ° C para remover a endotoxina. </li></ol> 5. Caracterização das propriedades moleculares do Purificada Recombinante HP-NAP por Sodium Dodecyl de poliacrilamida eletroforese em gel (SDS-PAGE), Western Blot, Native-PAGE, Gel Filtration Chromatography, e Dicroísmo Circular Spectroscopy <ol><li> Analisar o HP-NAP recombinante purificada por SDS-PAGE e Western blotting com sobrenadantes de cultura de hibridoma contendo anticorpo monoclonal de rato MAb 16F4 25 como previamente descrito 24. </li><li> Analisar o HP-NAP purificada por PAGE nativa e cromatografia de filtração em gel para examinar o seu estado oligomérico como descrito anteriormente 26. </li><li> Analisar o recombinante HP-NAP purificada por espectroscopia de dicroísmo circular para examinar a sua estrutura secundária, como anteriormente descrito 26. </li></ol> 6. Avaliação da Pureza de HP-NAP por coloração com prata de um gel de SDS-PAGE <ol><li> Preparar a solução de fixação, solução, solução de prata, a solução de desenvolvimento de sensibilização, solução de paragem, e a solução de lavagem de acordo com as instruções do fabricante de um kit de coloração com prata. </li><li> Realização da coloração de prata de um gel de SDS-PAGE de acordo com as instruções do fabricante de um kit de coloração com prata. </li><li> Obter a imagem do gel com um sistema de imagem. </li></ol> 7. Medição de ROS produção a partir de neutrófilos induzida por HP-NAP <ol><li> Isolar os neutrófilos humanos a partir de sangue humano heparinizado por sedimentação de dextrano seguido por centrifugação em gradiente de densidade, como previamente descrito 24. </li><li> Medição da produção de ROS por neutrófilos estimulados com HP-NAP usando um ensaio de quimioluminescência dependente de luminol. <ol><li> Ligar um leitor de placas e ajustar a temperatura a 37 ° C. coloque umplaca vazia de fundo plano de 96 poços branca dentro da câmara de leitor de placas, permitindo-a aquecer até 37 ° C. </li><li> Preparar as misturas de estímulo em D-PBS, pH 7,2, contendo 0,9 mM de CaCl 2, MgCl 2 0,5, e 13,3 uM de 5-amino-2,3-di-hidro-1,4-phthalazinedione (luminol), com a presença e ausência de 0,67 mM removido-endotoxina HP-NAP preparada a partir de protocolo passo 4.2. </li><li> Ajustar a concentração de neutrófilos humanos preparados a partir de protocolo passo 7.1 a 2 x 10 6 células / ml em D-PBS, pH 7,2, contendo 5 mM de glucose. </li><li> Adicionar 50 ul de suspensão de neutrófilos em cada cavidade de 96 poços enquanto o prato. </li><li> Adicionar 150 ul das misturas preparadas a partir de estímulo Protocolo passo 7.2.2 em neutrófilos bem contendo em um intervalo de tempo de 5 segundos por poço. </li><li> Medir a emissão da quimioluminescência durante 5 segundos por poço durante um período de três horas, utilizando um leitor de placas. </li></ol></li></ol> 8.Construção de DNA plasmídeos contendo HP-NAP Mutantes por Polymerase Chain Reaction (PCR) à base de mutagênese Site-direta Nota: mutagénese sítio-directa baseada em PCR foi gerado, basicamente, como descrito anteriormente 27, excepto que os locais de restrição &quot;silenciosas&quot; foram introduzidas para os iniciadores de mutagénese por mutagénese dirigida (SDM) de software -assist 28. <ol><li> Realizar a reacção de PCR. <ol><li> Adiciona-se 10 ng de plasmídeo pET42a-PNA, 1 | iM de pares iniciadores de mutagénese listados na Tabela 1, 200 uM de trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTPs), e 3 unidades de alta fidelidade-PCR mistura de enzima para um tubo de PCR contendo água desionizada, dando uma última volume de 25 ul. </li><li> Iniciar os ciclos de PCR a 95 ° C durante 10 minutos para desnaturar o ADN modelo, e seguir com 12 ciclos de amplificação a 95 ° C durante 1 minuto, a T m nenhum -5 ° C durante 1 minuto, e 72 ° C durante 6 min. </li><li> Terminar os ciclos de PCR comum passo de recozimento a T m pp -5 ° C durante 1 minuto e um passo de extensão a 72 ° C durante 30 min. </li></ol></li><li> Tratar 15 ul do produto de PCR com 0,4 ul de enzima de restrição Dpnl a 37 ° C durante 2 h e, em seguida, analisar 2 uL do produto de PCR Dpnl-tratada por electroforese em gel de agarose. </li><li> mutantes tela. <ol><li> Transformar 2 uL do produto de PCR em E. coli DH5a células competentes por choque térmico para 45 seg a 42 ° C. </li><li> Espalhe as células transformadas em uma placa de LB contendo 50 ug / ml de canamicina e Incubar a placa a 37 ° C durante 16 horas. </li><li> Isolar o ADN plasmídico a partir das colónias bacterianas utilizando um kit comercial de lise alcalina de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Tratar o DNA de plasmídeo isolado no passo 8.3.3 Protocolo com a enzima de restrição Xhol para verificar a presença das mutações silenciosas desejado de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> sequência doDNA do plasmídeo verificada por passo 8.3.4 Protocolo com o iniciador do promotor de T7 para confirmar a correcção das sequências de codificação mutantes de HP-NAP de acordo com o protocolo do fabricante. </li></ol></li></ol>

