Um sistema econômico e versátil de purificação de proteínas de alto rendimento usando um adaptador de placa de várias colunas. Oi, a purificação de proteínas é imprescindível para o estudo da estrutura e função proteica. E geralmente é usado em combinação com técnicas biofísicas.
Isso é especialmente importante na era da proteômica funcional que requerem uma produção de proteína de alto rendimento. Temos a hipótese de que um adaptador de placa de várias colunas, o MCPA, pode interagir múltiplas colunas de cromatografia de diferentes resinas com placas multi-poço para purificação paralela. Com este adaptador, desenvolvemos um método econômico e versátil de purificação de proteínas que pode ser usado sob a gravidade ou vácuo rival na velocidade de um sistema automatizado.
Aqui mostramos este método para cromatografia de afinidade de níquel e cromatografia de troca de íons. Monte o MCPA colocando um tapete de vedação perfurado em uma placa de gotejamento longo e, em seguida, insira o número desejado de colunas nos orifícios do tapete de vedação. Coloque uma placa de coleta aberta na base do coletor e feche com a parte superior do coletor.
Anexar tubos e colocar o MCPA montado com colunas na parte superior. Pipet 1,2 mil da solução níquel-NTA nas colunas. Durante a pipetação, certifique-se de que as contas permaneçam totalmente misturadas.
Ligue a bomba e passe o etanol de 20% através das colunas e na placa de coleta abaixo. Desligue a bomba assim que o líquido estiver atravessado. Descarte o conteúdo da placa de coleta em uma caixa de lixo.
Adicione três volumes de resina de tampão EDTA a todas as colunas. Ligue a bomba e passe o líquido. Agora lave as colunas com três volumes de resina de 0,5 amortecedor de hidróxido de sódio molar.
Lave as colunas com quatro volumes de resina de 100 mililitros de níquel sulfato, depois 10 volumes de resina de água Mili-Q. Se uma coluna estiver mais lenta, empurre o líquido através do êmbolo da seringa. Despeje o conteúdo das placas de coleta em uma caixa de lixo.
Em seguida, lave as colunas duas vezes com quatro volumes de resina de 10 milimidazols e esvazie as placas de coleta. Se várias amostras estiverem sendo purificadas, substitua as placas de coleta abertas por uma placa de 48 poços. Com o vácuo desligado, carregue os lises nas colunas.
Use um agitador de plástico fino para misturar suavemente as contas e os lises na coluna para maximizar a ligação. Ligue a bomba e passe o líquido. Se uma coluna ficar bloqueada, transfira a mistura de resina lysate para uma coluna com um filtro fresco.
Congele as placas de coleta para conter seu fluxo. Substituído por uma placa de coleta aberta e, em seguida, lave as colunas com nove volumes de resina de 10 milimidazole tampão de lavagem. Repita este passo quatro ou cinco vezes.
Para evitar o transbordamento, esvazie periodicamente as placas de resíduo. Substitua as placas de coleta abertas por uma placa de 96 poços, garantindo que a A1 esteja no canto superior esquerdo. Volume de resina pipeta de tampão de eluição desnaturing nas colunas.
Passe o líquido e verifique a placa de coleta para garantir que não haja contaminação entre os poços. Para a próxima diluição, repita as etapas anteriores e colete em uma placa de coleta fresca. Tome uma alíquota de 50 microliter de cada eluição para a análise de pureza e concentração.
Em seguida, lave as colunas com dois mililitros de 20% de etanol. Adicione mais dois mil de 20% de etanol às colunas e use o agitador de plástico fino fresco para misturar as contas no etanol antes de transferir para um tubo de 50 mil para armazenamento a quatro graus Celsius. Monte o MCPA em coletor de vácuo com uma placa de coleta aberta e êmbolos de seringa em todas as colunas.
Remova todos os êmbolos de seringa da primeira fila. Remova a junta de borracha de um êmbolo de cinco mil seringas e, em seguida, fure um buraco no centro. Em seguida, empurre a parte inferior de uma coluna aberta através da junta de borracha perfurada.
Repita estas etapas e insira na primeira fila de colunas. Certifique-se de que as contas de sepharose Q estão totalmente misturadas. E com a ponta de pipeta azul que é cortada a dois centímetros da parte inferior, pipet 800 microliters do Q sepharose contas nas colunas abertas.
Uma vez que as contas tenham se acomodado na parte inferior das colunas, ligue a bomba de vácuo o suficiente para passar o etanol de 20%. Lave as colunas duas vezes com dois mil de 10 mililitros Tris. Desligue a bomba pouco antes do tampão Tris passar para evitar que a resina seque.
O escoamento pode ser descartado e substituir por uma placa de coleta de 48 poços. Transfira todas as amostras para serem purificadas para as colunas Q Sepharose na primeira linha e use um agitador de plástico fino para misturar as amostras e as contas por cerca de dois minutos antes de ligar a bomba de vácuo. Armazene ou congele seu fluxo para análise posterior.
Com uma placa de coleta aberta, lave as colunas duas vezes com dois mil de 10 mililitros Tris. Substitua as placas de coleta abertas com a placa de 96 poços. A primeira fração de elução pode ser coletada na primeira linha ou na segunda linha.
Para eluto na segunda linha, remova os êmbolos de seringa dessas posições. Mova as colunas Q Sepharose para essas posições e, em seguida, coloque os êmbolos de seringa nas colunas abertas na primeira linha. Pipet um mililitro das primeiras concentrações de sal nas colunas Q Sepharose.
Ligue a bomba e colete a elução. Para coletar a próxima eluição, remova os desênques de seringa das próximas posições, mova as colunas Q Sepharose para essas posições e, em seguida, substitua os êmbolos nas posições anteriores. Repita estes passos para cada concentração de sal sucessiva usada para eluto.
Certifique-se de que uma nova placa de coleta seja usada para cada quatro eluções e que cada placa seja rotulada e armazenada. Com placas de coleta abertas, lave as colunas com dois mil de quatro cloretos de sódio molar, 10 mililitros Tris. Pipetar dois mil de 20% de etanol e passar por isso até que ele esteja logo acima das contas e, em seguida, selar as colunas para armazenamento.
Como exemplo, o MCPA conseguiu purificar com sucesso 14 mutantes AbpSH3 em condições de desnaturação por um níquel-NTA. Um pequeno contaminante pode ser visto a 25 kilodaltons, embora a proteína ainda seja em grande parte pura. Os pequenos contaminantes vistos em condições de desnaturação são removidos em condições nativas.
Isso foi mostrado quando 11 diferentes domínios SH3 foram purificados. Isso mostra que o MCPA pode ser usado para comparação das condições de purificação. O AbpSH3 pode ser separado da maioria dos contaminantes através da purificação da troca de íons a partir de lises.
Bons rendimentos de proteína AbpSH3 consideravelmente pura foram recuperados com vários contaminantes de pesos moleculares mais elevados. A purificação de amostras pós-níquel-NTA utilizando a troca de íons com o MCPA removeu com sucesso esses contaminantes de alto peso. Embora ainda haja uma ligeira contaminação, as frações ainda são em grande parte puras e produziram bons dados biofísicos usando ensaios de NMR e desnaturação química térmica.
Em conclusão, nossos resultados mostram que nossa hipótese está correta e que o MCPA pode purificar com sucesso quantidades de miligramas de proteínas usando diferentes técnicas de cromatografia. O sistema MCPA pode ser configurado de várias maneiras dentro das mesmas corridas para otimizar as condições de purificação. A configuração é simples, barata e fácil de treinar usuários inexperientes, especialmente em laboratórios que não purificam rotineiramente proteínas.
