O polifosfato inorgânico é um elemento-chave na resposta ao estresse bacteriano. Mas os métodos mais antigos para extrair e medir o pólipo em bactérias são complexos e intensivos em mão-de-obra. A principal vantagem desta técnica é que ela permite quantificação rápida, sensível e barata dos níveis de pólipo em uma variedade de diferentes espécies bacterianas.
O procedimento será demonstrado por Arya Pokhrel, uma estudante de graduação do meu laboratório. Para começar, cresça bactérias lactobacillus reuteri em meio de indução de enzimas malic sem cistina a 37 graus celsius durante a noite sem tremer. Centrifugar um mililitro desta cultura durante a noite em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para colher células suficientes para produzir um total de 50 a 100 microgramas de proteína celular.
Remova o supernascer da pelota celular completamente e adicione 250 microliters gitc lysis buffer e resuspend por vórtice. Incubar a 95 graus celsius por 10 minutos para lise as células. Armazene o lysate a 80 graus celsius.
Primeiro, prepare os padrões BSA contendo zero, 1, 2 e 4 miligramas por mililitro de BSA no buffer de lise GITC. Aliquot cinco microliters de lisatos de células bem mistas e cinco microliters de padrões BSA para separar poços em uma placa clara de 96 poços. Adicione 195 microliters de reagente bradford a cada poço e meça absorvância em 595 nanômetros em um leitor de placas.
Calcule a quantidade de proteína em cada poço em comparação com a curva padrão BSA, conforme descrito no manuscrito. Para determinar a quantidade total de proteína em cada amostra, multiplique o valor resultante por 05. Para iniciar a extração de polifosfato, adicione 250 microlitadores de 95% de etanol a cada amostra de linfose e vórtice de GITC para misturar.
Pipeta esta mistura a uma coluna de rotação de membrana de sílica colocada em um tubo centrífuga de 1,5 mililitro. Centrífuga a 16, 100 g por 30 segundos. Descarte o fluxo através e adicione 750 microlitradores do tris-cloridrato, cloreto de sódio, EDTA e mistura de etanol.
Centrífuga a 16, 100 gs por 30 segundos. Descarte o fluxo através e centrifugar a coluna de giro a 16, 100 gs por dois minutos. Coloque a coluna em um tubo de microfuça de 1,5 mililitro limpo.
Adicione 150 microlitres de 50 mililitros pH oito tris-cloridrato, e incubar em temperatura ambiente por cinco minutos. Elute polyP por centrifugação a 8.000 g por dois minutos. Comece por preparar padrões contendo zero, cinco, 50 ou 200 fosfato de potássio micromolar em 50 mililitros pH oito tris-cloridrato.
Alíquota de 100 microlitadores de cada padrão fosfato e 100 microliters de amostras de pólipo extraídas em poços separados de uma placa clara de 96 poços. Prepare uma mistura mestre contendo, por amostra, 30 microliters de 5X ScPPX tampão de reação, 19 microliters de água e um microliter de ScPPX purificado. Adicione 50 microliters da mistura mestre a cada poço da placa de 96 poços.
E incubar por 15 minutos a 37 graus celsius. No dia da detecção, prepare um novo estoque de solução de detecção misturando-se a 9,12 mililitros de base de solução de detecção com 88 mililitros de um ácido ascórbico molar, e permita que ele chegue à temperatura ambiente antes do uso. Adicione 50 microliters de solução de detecção a cada amostra e padrões na placa de 96 poços.
Para permitir o desenvolvimento de cores, incubar a placa em temperatura ambiente por aproximadamente dois minutos. Use um leitor de placas para medir a absorvância em 882 nanômetros e calcular a concentração de fosfato de cada amostra em comparação com a curva padrão fosfato de potássio. Em seguida, converta as concentrações de fosfato em nanomoles de fosfato derivado de pólipo em cada célula lysate e normalize o teor de pólipo celular em proteína celular total, como descrito no manuscrito.
E.coli, uma bactéria gram-negativa, cultivada em LB não produziu pólipo. Mas quando cultivado em MOPS, produziu cerca de 192 nanomoles de pólipo por miligrama de proteína total. Um mutante E.coli delta ppk, que não tem quinase polip, não produziu pólipo em nenhum dos meios.
Um mutante delta ppx, que não tem exopolyfosphatase, produziu aproximadamente a mesma quantidade de pólipo que o tipo selvagem. E o mutante delta phoB, que é defeituoso no transporte de fosfato, produziu significativamente menos pólipo do que o tipo selvagem. L.reuteri tipo selvagem, uma bactéria gram-positiva cultivada durante a noite no meio MEIC acumulou cerca de 51 nanomoles de pólipo por miligrama de proteína total.
Um mutante nulo L.reuteri ppk1 sem quinase polip continha menos da metade dessa quantidade. Esta presença de pólipo no mutante nulo ppk1 é provavelmente devido a L.reuteri contendo uma segunda quinase polip. Mycobacterium smegmatis strain SMR five, cultivado em Hartmans-de Bont médio na ausência de etanol acumulado cerca de 141 nanomoles pólipos por miligrama de proteína total.
Enquanto o tratamento do etanol resultou em um aumento triplo. Após este procedimento, a eletroforese de gel de acrilamida pode ser realizada para avaliar diferenças no comprimento da cadeia de pólipo. Ao tentar este procedimento, evite erros comuns.
Lembre-se de evitar obter bolhas em poços de placas de microtáticos, e tenha cuidado para transferir suas amostras para o tubo apropriado ao mudar da coluna para o tubo de microfuge. Não se esqueça que trabalhar com GITC e ácidos fortes pode ser perigoso, e equipamentos de proteção adequados devem ser sempre usados durante a realização deste procedimento.