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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+one-step+site-directed+deletion,+insertion,+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol.">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC biotechnol. 8 (91), (2008).</li><li>Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDM-assist+software+to+design+site-directed+mutagenesis+primers+introducing+'silent'+restriction+sites.">SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing 'silent' restriction sites.</a> BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).</li></ol>

HWF and YCY are inventors of patents TW I 432579 and US 8,673,312 for the method of one-step purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. All materials described in the manuscript will be available for research purposes. The authors confirm that this does not alter their adherence to all of the JoVE's policies on sharing data and materials.

A cromatografia em lote modo negativo com resinas de permuta aniónica DEAE aqui apresentado é adequado para a purificação do recombinante HP-NAP sobre-expressos em E. coli. Os valores dos tampões utilizados nos passos de lise de células e purificação de pH são muito crítica para assegurar a solubilidade de HP-PNA em E. Os lisados ​​de E. coli e a separação eficiente de recombinante HP-NAP a partir de impurezas da célula hospedeira, respectivamente. As células bacterianas lisa...

Helicobacter pylori (H. pylori) é uma das principais causas de gastrite e úlcera péptica. Esta bactéria também foi classificado como cancerígeno em humanos pela Agência Internacional para Pesquisa sobre o Câncer, parte da Organização Mundial da Saúde, em 1994. Estima-se que a prevalência de H. pylori é de 70% nos países em desenvolvimento e 30-40% nos países industrializados 1. Mesmo que a taxa de infecção de H. pylori está diminuindo nos países industrializados, a taxa de infecção de H. pylori em países em desenvolvimento ainda é alto 2. O tratamento padrão para erradicar H. pylori consiste na administração de um inibidor da bomba de protões, IPP, e dois antibióticos, amoxicilina ou claritromicina mais metronidazole 3. No entanto, o aumento da resistência aos antibióticos em H. pylori relacionados com a terapia de úlcera insta o desenvolvimento de novas estratégias para prevenir oR curar a infecção. O desenvolvimento de vacina preventiva e / ou terapêutica contra o H. pylori pode proporcionar uma abordagem alternativa para controlar H. pylori. Helicobacter pylori proteína de activação de neutrófilos (HP-NAP), um importante fator de virulência do H. pylori, foi identificado pela primeira vez em extratos aquosos de H. pylori com a capacidade de activar os neutrófilos a aderir às células endoteliais e produzem espécies reactivas de oxigénio (ROS) 4. A infiltração de neutrófilos na mucosa gástrica encontrada em H. pylori pacientes infectados com gastrite ativa pode resultar em inflamação e danos nos tecidos do estômago. Assim, HP-PNA pode desempenhar um papel patológico através da activação de neutrófilos para induzir a inflamação gástrica, o que provoca ainda mais úlcera ou H. pylori -associated doenças gástricas. No entanto, HP-NAP é um candidato potencial para aplicações clínicas 5,6. Devido à pró imunogénica e imunomoduladorpriedades de HP-PNA, esta proteína pode ser utilizada para o desenvolvimento de vacinas, agentes terapêuticos, e ferramentas de diagnóstico. Um ensaio clínico foi conduzido para a utilização recombinante HP-NAP como um dos componentes de uma vacina contra a proteína H. pylori. Esta vacina consiste de recombinante HP-PNA, associado citotoxina-gene A (CagA), e proteínas citotoxina vacuolar A (VacA) formulado com hidróxido de alumínio e ainda tem sido demonstrado ser segura e imunogénica em humanos 7. Além disso, a HP-NAP actua como um potente imunomodulador para desencadear T auxiliar tipo 1 (Th1) -polarized respostas imunitárias para a terapia do cancro e 8 para regular negativamente as respostas imunitárias mediadas por Th2 provocadas por reacções alérgicas e infecções parasitárias 9,10. Como para o diagnóstico, com base ELISA-HP-NAP recombinante tem sido utilizada para a detecção de anticorpos séricos contra o HP-PNA em H. pylori pacientes infectados 11. Um estudo mostrou que o nível de anticorpos específicos de HP-NAP em soros de H. pyLori pacientes infectados com carcinoma gástrico foi significativamente mais elevada do que a partir de pacientes com gastrite crónica 12. Outro estudo também mostrou que os anticorpos séricos contra HP-PNA estão associados com a presença de não-cárdia adenocarcinoma gástrico 13. Assim, ELISA baseado em HP-NAP recombinante pode ser utilizada para a detecção de anticorpos séricos contra o HP-PNA para o prognóstico do cancro gástrico em H. pylori pacientes infectados. Tomados em conjunto, o HP-NAP purificada pode ser ainda utilizado para a prevenção, tratamento e prognóstico do H. pylori -associated doenças, bem como a terapia do cancro. Entre os vários métodos utilizados para a purificação do HP-NAP recombinante expressa em Escherichia coli (E. coli) na sua forma nativa relatados até agora, uma cromatograf ia de filtração em gel segundo passo de purificação envolvendo é necessária para se obter elevada pureza HP-NAP 14-16 . Aqui, um método utilizando a cromatografia modo descontínuo com negativodietilaminoetilo (DEAE) resinas de permuta iónica é descrito para a purificação do HP-PNA sobre-expresso em E. coli com elevado rendimento e elevada pureza. Esta técnica de purificação foi baseado na ligação de proteínas e / ou que não sejam HP-PNA para a resina de impurezas da célula hospedeira. A pH 8,0, quase sem outras proteínas, exceto HP-NAP são recuperados a partir da fracção livre. Esta abordagem purificação utilizando cromatografia de troca iônica DEAE no modo negativo é simples e economia de tempo, permitindo a purificação do recombinante HP-NAP através de cromatografia de uma etapa, através da recolha da fracção livre. Além de HP-PNA, várias outras biomoléculas, tais como vírus 17, Imunoglobulina G (IgG) 18, hemoglobina 19, fosfatase de proteína 20, e factor de virulência flagelina 21, também tem sido relatado para ser purificado por cromatografia de permuta iónica em negativo modo. O modo negativo é o preferido para a cromatografia de permuta iónica se as impurezas são o menorcomponentes presentes na amostra submetida a ser purificada 22. A aplicação de cromatografia negativa em purificação de biomoléculas naturais ou recombinantes foi recentemente revista 23. O presente relatório fornece um passo a passo de protocolo para a expressão de recombinante HP-NAP em E. coli, a lise das células, e a purificação do HP-PNA utilizando cromatografia lote modo negativo com resinas de permuta iónica em DEAE. Se uma proteína desejada para a purificação é adequada para cromatografia de permuta iónica em modo negativo, o protocolo descrito também pode ser adaptado como um ponto de partida para o desenvolvimento de um processo de purificação.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET42a-NAP&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>prepared as described in Supplementary data of Refernce 15&#160; 
			http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21 (DE3)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>C6000-03</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>MD Biomedical Inc</td>
			<td>101-367-93-1</td>
			<td>http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&#38;supplier=search&#38;name =IPTG%20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td>protease inhibitor 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7254</td>
			<td>protease inhibitor 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4376</td>
			<td>protease inhibitor 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad protein assay dye reagent concentrate</td>
			<td>Bio&#8208;Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>for protein quantitation 
			http://www.bio-rad.com/en-us/sku/5000006-bio-rad-protein-assay-dye-reagent-concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein standard (bovine serum albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5619&#160;</td>
			<td>a standard protein for Bio-Rad Protein Assay 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEAE&#8211;Sephadex &#160;A-25 chloride form</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A25120</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum/Por dialysis tubing</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132720</td>
			<td>with molecular weight cutoff of 14 kDa 
			http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc&#174; units with Mustang&#174; E membrane</td>
			<td>Pall</td>
			<td>MSTG25E3</td>
			<td>for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min 
			http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal antibody MAb 16F4</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23;&#160; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA 
			http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28989335</td>
			<td>for gel filtration chromatography 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlusOne silver staining kit, protein</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-1150-01</td>
			<td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>for density gradient centrifugation to purify human neutrophils 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom 96-well white plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>236108</td>
			<td>http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8511</td>
			<td>protected from light 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expand &#160;long template PCR system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11681834001</td>
			<td>source of High Fidelity PCR enzyme mix 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dpn I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176S</td>
			<td>https://www.neb.com/products/r0176-dpni</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xho I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td>https://www.neb.com/products/r0146-xhoi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli DH5&#945;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>18265-017</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Product Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td> 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>out of market and upgraded to a new model 
			http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer</td>
			<td>Avestin Inc</td>
			<td>C315320</td>
			<td>http://www.avestin.com/English/c3page.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge</td>
			<td>Hitachi Koki Co</td>
			<td>90106401</td>
			<td>for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates 
			http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>18-1900-26</td>
			<td>for gel filtration chromatography 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aviv model 62ADS CD spectrophotometer</td>
			<td>Aviv Biomedical</td>
			<td>N/A</td>
			<td>out of market and upgraded to a new model 
			http://www.avivbiomedical.com/circular.php</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-3000 imaging system</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>N/A</td>
			<td>discontinued and replaced 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>1420-018</td>
			<td>for chemiluminescence detection 
			http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-step negative chromatographic purification of helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in escherichia coli in batch mode

Helicobacter pylori proteína de activação de neutrófilos (HP-NAP) é um importante fator de virulência de Helicobacter pylori (H. pylori). Ela desempenha um papel crítico em H. pylori induzida por inflamação gástrica, activando vários leucócitos inatas, incluindo neutrófilos, monócitos, mastócitos e células. As propriedades imunogênicas e imunomoduladores da HP-NAP torná-lo um candidato potencial de diagnóstico e vacinas para H. pylori e uma nova droga candidatos para a terapia do cancro. A fim de obter quantidades substanciais de HP-NAP purificada utilizada para as suas aplicações clínicas, um método eficiente para purificar esta proteína com elevado rendimento e grau de pureza deve ser estabelecida. Neste protocolo, nós descrevemos um processo para um passo de purificação cromatográfica negativa recombinante de HP-PNA sobre-expresso em Escherichia coli (E. coli) usando dietilaminoetilo resinas de permuta iónica (DEAE) (por ex., Sephadex) iModo lote n. Recombinante HP-NAP constitui quase 70% do total de proteínas em E. coli e é quase totalmente recuperada na fracção solúvel após a lise celular, a pH 9,0. Sob a condição óptima a pH 8,0, a maioria dos HP-NAP é recuperada na fracção não ligada enquanto as proteínas endógenas da E. coli são eficientemente removida pela resina. Este método de purificação utilizando cromatograf ia em lotes modo negativo com resinas de permuta iónica em DEAE produz funcional HP-NAP a partir de E. coli, na sua forma nativa com elevado rendimento e pureza. A HP-NAP purificada pode ser ainda utilizado para a prevenção, tratamento e prognóstico do H. pylori -associated doenças, bem como a terapia do cancro.

O diagrama esquemático do processo experimental de purificação negativa recombinante de HP-NAP expressa em E. coli, usando resinas de permuta iónica em DEAE em modo de lote é mostrado na Figura 1. Esta técnica de purificação é baseado na ligação de proteínas e / ou que não sejam HP-PNA para a resina de impurezas da célula hospedeira. A pH 8,0, quase sem outras proteínas, exceto HP-NAP na sua forma nativa são recuperados a partir da fracção não...

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One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Um método de alto rendimento para um passo de purificação negativa recombinante de Helicobacter pylori proteína activadora de neutrófilos (NAP-HP) sobre-expresso em Escherichia coli usando resinas dietilaminoetilo no modo de lote é descrito. HP-NAP purificada por este método é benéfico para o desenvolvimento de vacinas, medicamentos, ou diagnóstico de H. pylori -associated doenças.

Um passo de purificação cromatográfica de Negativo<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrófilos-proteína de activação sobre-expresso em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Em Modo Batch

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

one-step-negative-chromatographic-purification-helicobacter-pylori

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

9.6K visualizações.  National Tsing Hua University.  Um método de alto rendimento para um passo de purificação negativa recombinante de Helicobacter pylori proteína activadora de neutrófilos (NAP-HP) sobre-expresso em Escherichia coli usando resinas dietilaminoetilo no modo de lote é descrito. HP-NAP purificada por este método é benéfico para o desenvolvimento de vacinas, medicamentos, ou diagnóstico de H. pylori -associated doenças. 

Vídeo: One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

Rápida identificação de bactérias gram-negativas de Sangue Cultura Caldo Usando MALDI-TOF Espectrometria de Massa

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Imunologia e Infecção

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

Modelo não-invasiva da neuropatogênicos<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Infecção no Rato Neonatal

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide3. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the &#8220;pilus&#8221;5. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

Alta resolução de Microscopia Eletrônica da<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Cag Tipo IV Secreção Sistema Pili Produzido em diferentes condições de Ferro Disponibilidade

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

Deteção de colonização Enterohemorrhagic Escherichia Coli murino Host pelo sistema não-invasivo na Vivo bioluminescência

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

Criação de um denso Transposon inserção biblioteca usando bacteriana conjugação em entérobactérienne cepas tais como Escherichia Coli ou Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Sobreexpressão e purificação do ser humano<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferase em<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. Among them, reversible lysine acetylation is one of the most widely distributed in all domains of life. Although numerous mass spectrometry-based acetylome studies have been performed, further characterization of these putative acetylation targets has been limited. One possible reason is that it is difficult to generate purely acetylated proteins at desired positions by most classic biochemical approaches. To overcome this challenge, the genetic code expansion technique has been applied to use the pair of an engineered pyrrolysyl-tRNA synthetase variant, and its cognate tRNA from Methanosarcinaceae species, to direct the cotranslational incorporation of acetyllysine at the specific site in the protein of interest. After first application in the study of histone acetylation, this approach has facilitated acetylation studies on a variety of proteins. In this work, we demonstrated a facile protocol to produce site-specifically acetylated proteins by using the model bacterium Escherichia coli as the host. Malate dehydrogenase was used as a demonstration example in this work.

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Genetic code expansion serves as a powerful tool to study a wide range of biological processes, including protein acetylation. Here we demonstrate a facile protocol to exploit this technique for generating homogeneously acetylated proteins at specific sites in Escherichia coli cells.

Um protocolo Facile para gerar proteínas Site-Specifically acetiladas em Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research is deciphering how these dynamic protein complexes act to integrate signals from multiple sources in order to direct a specific biological response, and how this becomes deregulated in many disease settings. Despite the importance of this key biochemical mechanism, there is a lack of experimental techniques that can facilitate the specific and sensitive deconvolution of these multi-molecular signaling complexes.
Here this shortcoming is addressed through the combination of a protein complementation assay with a conformation-specific nanobody, which we have termed Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel technique facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any pair of interacting proteins, to the exclusion of un-complexed individual proteins and complexes formed with competing binding partners. 
The BiCAP technique is adaptable to a wide array of downstream experimental assays, and the high degree of specificity afforded by this technique allows more nuanced investigations into the mechanics of protein complex assembly than is currently possible using standard affinity purification techniques.

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

This manuscript describes the protocol for Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel method facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any two interacting proteins, while excluding un-complexed individual proteins as well as complexes formed with competing binding partners.

Dissecando a proteínas multi sinalização complexos pela purificação da afinidade de complementação Bimolecular (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a pET-SUMO-EGFP vector (SUMO = small ubiquitin-like modifier) and expressing enhanced green fluorescence protein (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). EGFP-expressing E. coli is coincubated with macrophages for 1 h at 37 &#176;C; the negative control group is incubated on ice for the same amount of time. Then, the macrophages are ready for assessment. The advantages of this technique include its simple and straightforward steps, and phagocytosis can be measured by both flow cytometer and fluorescence microscope. The EGFP-expressing E. coli are stable and display a strong fluorescence signal even after the macrophages are fixed with paraformaldehyde. This method is not only suitable for the assessment of macrophage cell lines or primary macrophages in vitro but also suitable for the evaluation of granulocyte and monocyte phagocytosis in peripheral blood mononuclear cells. The results show that the phagocytic capability of peritoneal macrophages from young (eight-week-old) mice is higher than that of macrophages from aged (16-month-old) mice. In summary, this method measures macrophage phagocytosis and is suitable for studying the innate immune system function.

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Here, we present a protocol to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis using enhanced green fluorescence protein-expressing Escherichia coli.

Usando avançada proteína de fluorescência verde-expressando Escherichia Coli para avaliar a fagocitose de macrófagos peritoneais de Mouse

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has been disrupted. Loss of function following gene disruption is subsequently restored by exogenous addition of the product of the disrupted gene. This helps to determine the function of the gene. A method previously described involves generating a gtfC gene-disrupted Streptococcus mutans strain. Here, an undemanding method is described for purifying the gtfC gene product from the newly generated S. mutans strain following the gene disruption. It involves the addition of a polyhistidine-coding sequence at the 3&#8242; end of the gene of interest, which allows simple purification of the gene product using immobilized metal affinity chromatography. No enzymatic reactions other than PCR are required for the genetic modification in this method. The restoration of the gene product by exogenous addition after gene disruption is an efficient method for determining gene function, which may also be adapted to different species.

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Described here is a simple method for the purification of a gene product in Streptococcus mutans. This technique may be advantageous in the purification of proteins, especially membrane proteins and high molecular mass proteins, and can be used with various other bacterial species.

Purificação de uma proteína de massa molecular elevada em Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...